胃腸道間質(zhì)瘤中LMTK3、caspase 3及caspase 7的表達(dá)意義①

王世超 成元華 張艷慧 張亞娟 （貴州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550004）

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是起源于 Cajal 間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Cajal，ICC）的一種間葉源性腫瘤，具有不同的惡性潛能，可發(fā)生于胃腸道任何部位，好發(fā)于胃和小腸，其次為結(jié)、直腸，也可發(fā)生于腹腔內(nèi)［1］。超過(guò)80%的GIST由KIT 基因或血小板源性生長(zhǎng)因子受體α（plateletderived growth factor receptor alpha，PDGFRA）基因突變引起，而缺乏KIT/PDGFRA 基因突變的GIST 僅占10%～15%［2］。目前，對(duì)于GIST 的靶向治療是以KIT/PDGFRA 活性為靶點(diǎn)，酪氨酸激酶抑制劑甲磺酸伊馬替尼作為其靶向治療藥物已在臨床廣泛應(yīng)用［3］。

狐猴酪氨酸激酶3（lemur tyrosine kinase 3，LMTK3）為絲氨酸-蘇氨酸-酪氨酸激酶家族成員之一，該家族包括3 個(gè)亞型，分別為：LMTK1、LMTK2及LMTK3，主要參與細(xì)胞的分化及凋亡。其中，LMTK3 作為近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)蛋白，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［4］。細(xì)胞凋亡失調(diào)是某些腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）家族是凋亡過(guò)程的重要參與者，其中caspase 2、caspase 8、caspase 9 及 caspase 10 是凋亡過(guò)程的啟動(dòng)因子，caspase 3 和caspase 7 則是凋亡過(guò)程的重要執(zhí)行者。許多腫瘤的治療方法都間接影響caspase的活性從而激活凋亡途徑，進(jìn)而清除腫瘤細(xì)胞［5-6］；同時(shí)，LMTK3 對(duì)于 KIT 基因突變型 GIST 中KIT 基因的表達(dá)至關(guān)重要［7］。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道：在KIT基因突變型GIST 細(xì)胞系中LMTK3 具有正向調(diào)控KIT 蛋白表達(dá)的作用，從而促進(jìn)GIST 細(xì)胞系增殖和生長(zhǎng)［8］；LMTK3 基因沉默導(dǎo)致 caspase 3 和 caspase 7活性顯著增加，從而促進(jìn)KIT 基因突變型細(xì)胞系的凋亡增加。本研究通過(guò)檢測(cè)GIST 中LMTK3、caspase 3 及 caspase 7 蛋白的表達(dá)情況，探討這 3 種蛋白表達(dá)與該腫瘤臨床病理特征的關(guān)系，為臨床準(zhǔn)確評(píng)估GIST的預(yù)后和靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料 收集 2014 年 9 月至 2018 年 9 月期間貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科已確診的GIST 患者的蠟塊共102 例，其中具有腫瘤旁正常組織77 例，無(wú)腫瘤的切緣組織3 例；男性42 例，女性60 例；年齡29～83 歲，中位年齡 54 歲；≤54 歲者 46 例，＞54 歲者56 例；腫瘤發(fā)生于胃69 例、腸道30 例及胃腸道外3 例；極低危險(xiǎn)度23 例、低危險(xiǎn)度28 例、中危險(xiǎn)度20例及高危險(xiǎn)度31例。

1.2 方法 采用免疫組化EnVision 二步法。石蠟包埋組織連續(xù)切片，厚4 μm；所用一抗包括：LMTK3多克隆抗體（Gene tex，1∶300）、caspase 3多克隆抗體（萬(wàn)類(lèi)生物公司，1∶500）及 caspase 7 多克隆抗體（Affinity 生物公司，1∶70）；三者均用EDTA（pH9.0）溶液進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)5 min；嚴(yán)格按照常規(guī)免疫組織化學(xué)方法染色，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，PBS代替一抗作為空白對(duì)照。LMTK3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，caspase 3和caspase 7蛋白的陽(yáng)性表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)。

判讀標(biāo)準(zhǔn)：每一張切片選取5 個(gè)高倍視野進(jìn)行觀察，采用雙盲半定量法進(jìn)行評(píng)分。①按染色強(qiáng)度評(píng)分：不著色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3分；②按著色細(xì)胞百分比計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為0 分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)6%～25%為1 分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)26%～50%為2 分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥51%為3 分。最終得分為①②兩種評(píng)分相乘，總分0分計(jì)為陰性，1～2 分計(jì)為弱陽(yáng)性，3～6 分計(jì)為陽(yáng)性，7～9 分計(jì)為強(qiáng)陽(yáng)性；總分＜4 分視為低表達(dá)，總分≥4 分視為高表達(dá)［9］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用秩和檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析法。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LMTK3、caspase 3 及 caspase 7 蛋白在 GIST 腫瘤組織及正常組織中的表達(dá)情況 LMTK3 蛋白表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，正常組織高表達(dá)22 例，低表達(dá)58 例；在GIST 腫瘤組織高表達(dá)55 例，低表達(dá)47 例。LMTK3 在GIST 腫瘤組織中表達(dá)高于相應(yīng)正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖 1A、B）。caspase 3 蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，正常組織低表達(dá)14 例，高表達(dá) 66 例；GIST 腫瘤組織低表達(dá) 79 例，高表達(dá)23 例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1C、D）。caspase 7 蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，正常組織中低表達(dá)25 例，高表達(dá) 55 例；GIST 腫瘤組織中低表達(dá) 95 例，高表達(dá)7例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1E、F）。

圖1 GIST 腫瘤組織及正常組織中LMTK3、caspase 3 及caspase 7蛋白的表達(dá)情況Fig.1 Expressions of LMTK3，caspase 3 and caspase 7 protein in GIST tumor tissues and corresponding normal tissues

2.2 GIST 中 LMTK3、caspase 3 及 caspase 7 的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 LMTK3 蛋白在腫瘤直徑＞5 cm 組中表達(dá)水平高于≤5 cm 組（P＜0.05）；核分裂像＞5/50 HPF組中表達(dá)水平高于核分裂像≤5/50 HPF組（P＜0.05）；在中、高危險(xiǎn)度分組中表達(dá)水平高于在極低和低危險(xiǎn)度分組（P＜0.05）；LMTK3蛋白的表達(dá)在不同性別、年齡及腫瘤發(fā)生部位組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。caspase 3 和caspase 7蛋白在不同的腫瘤直徑、核分裂象、腫瘤發(fā)生部位、危險(xiǎn)度分級(jí)、年齡及性別組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 GIST中LMTK3、caspase 3及caspase 7與GIST臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between expression level of LMTK3，caspase 3 and caspase 7 in GIST tumor tissues and clinicopathologic characteristics of GIST

2.3 LMTK3 蛋白表達(dá)與 caspase 3 及 caspase 7 蛋白表達(dá)的關(guān)系 在GIST 腫瘤組織中LMTK3 蛋白表達(dá)與caspase 3 及caspase 7 蛋白表達(dá)之間均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。

2.4 LMTK3 蛋白表達(dá)與GIST 患者預(yù)后的關(guān)系102例GIST患者中獲訪72例，隨訪時(shí)間24～72個(gè)月。死亡病例5 例，其中1 例因合并胃癌去世，4 例因GIST去世。在死亡病例中，4例LMTK3呈高表達(dá)，1例呈低表達(dá)。1例復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，該例LMTK3呈高表達(dá)。

3 討論

GIST 是胃腸道中最常見(jiàn)的間葉源性腫瘤，手術(shù)切除是首選治療方式，但手術(shù)完整切除的患者仍可能復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移［10］。盡管靶向治療藥物伊馬替尼可顯著降低患者復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率并延長(zhǎng)生存期，但仍有部分患者會(huì)出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，這可能與KIT 基因繼發(fā)性突變有關(guān)［11-12］。KLUG 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，LMTK3蛋白表達(dá)與KIT 基因繼發(fā)性突變相關(guān)，因此進(jìn)一步研究LMTK3 是有必要的，這可為GIST 發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提出新的見(jiàn)解及對(duì)臨床靶向藥物治療提供新的理論依據(jù)。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，LMTK3 通過(guò)直接或間接途徑參與雌激素受體通路、Wnt 信號(hào)通路、miR-34a 相關(guān)通路及FOXO3 相關(guān)通路，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［4］。LI等［13］研究表明，LMTK3 在胃癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，并與腫瘤浸潤(rùn)深度和分期相關(guān)，LMTK3 陰性表達(dá)者術(shù)后生存率明顯高于LMTK3 陽(yáng)性者。夏鑫等［9］發(fā)現(xiàn)，LMTK3 在結(jié)直腸癌中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，并且表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和 TNM 分期相關(guān)，LMTK3 高表達(dá)患者比 LMTK3 低表達(dá)患者預(yù)后差。LMTK3 也參與調(diào)控肺小細(xì)胞癌及乳腺癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［14-15］。因此，LMTK3主要促進(jìn)腫瘤的增殖和侵襲。近年來(lái)，KLUG等［8］研究發(fā)現(xiàn)，LMTK3 能正向調(diào)控KIT 基因突變細(xì)胞的翻譯，并促進(jìn)KIT 基因突變型GIST 細(xì)胞株的生長(zhǎng)與增殖。本研究結(jié)果顯示，GIST 腫瘤組織中LMTK3 的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)正常組織，并在不同腫瘤直徑、核分裂象計(jì)數(shù)及危險(xiǎn)度分組之間有差異，提示LMTK3在GIST 腫瘤組織中高表達(dá)可能促進(jìn)GIST 的生長(zhǎng)和增殖，這與KLUG等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

凋亡能清除體內(nèi)衰老及異常的細(xì)胞，并在維持多種細(xì)胞功能方面有重要作用。caspase 3和caspase 7作為凋亡過(guò)程的執(zhí)行者，對(duì)于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展非常重要。研究表明caspase 3 蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中低表達(dá)并與脈管侵犯相關(guān)［16］；也可抑制肝癌的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡［17］。而提高caspase 7 蛋白的表達(dá)可促進(jìn)鼻咽癌腫瘤細(xì)胞的凋亡［18］。因此，caspase 3 和caspase 7 蛋白主要功能是抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡。本研究結(jié)果顯示：caspase 3和caspase 7 蛋白在正常組織中表達(dá)水平明顯高于GIST 腫瘤組織，推測(cè)caspase 3和caspase 7的低表達(dá)與GIST腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)；但兩者表達(dá)水平在不同性別、年齡、發(fā)生部位、腫瘤直徑、核分裂像計(jì)數(shù)及危險(xiǎn)度分組之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。caspase 3和caspase 7蛋白在GIST 腫瘤中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系有別于其他上皮源性腫瘤，這一結(jié)果提示可能存在多種因素影響GIST的進(jìn)展。KLUG 等［8］首先發(fā)現(xiàn)，沉默 LMTK3 會(huì)導(dǎo)致caspase 3和caspase 7活性增加，從而誘導(dǎo)GIST 細(xì)胞株凋亡，提示LMTK3 在GIST 中調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制可能與凋亡相關(guān)。但本研究顯示：LMTK3 蛋白表達(dá)與caspase 3 及caspase 7 蛋白表達(dá)之間無(wú)相關(guān)性；分析可能是由于KLUG 等實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株為KIT 基因突變型GIST細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)所選取的腫瘤可能同時(shí)存在其他基因突變，而caspase 3 和caspase 7 作為凋亡過(guò)程的下游執(zhí)行蛋白可能受其他基因調(diào)控影響，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與KLUG 等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不完全一致。國(guó)外學(xué)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)推測(cè)，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的激活與 GIST 發(fā)生、發(fā)展相關(guān)［19-20］。SHI 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，LMTK3 可作用于 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路從而促進(jìn)腫瘤的增殖。也有研究表明miR-34a 作為腫瘤抑制基因在GIST 細(xì)胞中表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞株的生長(zhǎng)［22］，因此推測(cè) miR-34a 的沉默有助于 GIST 腫瘤細(xì)胞的增殖。而miR-34a 通過(guò)與LMTK3 mRNA 的3'-UTR 結(jié)合從而抑制其穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄翻譯［23］。miR-34a 的表達(dá)增強(qiáng)會(huì)促進(jìn)caspase 3 活性增加，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)［24］。因此，本研究結(jié)果與Klug 等試驗(yàn)結(jié)果不完全一致，可能是由于人體GIST 腫瘤組織中miR-34a 有不同程度的表達(dá)；也有可能由于本實(shí)驗(yàn)樣本量相對(duì)較小有關(guān)，LMTK3 在GIST 發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上，LMTK3 在GIST 腫瘤組織中呈高表達(dá)，LMTK3 表達(dá)情況可以作為評(píng)估GIST 惡性潛能的新指標(biāo)；增加caspase 3 和caspase 7 的活性，進(jìn)而促進(jìn)凋亡過(guò)程也可以作為GIST治療的新思路。