生長抑素抗獨特型卵黃抗體對大鼠胰島SST受體定位及功能調(diào)節(jié)的研究

廉靜軒 李 丹 黃曉文 付建芳 （空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院內(nèi)分泌科，西安 710032）

生長抑素（somatostatin，SST）是一種廣泛存在于各組織中的肽激素，在胰腺內(nèi)外分泌腺中大量存在，主要有SST-14 和SST-28 兩種形式，通過結合生長抑素受體（somatostatin receptor，SSTR）發(fā)揮生理作用［1］。SSTR 在人大腦、垂體前葉、胰島、腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)、甲狀腺、卵巢、睪丸等組織均有表達［2］。SST 的生理作用是抑制生長激素（growth hormone，GH）分泌，還可抑制人類和多種物種胰島分泌胰島素和胰高血糖素，而胰島素和胰高血糖素是調(diào)節(jié)血糖水平的重要激素［3］。文獻顯示，敲除SSTR5 受體的小鼠胰島素含量顯著提高，相比于SST 基因缺失小鼠，其胰島數(shù)量、大小、結構、胰島素及胰高血糖素含量均正常，提示胰腺中SST 可能通過SSTR5 調(diào)節(jié)胰島素水平［4］。還有學者通過敲除SSTR2 發(fā)現(xiàn)，SSTR2 缺失，SST 影響胰高血糖素釋放，但不影響胰島素釋放［5］。敲除SSTR5可降低SST-28抑制葡萄糖誘導的胰島素分泌效力［6］。因此在大鼠中，SRIF 通過不同SSTR抑制胰腺分泌胰島素和胰高血糖素。

1974 年，JERNE 首次提出“免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡理論”，其核心是抗體的獨特型（idiotype，Id），誘導機體產(chǎn)生抗獨特型（anti-idiotypic）抗體，抗獨特型抗體可特異性結合抗體的抗原結合區(qū)域，與抗原形成“內(nèi)像”關系，模擬抗原的三維結構，充當抗原分子替代物。文獻報道，單克隆和多克隆抗獨特型抗體技術已廣泛用于疫苗開發(fā)、疾病治療和小分子檢測等領域［7］。

IgY 是雞體內(nèi)主要的循環(huán)抗體，對產(chǎn)蛋雞進行外源致病菌免疫可產(chǎn)生特異性IgY。由于受體作用，IgY 主要貯存于卵黃，使卵黃中IgY 抗體濃度升高。IgY 與哺乳動物IgG 具有相似生物學作用。但與傳統(tǒng)的哺乳動物抗體相比，IgY 具有成本效益高、無創(chuàng)、性質(zhì)穩(wěn)定、效率高、安全性好等優(yōu)點。此外，據(jù)報道，IgY對腸道蛋白酶有較強的耐消化能力［8］。

下丘腦垂體軸是人與動物重要的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)軸，對人與動物的生長起關鍵調(diào)節(jié)作用，生長抑素是該調(diào)節(jié)軸的重要調(diào)節(jié)激素。生長抑素抗獨特型抗體可模擬生長抑素功能，但能否穿過血腦屏障參與下丘腦垂體軸調(diào)節(jié)尚未闡明。小鼠模型中，高親和力的人抗體可穿過血腦屏障［9］。高親和力的抗獨特型單克隆抗體也可穿過血腦屏障發(fā)揮作用［10］。課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射豬SST單克隆抗體，可顯著提高循環(huán)血中GH 水平［11］。采用豬抗SST抗獨特型卵黃抗體作為疫苗免疫接種小鼠、雞和多寶魚，1 個月后平均增重率顯著高于對照組，但接種劑量過大其增重率則低于對照組［12］。說明SST 被動免疫外加的SST 單克隆抗體和主動免疫產(chǎn)生的SST 抗體可穿過血腦屏障，中和下丘腦產(chǎn)生的生長激素釋放抑制激素，降低其對腦垂體GH 細胞的抑制作用，使GH 分泌增加，進而促進動物生長，劑量過大時，SST 抗獨特型卵黃抗體可加強SST對垂體GH 細胞的抑制作用，使GH 分泌減少，進而抑制動物生長。課題組合作單位西安咸輔生物科技有限責任公司已成功制備人SST抗獨特型卵黃抗體，并證明其可模擬SST功能顯著抑制肝癌、胃癌及乳腺癌細胞［13］。但人SST抗獨特型卵黃抗體對胰腺特別是胰腺內(nèi)分泌細胞的功能是否產(chǎn)生影響尚未見報道。本研究擬用該抗獨特型卵黃抗體對大鼠胰腺SST 受體進行共定位，研究其對胰島細胞功能和糖尿病模型大鼠血糖是否產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，為探討其能否用于糖尿病治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品、試劑和儀器 人生長抑素抗獨特型卵黃抗體和兔抗SST抗體由西安咸輔生物科技有限責任公司提供；兔抗胰島素抗體、兔抗胰高血糖素抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗及熒光標記的二抗均購于英國Abcam 公司；胰島素、胰高血糖素試劑盒購于南京賽泓瑞生物科技有限公司。

1.1.2 實驗動物 8 周齡雄性SD 大鼠由空軍軍醫(yī)大學試驗動物中心提供，體質(zhì)量約250 g，飼養(yǎng)于SPF級動物房，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 動物建模 健康SD 大鼠高糖高脂飲食4 周后禁食 12 h，腹腔注射STZ（30 mg/kg），72 h 后尾靜脈測量血糖≥16.7 mmol/L為建模成功［14］。

1.2.2 DAB 染色 雄性SD 大鼠灌注固定，取胰腺用 4%多聚甲醛固定 4～6 h，冰凍切片，PBS 洗 3 次×10 min，加入人生長抑素抗獨特型卵黃抗體（1∶500）4℃ 過夜，PBS 洗 3 次×10 min，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗雞 IgY 抗體（1∶1 000）室溫孵育 2 h。PBS 洗 3 次×10 min，加反應底物 DAB 顯色 3～5 min（顯微鏡下控制顯色時間）。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.2.3 免疫熒光共定位染色 雄性SD大鼠灌注固定，取胰腺用4%多聚甲醛固定4～6 h，冰凍切片，PBS洗3次×10 min，加入SST抗獨特型卵黃抗體（1∶100）、兔抗胰島素抗體（1∶200）、兔抗胰高血糖素抗體（1∶200）、兔抗生長抑素抗體（1∶200）常溫孵育18～20 h，PBS 洗 3 次×10 min。加入 FRITC 標記的山羊抗雞 IgY 抗體，常溫靜置 4 h，PBS 洗 3 次×10 min，加入FITC 標記山羊抗兔IgG 抗體，常溫靜置2 h，PBS 洗 3 次×10 min，采用含 DAP 熒光封片劑封片，熒光共聚焦顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.2.4 ELISA 檢測胰島素和胰高血糖素水平 取正常SD 大鼠15 只，隨機分為對照組、實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ，每組5 只。對照組腹腔注射1 ml 生理鹽水后1%戊巴比妥麻醉，心臟抽血離心，取血漿（0 點）4℃保存；實驗組Ⅰ腹腔注射1 ml SST抗獨特型卵黃抗體（含IgY 4 mg）30 min 后1%戊巴比妥麻醉，心臟抽血離心，取血漿4℃保存；實驗組Ⅱ腹腔注射1 ml SST抗獨特型卵黃抗體60 min后1%戊巴比妥麻醉，心臟抽血離心，取血漿4℃保存。ELISA 檢測胰島素和胰高血糖素水平：采用包被緩沖液將各組血漿進行1∶100稀釋，加至反應孔（100 μl/孔），每只動物每種激素設2 個復孔，常溫靜置1 h，棄孔內(nèi)液體，PBS 洗3 次，3 min/次，分別加入兔抗胰島素和兔抗胰高血糖素抗體（1∶1 000）常溫靜置30 min，棄孔內(nèi)液體，同上洗滌，加入酶標羊抗兔IgG（1∶1 000）常溫靜置30 min，棄孔內(nèi)液體，同上洗滌，加反應底物OPD常溫避光顯色10～15 min，加終止液，測量492 nm 處吸光度（A），A待測孔≥2.1A陰性對照孔即為陽性反應。血糖儀同步檢測大鼠尾靜脈血糖水平。

1.2.5 糖耐量實驗 取糖尿病大鼠10 只，隨機分為SST抗獨特型卵黃抗體治療組與不治療組，另取5只正常SD 大鼠為NC 組，SST 抗獨特型卵黃抗體治療組每日腹腔注射SST抗獨特型卵黃抗體。血糖儀檢測大鼠每日空腹血糖水平。最后1 d 進行各組大鼠糖耐量實驗。檢測前一晚所有大鼠禁食8 h，第2天清晨檢測空腹血糖（FBG），腹腔注射50%葡萄糖溶液［2 g/（kg·d）］，尾靜脈取血，測量各組大鼠餐后不同時間點血糖水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有免疫組織學評估均采用適當?shù)碾S機化和盲法，采用GraphPad Prism7 軟件制圖。采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，結果以表示。組間數(shù)據(jù)多重比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠胰腺SST受體分布 DAB染色結果顯示，SST 受體免疫反應陽性物質(zhì)廣泛分布于大鼠胰島細胞，且胰島毛血管內(nèi)皮細胞和淋巴細胞也呈SST 受體陽性，陽性物質(zhì)呈紅棕色，分布于細胞質(zhì)和細胞膜，胞核著色較淺（圖1）。

圖1 正常大鼠胰島細胞DAB染色（×40）Fig.1 DAB staining of normal rat islet cells（×40）

2.2 免疫熒光共定位觀察結果 胰高血糖素、胰島素、生長抑素免疫反應陽性物質(zhì)呈綠色熒光（圖2A、D、G）。SST 抗獨特型卵黃抗體顯示的SST受體免疫反應陽性物質(zhì)呈紅色熒光（圖2B、E、H），且胰高血糖素與SST受體免疫反應陽性物質(zhì)共定位于A 細胞，胰島素與SST 受體免疫反應陽性物質(zhì)共定位于B 細胞，生長抑素與SST 受體免疫反應陽性物質(zhì)共定位于D 細胞，共定位細胞呈橙黃色熒光（圖2C、F、I）。

圖2 免疫熒光檢測大鼠胰島SST受體與胰島素、胰高血糖素、生長抑素共定位（×40）Fig.2 Co-location of SST receptor and insulin，glucagon and somatostatin in rat islet by immunofluorescence（×40）

2.3 SST 抗獨特型卵黃抗體對正常大鼠胰島內(nèi)分泌激素和血糖的影響 注射SST抗獨特型卵黃抗體后不同時間點，大鼠胰高血糖素和胰島素水平逐漸下降，胰高血糖素在注射60 min 后差異具有統(tǒng)計學意義，胰島素在注射30 min后有統(tǒng)計學差異（圖3A，P＜0.01）。注射SST 抗獨特型卵黃抗體后大鼠血糖水平逐漸降低，注射60 min 后差異具有統(tǒng)計學意義（圖3B，P＜0.05）。

圖3 不同時間點大鼠胰島素、胰高血糖素及血糖水平Fig.3 Insulin，glucagon and glucose levels in rats at different time points

2.4 SST 抗獨特型卵黃抗體對STZ 誘導的糖尿病大鼠血糖的影響 腹腔注射SST抗獨特型卵黃抗體后，糖尿病大鼠血糖隨時間逐漸下降，第5～10 天差異有統(tǒng)計學意義（圖4A，P＜0.05，P＜0.01）。糖耐量實驗顯示，SST 抗獨特型卵黃抗體治療組大鼠各點血糖值均高于正常對照組，但均低于未治療組（圖4B，P＜0.001），說明治療組相比于不治療組糖耐量明顯改善。

圖4 大鼠糖耐量實驗和不同時間點血糖水平Fig.4 Rat glucose tolerance test and glucose levels at different time points

3 討論

生長抑素對胰腺特別是胰島功能發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，其調(diào)節(jié)作用是通過與SST 受體結合而實現(xiàn)［15］。SST 受體在胰島細胞廣泛分布，研究者通過反轉(zhuǎn)錄PCR 證明SSTR 所有亞型均分布于大鼠整個胰腺［16］。本研究采用SST抗獨特型卵黃抗體對大鼠胰腺進行免疫細胞化學染色，發(fā)現(xiàn)大鼠胰島細胞及胰島毛細血管內(nèi)皮細胞和淋巴細胞均呈免疫陽性反應，說明課題組制備的SST 抗獨特型卵黃抗體可與大鼠胰島內(nèi)分泌細胞及胰島內(nèi)毛細血管內(nèi)皮細胞、淋巴細胞上SST 受體結合，呈SST 免疫反應陽性。

胰腺不同細胞分布不同SSTR 亞型，研究發(fā)現(xiàn)SSTR2A 分布于胰島A 細胞和胰腺外分泌部腺上皮細胞，SSTR5 分布于大鼠胰島 B 細胞［17］。通過共聚焦顯微鏡對人胰島SSTR1～SSTR5 進行定量和定位分析發(fā)現(xiàn)，人胰島內(nèi)熒光強度順序為SSTR1＞SSTR5＞SSTR2＞SSTR4＞SSTR3，SSTR1、SSTR5、SSTR2在B細胞表達較多，SSTR3 和SSTR4 在B 細胞表達較少；SSTR2 在 A 細胞表達較多，而 SSTR5 和 SSTR1 則在A 細胞表達較少；SSTR5 在D 細胞表達較多，而SSTR1、SSTR2 和 SSTR3 則在 D 細胞表達較少［7］。本研究通過對大鼠胰腺進行免疫熒光共定位，發(fā)現(xiàn)紅色熒光的SST 受體和綠色熒光的胰島素、胰高血糖素和生長抑素分別共定位于B 細胞、A 細胞和D 細胞，使其呈橙黃色熒光，說明課題組制備的SST抗獨特型卵黃抗體可與SSTR不同亞型結合。

生長抑素對胰島素和胰高血糖素分泌的影響報道較多，采用生長抑素對大鼠進行靜脈灌注可顯著降低循環(huán)血中胰島素和胰高血糖素水平［18］。采用生長抑素對糖尿病患者進行靜脈滴注可顯著抑制糖尿病患者基礎胰島素和胰高血糖素水平，最高可達 50%［19］。

本研究通過對大鼠腹腔注射SST抗獨特型卵黃抗體發(fā)現(xiàn)，給藥后30 min 和60 min 循環(huán)血中胰島素和胰高血糖素水平均顯著降低（P＜0.05），同時血糖水平也顯著降低（P＜0.05）。說明課題組制備的SST抗獨特型卵黃抗體不僅可與SST 受體不同亞型結合，還可模擬SST 功能，調(diào)節(jié)胰島功能和血糖水平。本研究采用間接ELISA法檢測循環(huán)血中胰高血糖素和胰島素含量，ELISA 主要用于肽類和蛋白定量檢測 ，由 ENGVALL 和 PERLMENN 于 1971 年 首先 提出，目前已廣泛用于免疫學、微生物學和寄生蟲學檢測，由于其靈敏度高、試劑穩(wěn)定和設備簡單等優(yōu)點，近年被應用于食物中部分活性物質(zhì)檢測［20］。

奧曲肽是生長抑素類似物，可調(diào)節(jié)胰島內(nèi)分泌激素和血糖水平，已被證明對糖尿病有較好療效［21］。本研究通過腹腔注射SST抗獨特型卵黃抗體治療STZ 誘導的糖尿病模型大鼠，發(fā)現(xiàn)其能顯著降低糖尿病大鼠血糖水平。SST 抗獨特型卵黃抗體分子量大，穩(wěn)定性高，在體內(nèi)不易被分解失效，克服了奧曲肽分子量小，在體內(nèi)易被分解失效、半衰期短等缺點。同時卵黃抗體耐高溫，方便保存和運輸，作用途徑多樣，注射、口服均有效［22］。