丙戊酸鈉通過下調(diào)NCX表達(dá)緩解大鼠神經(jīng)病理性疼痛的實(shí)驗(yàn)研究

徐梅玲 申大年 張育珠 （青海省第五人民醫(yī)院疼痛科，西寧 810007）

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是由外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或功能障礙引起的疼痛，神經(jīng)損傷是NP 發(fā)生的常見病因，會(huì)誘發(fā)疼痛傳感器異常表達(dá)，特別是疼痛上傳通路背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）內(nèi)感覺神經(jīng)元傳感器的變化，且目前尚無根治方法［1］。組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACI）有穩(wěn)定情緒、神經(jīng)保護(hù)和抗炎作用，在緩解NP 中具有較好的前景，但具體機(jī)制尚不明確［2］；其中丙戊酸鈉（sodium valproate，VPA）作為 HDACI 的一種，在創(chuàng)傷性顱腦損傷中可誘導(dǎo)壞死細(xì)胞凋亡、降低炎癥因子水平從而保護(hù)神經(jīng)［3］。在NP中抑制鈣鈉交換蛋白（sodiumcalcium exchanger，NCX）逆向作用可抑制 TNF-α 表達(dá)、抑制鈣離子超載作用從而緩解鎮(zhèn)痛［4］。推測VPA 可能影響NCX 的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)對疾病的保護(hù)。因此，本研究右側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎手術(shù)建立坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷（chronic constriction injury，CCI）致NP模型，VPA處理后初步探究其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)、健康雄性SD 大鼠購自上海斯萊克動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）-2016-0109，體質(zhì)量（200±20）g。所有大鼠均在溫度（24±1）℃、濕度（50±5）%、12 h光照/12 h黑暗條件下自由飲水?dāng)z食，每天對鼠籠清理并消毒，定期更換墊料，暫養(yǎng)7 d。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑與儀器 VPA（杭州制藥有限公司，批號(hào)：A2270/2CA45）；NCX 激動(dòng)劑E4031（美國 MEC 公司，編號(hào)：HY-15551）；大鼠TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒，一抗兔抗組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX、β-actin（英國 Abcam 公司，貨號(hào)分別為：ab208348、ab197742、ab19845、ab32117、ab32369、ab187139、ab177952、ab8226）。電子 Von Frey 刺激針（美國Frey Haris 纖維機(jī)械公司，型號(hào)：Von Frey Hairs Von Frey Filaments）；熱輻射儀（意大利 Ugo Basile 公司，型號(hào)：Ugo Basile38450）；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）儀（美國 ABI 公司，型號(hào)：7500）；蛋白凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司，型號(hào)：GelDoc EZ）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥處理 實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、模型組、VPA 組、VPA+E4031 組，每組 10 只。所有大鼠腹腔注射40 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉，除假手術(shù)組外其余各組建立CCI 模型［5］，分離右側(cè)坐骨神經(jīng)，4.0 絲線在坐骨神經(jīng)中段間隔2 mm 結(jié)扎，共結(jié)扎4次，僅留縊痕而不阻斷血供，分層縫合皮膚。假手術(shù)組僅暴露出坐骨神經(jīng)而不結(jié)扎。參考吳飛翔等［6］鞘內(nèi)置管，左掌壓住鼠身，拇指、中指固定大鼠，沿腰中線切開皮膚，暴露L5～L6 間隙，L5 棘突處垂直剪開，剔除部分L6 棘突，暴露出L5～L6 間的三角間隙，小針穿破硬膜，夾取PE-10導(dǎo)管延穿刺孔插入1 cm 左右，閉合管口、縫合皮膚。實(shí)驗(yàn)后及建模后腹腔注射100 mg/ml 的氨芐青霉素防止感染。置管成功當(dāng)天建模后的第3、5、7、10 天VPA 組鞘內(nèi)注射1 mg/kg VPA，VPA+E4031組在同天鞘內(nèi)注射1 mg/kg VPA 和150 μg/kg E4031，VPA、E4031 均用VPS 溶媒溶解，進(jìn)針4 cm 左右，針頭斜向下，針頭觸及椎骨有抵擋感停止進(jìn)針［7］。假手術(shù)組和模型組鞘內(nèi)注射等體積VPS溶媒。

1.2.2 機(jī)械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）的測定 分別于造模前，建模后的第 1、3、5、7、10 天，所有大鼠置于有機(jī)透明玻璃箱（容積：長20 cm×寬12 cm×高20 cm）中限制其活動(dòng)，箱底放0.5 cm×0.5 cm 網(wǎng)格鐵絲網(wǎng)，每次實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)15 min，測定MWT。電子Von Frey 刺激針刺激大鼠右足底，從1.0 g開始，逐漸增加纖毛折力，反射的最小刺激強(qiáng)度即為MWT，共測量3 次，計(jì)算其平均值為MWT。

1.2.3 縮足反射潛伏期（paw withdraw thermal latency，PWTL）的測定 MWT 實(shí)驗(yàn)結(jié)束 1 h，熱輻射照射大鼠右足底，其快速抬足或添足即停止，記錄持續(xù)時(shí)間即為PWTL，共測量3 次，計(jì)算平均值為PWTL。

1.2.4 ELISA 檢測脊髓中 TNF-α、IL-1β 水平 造模第14天立即處死大鼠，分離L4～L6 DRG組織置于-80℃冰箱待用；分離L4～L5 段脊髓組織，加入預(yù)冷的磷酸緩沖液，4℃、8 000 r/min 離心 10 min 收集上清，大鼠 TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒檢測脊髓中TNF-α、IL-1β水平。

1.2.5 qRT-PCR 檢 測 DRG 中 HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX mRNA 水平 -80℃ 冰箱取DRG，Trizol 法提總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR儀擴(kuò)增，引物序列見表1。上樣體系：cDNA 1 μl、2×Mix 10 μl、正向引物/反向引物（10 μmol/L）各0.5 μl、ddH2O 8.0 μl。擴(kuò)增程序：95℃ 5 min，94℃20 s，62℃ 80 s，40 個(gè) 循 環(huán) 。 采 用 2-ΔΔCt法 計(jì) 算HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX mRNA 相對表達(dá)量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 Western blot 法 檢 測 DRG 中 HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX 蛋白表達(dá) 部分DRG加RIPA裂解液冰上研磨組織，4℃、13 400 r/min離心20 min，收集上清為總蛋白，上樣20 μg 行SDSPAGE，NC 膜轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后加入一抗 HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX、β-actin 4℃ 孵育過夜，加入對應(yīng)二抗，ECL 化學(xué)發(fā)光液顯色，Image J 軟件定量掃描蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達(dá)水平=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均采用表示，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VPA 對大鼠 MWT 的影響 造模前，4 組 MWT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。建模后第1、3 天，與假手術(shù)組相比，模型組、VPA 組、VPA+E4031 組MWT 降低（P＜0.05）。建模后第（5、7、10）天，與假手術(shù)組相比，模型組MWT 降低（P＜0.05）；與模型組相比，VPA 組MWT 升高（P＜0.05）；與VPA 組相比，VPA+E4031組MWT降低（P＜0.05）。見表2。

表2 4組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)MWT比較（，n=10）Tab.2 Comparison of MWT at different time points in 4 groups（，n=10）

表2 4組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)MWT比較（，n=10）Tab.2 Comparison of MWT at different time points in 4 groups（，n=10）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with VPA group，3）P＜0.05.

10 d after modeling 26.23±3.15 7.15±1.061）20.66±2.082）14.46±2.153）134.700＜0.01 Groups Sham operation Model VPA VPA+E4031 F P Before modeling 26.48±3.17 27.05±4.08 26.98±2.18 26.86±3.41 0.060 0.980 1 d after modeling 23.45±2.18 13.46±1.581）14.46±1.521）13.98±2.581）55.873＜0.01 3 d after modeling 24.33±2.65 10.68±1.921）13.18±2.251）11.45±1.971）82.497＜0.01 5 d after modeling 24.95±3.08 8.19±2.061）15.68±1.952）9.48±1.863）111.527＜0.01 7 d after modeling 25.45±3.08 7.69±1.281）18.45±2.062）12.64±1.583）131.086＜0.01

2.2 VPA 對大鼠 PWTL 的影響 造模前，4 組PWTL 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。建模后第1、3 天，與假手術(shù)組相比，模型組、VPA 組、VPA+E4031組PWTL 降低（P＜0.05）。建模后第5、7、10 天，與假手術(shù)組相比，模型組PWTL降低（P＜0.05）；與模型組相比，VPA 組PWTL 升高（P＜0.05）；與VPA 組相比，VPA+E4031組PWTL降低（P＜0.05）。見表3。

表3 4組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)PWTL比較（，n=10）Tab.3 Comparison of PWTL of rats in 4 groups at different time points（，n=10）

表3 4組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)PWTL比較（，n=10）Tab.3 Comparison of PWTL of rats in 4 groups at different time points（，n=10）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with VPA group，3）P＜0.05.

10 d after modeling 14.67±2.17 6.01±1.621）12.98±2.532）9.89±2.413）29.659＜0.01 Groups Sham operation Model VPA VPA+E4031 F P Before modeling 15.65±1.15 15.53±2.14 15.38±1.29 15.59±2.09 0.045 0.987 1 d after modeling 12.62±2.48 7.45±1.681）7.95±1.911）7.81±2.061）14.246＜0.01 3 d after modeling 12.98±1.65 7.14±1.831）9.14±2.041）7.48±1.951）20.418＜0.01 5 d after modeling 13.45±1.86 6.87±1.691）11.15±1.952）8.15±1.863）25.933＜0.01 7 d after modeling 14.05±1.83 6.34±1.581）12.48±2.122）9.15±2.153）31.770＜0.01

2.3 VPA 對大鼠脊髓中 TNF-α、IL-1β 水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組脊髓中TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，VPA 組脊髓中TNF-α、IL-1β 水平降低（P＜0.05）；與VPA 組相比，VPA+E4031 組脊髓中 TNF-α、IL-1β 水平升高（P＜0.05）。見表4。

表4 4組大鼠脊髓中TNF-α、IL-1β水平比較（，n=10）Tab.4 Comparison of TNF-α and IL-1β levels in spinal cord of rats in 4 groups（，n=10）

表4 4組大鼠脊髓中TNF-α、IL-1β水平比較（，n=10）Tab.4 Comparison of TNF-α and IL-1β levels in spinal cord of rats in 4 groups（，n=10）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with VPA group，3）P＜0.05.

IL-1β 24.56±3.46 86.11±6.561）46.16±7.152）68.15±6.493）192.407＜0.01 Groups Sham operation Model VPA VPA+E4031 F P TNF-α 186.16±21.16 406.59±15.481）248.18±31.152）374.86±24.483）192.281＜0.01

2.4 VPA 對大鼠DRG 中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX mRNA 水 平 的 影 響 4 組 DRG 中HDAC8 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與假手術(shù)組相比，模型組 DRG 中 HDAC1、HDAC2、NCX mRNA水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，VPA 組DRG 中HDAC1、HDAC2、HDAC3、NCX mRNA 水平降低（P＜0.05）；與 VPA 組 相 比 ，VPA+E4031 組 DRG 中HDAC1、HDAC2、NCX mRNA 水平升高（P＜0.05）。見表5。

表5 4組大鼠DRG中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX mRNA水平比較（，n=10）Tab.5 Comparison of mRNA levels of HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC8 and NCX in DRG of rats in 4 groups（，n=10）

表5 4組大鼠DRG中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX mRNA水平比較（，n=10）Tab.5 Comparison of mRNA levels of HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC8 and NCX in DRG of rats in 4 groups（，n=10）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with VPA group，3）P＜0.05.

NCX 0.98±0.11 2.18±0.151）1.56±0.182）1.95±0.243）88.462＜0.01 Groups Sham operation Model VPA VPA+E4031 F P HDAC1 1.01±0.12 1.85±0.231）0.86±0.152）1.34±0.243）52.184＜0.01 HDAC2 0.99±0.09 2.34±0.261）1.24±0.182）1.86±0.123）121.543＜0.01 HDAC3 1.01±0.14 1.21±0.21 0.95±0.152）1.09±0.19 4.132 0.013 HDAC8 1.02±0.15 1.25±0.32 1.28±0.21 1.38±0.35 3.178 0.065

2.5 VPA 對大鼠DRG 中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX 蛋白水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組 DRG 中 HDAC1、HDAC2、HDAC3、NCX 蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，VPA 組DRG 中HDAC1、HDAC2、HDAC3、NCX 蛋白水平降低（P＜0.05）；與 VPA 組 相 比 ，VPA+E4031 組 DRG 中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX 蛋白水平升高（P＜0.05）。見圖1、表6。

圖1 4組大鼠DRG 中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX蛋白水平Fig.1 Protein levels of HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC8 and NCX in DRG of rats in 4 groups

表6 4組大鼠DRG中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX蛋白水平比較（，n=10）Tab.6 Comparison of protein levels of HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC8 and NCX in DRG of rats in 4 groups（，n=10）

表6 4組大鼠DRG中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX蛋白水平比較（，n=10）Tab.6 Comparison of protein levels of HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC8 and NCX in DRG of rats in 4 groups（，n=10）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with VPA group，3）P＜0.05.

NCX 0.11±0.02 0.46±0.051）0.13±0.022）0.34±0.043）233.469＜0.01 Groups Sham operation Model VPA VPA+E4031 F P HDAC1 0.37±0.05 0.89±0.051）0.08±0.012）0.78±0.043）836.219＜0.01 HDAC2 0.42±0.04 1.05±0.061）0.38±0.042）0.71±0.083）291.919＜0.01 HDAC3 0.56±0.06 0.89±0.091）0.35±0.042）0.54±0.063）119.053＜0.01 HDAC8 0.95±0.10 1.05±0.12 1.02±0.11 1.17±0.133）6.311＜0.01

3 討論

NP 一直是治療的難點(diǎn)和熱點(diǎn)，神經(jīng)損傷導(dǎo)致DRG 神經(jīng)元異常興奮，不斷向脊髓背角神經(jīng)元發(fā)出沖動(dòng)，脊髓組織中小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活，小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活可產(chǎn)生大量細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等，進(jìn)而增強(qiáng)脊髓北角神經(jīng)元興奮，過量的物質(zhì)積累聚集在脊髓背角可持續(xù)誘發(fā)病理性疼痛［8-9］。阻斷神經(jīng)元的過度興奮等過程可能緩解疾病。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組MWT、PWTL 降低，提示建立模型后NP 大鼠出現(xiàn)明顯的機(jī)械痛敏和熱痛敏癥狀，可能與神經(jīng)元異常興奮有關(guān)。

NCX 通過1 個(gè)鈣離子與3 個(gè)鈉離子交換模式實(shí)現(xiàn)對胞內(nèi)外鈣濃度平衡的調(diào)節(jié)，正常情況下將鈣離子從細(xì)胞內(nèi)泵出，病理狀態(tài)下將鈣離子泵入細(xì)胞，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，而鈣離子大量內(nèi)流可激活第二信使鈣-鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ，活化后與NMDAR 亞單元 2B 結(jié)合，增加 NMDAR 活性，增強(qiáng)突觸作用，增強(qiáng)痛覺［10-11］。在NP中NCX 活性增加是增加傷害性閾值的原因之一［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組DRG中NCX水平升高，提示NP中確實(shí)存在鈣離子內(nèi)流，增強(qiáng)痛覺，加重NP。疼痛是神經(jīng)系統(tǒng)對傷害刺激的感覺，而補(bǔ)體與某些病理性疼痛關(guān)系密切，補(bǔ)體旁路激活會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和出現(xiàn)組織損傷［13］。TNF-α、IL-1β 作為炎癥因子，在NP中水平升高，且與抑郁樣行為關(guān)系密切［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組脊髓中TNF-α、IL-1β水平升高，提示NP脊髓中炎癥明顯，損傷神經(jīng)元。

VPA 作為HDACs抑制劑，是臨床上常用廣譜抗癲癇藥，可通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，抑制神經(jīng)相關(guān)基因合成從而抑制癲癇；可降低鈉離子濃度，抑制神經(jīng)元去極化，維持神經(jīng)細(xì)胞膜穩(wěn)定性，抑制異常放電；且可降低炎癥因子水平，減少炎癥對神經(jīng)元的損傷［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，使用 VPA 后，NP 大鼠的機(jī)械痛敏和熱痛敏癥狀得以緩解，可能是VPA能降低鈉離子濃度，抑制神經(jīng)元去極化，維持神經(jīng)細(xì)胞膜穩(wěn)定性；同時(shí)減少炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)元的保護(hù)，但具體抑制的HDAC 尚在探索。HDACs 作為一種翻譯后修飾酶，可去除核小體核心組蛋白氨基末端賴氨酸殘基中的乙?；?，促使染色體凝聚，從而阻止轉(zhuǎn)錄激活子進(jìn)入其靶位點(diǎn)，抑制轉(zhuǎn)錄；分4 類 ，其 中 Ⅰ 類 包 括 HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8 4 個(gè)基因，與神經(jīng)發(fā)育關(guān)系密切［16］。NP 中HDAC1抑制劑LG325可顯著減輕損傷引起的疼痛，并且LG325可阻止c-Jun磷酸化途徑從而減輕傷害，但尚未發(fā)現(xiàn) HDAC3 的變化［17］；升高 HDAC2 可影響下游基因水平變化可促進(jìn)鈉離子和鈣離子內(nèi)流，導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)鈣離子水平升高，進(jìn)而誘導(dǎo)突觸結(jié)構(gòu)和功能的可塑性改變；同時(shí)直接影響疼痛相關(guān)因子如谷氨酸脫氫酶6 的表達(dá)，且HDAC2 與炎癥基因關(guān)系密切，HDAC2 水平升高可募集炎癥基因復(fù)合物，從而降低組蛋白乙?；?、染色質(zhì)重塑［18-19］。但又有研究發(fā)現(xiàn)是HDAC2 而非HDAC1 通過調(diào)節(jié)Kv1.2 表達(dá)而參與NP 過程［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組 DRG 中 HDAC1、HDAC2 mRNA 和蛋白水平升高；與模型組相比，VPA 組 DRG 中 HDAC1、HDAC2 mRNA 和蛋白水平降低，變化趨勢較一致，脊髓中 TNF-α、IL-1β 水平，DRG 中NCX mRNA 和蛋白水平降低，提示可能是通過抑制HDAC1、HDAC2從而抑制下游通路，減少炎癥水平從而加強(qiáng)組蛋白乙?；?、染色體重塑；減少鈣離子內(nèi)流，增強(qiáng)突觸結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和增強(qiáng)突觸可塑性實(shí)現(xiàn)的。且增加NCX 水平可逆轉(zhuǎn)上述情況，提示VPA 抑制NCX 實(shí)現(xiàn)對NP大鼠的保護(hù)。

綜上所述，VPA 下調(diào) NCX 實(shí)現(xiàn)對 NP 大鼠的保護(hù)，且起到緩解炎癥的作用。但VPA 抑制HDAC1或者HDAC2 或二者皆有作用影響NCX 尚不明確，是接下來研究重點(diǎn)。