葛根素-殼寡糖共無定型制備與體外溶出度評價*

任麗佳，李 杰，唐麗娜△

（1.南京中醫(yī)藥大學江陰附屬醫(yī)院，江蘇 無錫214400；2.南京中醫(yī)藥大學附屬張家港醫(yī)院，江蘇 張家港 215600）

葛根素是中藥葛根中提取的主要有效成分，是一種異黃酮類化合物，臨床應用廣泛，主要用于治療心絞痛、高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等疾?。??2］。但其水溶性差，口服生物利用度低，臨床應用受到限制［3?5］。無定型技術通過破壞藥物晶格，可有效改善難溶性藥物的溶解度/溶出度。無定型固體分散體（ASD）技術通過添加載體來提高無定型藥物的物理穩(wěn)定性［6?7］，載體包括高分子聚合物類和表面活性劑類，但其較強的引濕性均導致物理穩(wěn)定性差，此外還有與藥物混溶性差、胃腸道副作用等問題，且用量較大導致藥物服用量大。共無定型技術具有更高的物理穩(wěn)定性和更好的溶出表現(xiàn)，已成為ASD的替代技術。與單一無定型藥物相比，共無定型藥物除物理穩(wěn)定性好外，當配體為活性成分時，還可產生協(xié)同治療、較少副作用等聯(lián)合治療效果。殼寡糖也稱幾丁寡糖，是殼聚糖的水解產物，天然環(huán)保，相對分子質量小，水溶性良好，黏度低［8］，還具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性［9?12］。殼寡糖作為一種生物利用度增強劑，可打開細胞間的緊密連接，提高藥物的腸道吸收，增強藥物的生物利用度［11?12］。本研究中選擇殼寡糖為共無定型的新型藥物配體，與葛根素共同制備葛根素?殼寡糖共無定型（PUE?COS CM），采用多種固態(tài)表征方法進行分析，并評價其在漏槽和非漏槽2種條件下的體外溶出表現(xiàn)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Bromanil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；SPEX 6770型冷凍研磨機（美國SPEX公司）；CPA 225D型電子分析天平（南京以馬內利儀器設備有限公司，精度為十萬分之一）；Q2000型示差掃描量熱儀（美國TA公司）；D/max 2500型X?射線粉末衍射儀（日本Rigaku公司）；SNE?4500型掃描電鏡儀（日本Hitachi公司）；Bruker?TENSOR37型紅外光譜儀（德國Bruker Optics公司）；HY68/RCY?1型智能溶出試驗儀（北京中西遠大科技有限公司）；LHH?350CFS型綜合藥品穩(wěn)定試驗箱（上海凱朗儀器設備廠）；Milli?Q型超純水系統(tǒng)（美國Millpore公司）；KH?500DE型數控超聲清洗儀（昆山超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；MX?F型渦旋儀（大龍興創(chuàng)實驗儀器股份<北京>有限公司）。

1.2 試藥

葛根素原料藥（上海泰坦科技股份有限公司，批號為5214C，純度大于98%）；殼寡糖（浙江金殼藥業(yè)有限公司，批號為M?KG?1708001，相對分子質量1 000，脫乙酰度大于90%）；甲醇（色譜純，美國Tedia有限公司）；氫氧化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；葛根素對照品（批號為P111269，純度大于98%），磷酸二氫鉀（分析純），均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 樣品制備

PUE?COS CM：將總質量為1 g的葛根素與殼寡糖［質量比1∶1（m/m）］混勻，采用低溫研磨法制備PUE?COS CM。置充滿液氮的低溫室，以10 Hz的頻率研磨5 min，冷卻2 min，按此步驟循環(huán)，低溫研磨30 min。樣品置真空干燥箱中干燥24 h，保存于干燥器中，備用。同法制備低溫研磨葛根素。

葛根素?殼寡糖物理混合物（PUE?COS PM）：取總質量為1 g的葛根素與殼寡糖混合物［質量比1∶1（m/m）］，置50 mL離心管中，置渦旋儀上渦旋40 min，使葛根素和殼寡糖充分混勻，即得PUE?COS PM，保存于干燥器中，備用。

2.2 高效液相色譜法測定含量

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Bromanil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇?水溶液（51∶49，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：250 nm；進樣量：10μL。

2.2.2 方法學考察

線性關系考察：取葛根素對照品4.825 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）使溶解，定容，振蕩搖勻，配制成質量濃度為482.5μg/mL的對照品貯備液。精密吸取500μL，稀 釋 成 質 量 濃 度 分 別 為1.88，3.80，7.54，15.08，30.16，60.31，120.63，241.25，482.50 μg/mL的系列對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定。分別以葛根素質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=40 524X?3 145.8（R2=0.999 9，n=9）。結果表明，葛根素質量濃度在1.88～482.50μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：吸取線性關系考察項下質量濃度分別為3.80，60.31，241.25 μg/mL的葛根素對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果葛根素峰面積的RSD分別為2.53%，0.98%，1.14%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取PUE?COS CM適量，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）使溶解，振蕩搖勻，定容，即得葛根素質量濃度為62.16μg/mL的溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時按擬訂色譜條件進樣測定。結果葛根素峰面積的RSD為1.87%（n=6），表明PUE?COS CM溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：按穩(wěn)定性試驗項下方法平行制備6份PUE?COS CM供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定。結果葛根素含量的RSD為1.76%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取6份已知含量的PUE?COS CM適量，精密稱定，分別加入等量葛根素對照品，按穩(wěn)定性試驗項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定。結果PUE?COS CM中葛根素的平均加樣回收率為96.05%，RSD為2.68%（n=6）。

2.3 PUE-COS CM表征分析

差示掃描量熱法：分別取葛根素原料藥、殼寡糖、PUE?COS PM、低溫研磨葛根素、PUE?COS CM各適量（5～10 mg），置鋁坩堝中，置Q2000型示差掃描量熱儀中分析，測定條件為，升溫速率10℃/min，升溫范圍50～250℃，氮氣流速50 mL/min。結果見圖1 A?？梢姡鸶卦纤幵?5.4～157.8℃間存在明顯失水峰，在191.4～219.2℃間有一尖銳吸熱峰，該吸熱峰為葛根素原料藥的晶體熔化峰（圖1 a波）；殼寡糖在50.0～145.8℃間存在明顯失水峰，在215.2～234.5℃間存在明顯吸熱峰，該吸熱峰由殼寡糖發(fā)生降解所致（圖1 b波）；PUE?COS PM在191.4～234.5℃間存在吸熱峰，該峰由葛根素原料藥晶體熔化峰與殼寡糖降解峰疊加所致（圖1 c波）；低溫研磨葛根素在191.4～219.2℃間存在葛根素原料藥的晶體熔化峰，表明通過低溫研磨不能使葛根素原料藥晶體完全轉變成無定型狀態(tài)（圖1 d波）；PUE?COS CM中葛根素的晶體熔化峰完全消失，并存在單一的玻璃化轉變溫度（95.7℃），表明通過低溫研磨成功制備為共無定型系統(tǒng)（圖1 e波）。

X射線粉末衍射法：分別取葛根素原料藥、殼寡糖、PUE?COS PM、低溫研磨葛根素、PUE?COS CM各適量，平鋪于載玻片上，置D/max 2500型X?射線粉末衍射儀分析，測定條件為，Cu靶（40 kV，40 mA），掃描范圍3°～40°（2θ），掃描速率2°/min，步長0.02°。結果見圖1 B?？梢?，葛根素原料藥在6.5°，7.9°，8.7°，11.5°，13.8°，15.9°，16.8°，18.1°，18.9°，19.6°，21.0°，23.4°，26.2°

等處有較強的晶體衍射峰（圖1 f波）；殼寡糖在3°～40°范圍內無晶體衍射峰，表明殼寡糖以無定型形式存在（圖1 g波）；在PUE?COS PM中，葛根素原料藥的晶體衍射峰仍然存在（圖1 h波）；低溫研磨葛根素中，葛根素原料藥的晶體衍射峰顯著減弱，部分衍射峰消失，但仍存在部分晶體衍射峰，表明低溫研磨僅能在一定程度上破壞葛根素原料藥的晶格，不能完全使其晶體轉變?yōu)闊o定型狀態(tài)（圖1 i波）；PUE?COS CM中，葛根素原料藥的晶體衍射峰全部消失，表明成功制備了PUE?COS CM（圖1 j波）。

a，f，k.葛根素原料藥b，g，l.殼寡糖c，h，m.PUE?COS PM d，i，n.低溫研磨葛根素e，j，o.PUE?COS CMA.差示掃描量熱法B.X射線粉末衍射法C.傅里葉紅外光譜法圖1表征分析圖a，f，k.PUE API b，g，l.COS c，h，m.PUE?COS PM d，i，n.PUE ground by the cryomilling method e，j，o.PUE?COS CMA.DSC B.XRPD C.FTIRFig.1 Phenograms of characterization analysis

A.葛根素原料藥B.殼寡糖C.PUE?COS PM D.PUE?COS CM圖2掃描電鏡圖A.PUE API B.COS C.PUE?COS PM D.PUE?COS CMFig.2 SEM images

傅里葉紅外光譜法：分別取葛根素原料藥、殼寡糖、PUE?COS PM、低溫研磨葛根素、PUE?COS CM各適量，采用Bruker?TENSOR37型紅外光譜儀分析，測定條件為，掃描波數范圍4 000～600 cm?1，分辨率2 cm?1。結果見圖1 C?？梢?，葛根素原料藥的主要特征吸收峰為于3 379 cm?1波數處存在－OH的伸縮振動，在1 628 cm?1波數處存在C＝O的伸縮振動（圖1 k波）；殼寡糖的主要特征吸收峰為在1 608 cm?1波數處存在酰胺Ⅰ的C＝O伸縮振動（圖1 l波）；PUE?COS PM中，葛根素和殼寡糖的主要特征吸收峰仍然存在（圖1 m波），表明在物理混合物中，葛根素和殼寡糖間未發(fā)生相互作用；與葛根素原料藥相比，低溫研磨葛根素的紅外吸收峰未發(fā)生明顯變化（圖1 n波）；PUE?COS CM中，葛根素于3 379 cm?1波數處的－OH特征峰消失，殼寡糖在1 608 cm?1波數處的C＝O伸縮振動明顯減弱，表明葛根素與殼寡糖間發(fā)生了潛在的分子間氫鍵相互作用（圖1 o波）。

掃描電鏡分析：分別取葛根素原料藥、殼寡糖、PUE?COS PM、PUE?COS CM各適量，均勻撒于貼有導電膠帶的樣品座上，噴金5 min，用鑷子取出，置SNE?4500型掃描電鏡儀，采用3 000 V的加速電壓掃描其表面，并拍照。結果見圖2?？梢?，葛根素原料藥具有明顯的長片狀特征，形狀規(guī)則（圖2 A）；殼寡糖為大小不一的規(guī)則球形（圖2 B）；PUE?COS PM中，葛根素原料藥的長片狀特征和殼寡糖的球形特征仍然存在（圖2 C）；PUE?COS CM呈顆粒狀、不規(guī)則塊狀，且粒徑減小，葛根素原料藥的長片狀特征和殼寡糖的球形特征均完全消失（圖2 D）。

2.4 體外溶出試驗

漏槽條件下：取葛根素原料藥、PUE?COS PM、低溫研磨葛根素、PUE?COS CM（相當于6 mg葛根素原料藥）各適量，精密稱定，按2015年版《中國藥典（四部）》附錄XC溶出度測定法進行體外溶出試驗，溶出介質為磷酸鹽緩沖液（pH 6.8），介質體積為900 mL，溫度為（37±0.5）℃，轉速為50 r/min，分別于2，5，10，20，30，45，60 min時取樣3 mL，并隨即補足等溫度、等量的溶出介質，經0.45 μm微孔濾膜濾過，按2.2.1項下色譜條件進樣測定3次，計算各時間點的葛根素累積溶出率。體外溶出曲線見圖3 A。可見，在漏槽條件下，葛根素原料藥與PUE?COS PM溶出曲線相似；與葛根素原料藥相比，低溫研磨葛根素的累積溶出率稍提高，主要是由于低溫研磨后，葛根素原料藥粒徑減小，其與溶出介質的接觸表面積增大；與葛根素原料藥相比，PUE?COS CM的累積溶出率顯著提高。5 min時，PUE?COS CM中葛根素的累積溶出率為76.25%，而葛根素原料藥僅為35.97%（P<0.01）；10 min時，PUE?COS CM中葛根素的累積溶出率為85.26%，而葛根素原料藥僅為50.79%（P<0.01）。由于PUE?COS CM自由能更高，且藥物粒徑減小，導致PUE?COS CM中葛根素的累積溶出率顯著提高。

非漏槽條件下：取葛根素原料藥、PUE?COS PM、低溫研磨葛根素、PUE?COS CM（相當于30 mg葛根素原料藥）各適量，精密稱定，按2015年版《中國藥典（四部）》附錄XC溶出度測定法進行體外溶出試驗，溶出介質為磷酸鹽緩沖液（pH 6.8），介質體積為200 mL，溫度為（37±0.5）℃，轉速為50 r/min，分別于0.25，0.50，0.75，1.00，1.50，2.00，4.00，6.00 h時各取樣2 mL，并隨即補足等溫度、等量溶出介質，經0.45μm微孔濾膜濾過，用甲醇稀釋1倍，按2.2.1項下色譜條件進樣測定3次，計算各時間點葛根素的溶出質量濃度。體外溶出曲線見圖3 B。可見，在非漏槽條件下，葛根素原料藥與PUE?COS PM的體外溶出曲線相似，2 h后趨于穩(wěn)定；低溫研磨葛根素在0.5 h時的溶出質量濃度達最大值（9.25μg/mL），然后下降并趨于平衡，這是由于低溫研磨后，葛根素粒徑變小，并可能存在部分無定型葛根素，導致溶出質量濃度稍高于葛根素原料藥，晶型發(fā)生轉變后，溶出質量濃度趨向于葛根素原料藥平衡狀態(tài)下的溶出水平；與葛根素原料藥和PUE?COS PM比較，PUE?COS CM中葛根素的體外溶出質量濃度較高，且能長時間維持過飽和狀態(tài)。在1.5 h時，PUE?COS CM中葛根素的溶出質量濃度達最大值（18.31μg/mL），是葛根素原料藥（7.65 μg/mL）的2.39倍（P<0.01）；在1.5～6.0 h間，PUE?COS CM中葛根素的溶出質量濃度無明顯下降，維持長時間的過飽和狀態(tài)。

A.漏槽條件下B.非漏槽條件下圖3葛根素體外溶出曲線A.Under sink condition B.Under non?sink conditionFig.3 Dissolution profiles of PUE in vitro

2.5 穩(wěn)定性試驗

物理穩(wěn)定性：將PUE?COS CM置LHH?350CFS型綜合藥品穩(wěn)定試驗箱，在40℃條件下保存6個月。通過X射線粉末衍射法分析，判斷PUE?COS CM是否發(fā)生晶型轉變，以評價PUE?COS CM的物理穩(wěn)定性。詳見圖4和圖5。由圖4可知，PUE?COS CM在40℃條件下保存6個月均未出現(xiàn)葛根素的晶體特征衍射峰，表明PUE?COS CM在6個月內未發(fā)生晶型轉變，物理穩(wěn)定性良好?？赡苡捎谠赑UE?COS CM中，葛根素與殼寡糖分子間發(fā)生了氫鍵相互作用。由圖5可知，PUE?COS CM放置6個月的溶出趨勢與放置0 d基本一致，且溶出速率良好。這是由于低溫研磨不會引起藥物的熱降解，且葛根素與殼寡糖分子間氫鍵相互作用較強，導致PUE?COS CM物理穩(wěn)定性良好。

圖5 PUE-COS CM 40℃條件下放置0 d和6個月的溶出曲線Fig.5 Dissolution profiles of PUE-COS CM at 40℃for 0 day and six months

化學穩(wěn)定性：按2.1項下方法制備PUE?COS CM，于40℃條件下放置6個月，按2.2.1項下色譜條件進樣測定3次，記錄峰面積，并計算含量。結果新鮮制備的PUE?COS CM中葛根素的含量為（0.506±0.005）g/g，40℃條件下放置6個月的PUE?COS CM中葛根素的含量為（0.503±0.008）g/g，表 明PUE?COS CM在40℃條件下放置6個月的化學穩(wěn)定性良好。

a.0 d b.1個月c.3個月d.6個月圖4 PUE-COS CM 40℃條件下放置6個月的X射線粉末衍射圖a.0 d b.One month c.Three months d.Six monthsFig.4 XRPD patterns of PUE-COS CM at 40℃for six months

3 討論

為了提高難溶性藥物的溶解度/溶出度，有效方法之一為改變藥物晶型，將藥物由晶體狀態(tài)轉變?yōu)闊o定型狀態(tài)［13］。但無定型狀態(tài)為高能態(tài)，熱力學不穩(wěn)定，隨著時間的變化易發(fā)生重結晶，向穩(wěn)定的晶型狀態(tài)轉變。目前，為了增加無定型藥物的穩(wěn)定性，通常將藥物與高分子聚合物或表面活性劑等載體制備成ASD。當藥物與載體混溶性較差時，為了達到藥物的有效治療劑量，一般使用大量的聚合物載體，造成服用量/體積較大。且大量聚合物易吸濕，引起藥物轉晶，降低ASD的穩(wěn)定性。此外，使用大量高分子聚合物或表面活性劑還可能引起胃腸道毒性等問題［14?16］。共無定型是一種新型藥物遞送系統(tǒng)，指由藥物和藥物或藥物和小分子配體組成的二元無定型系統(tǒng)，可有效改善難溶性藥物的溶解度/溶出度，且物理穩(wěn)定性好［17］。共無定型的小分子配體主要包括氨基酸（脯氨酸、精氨酸、苯丙氨酸等）、有機酸（檸檬酸、蘋果酸、酒石酸等）等。其中，低分子量糖類（蔗糖、甘露醇、葡萄糖等）作為配體逐漸用于共無定型。殼寡糖為親水性載體，天然環(huán)保，無毒副作用，生物相容性較好，且具有多種藥理學活性，展現(xiàn)出作為共無定型優(yōu)良配體的潛力，已被廣泛用于藥物制劑開發(fā)和生物醫(yī)學領域，同時可作為吸收增強劑，提高難溶性藥物的生物利用度。

本研究中，通過低溫研磨成功將葛根素與殼寡糖制備成PUE?COS CM，方法簡單易行，并采用多種表征分析技術對PUE?COS CM進行了分析。差示掃描量熱和X射線粉末衍射分析結果表明成功制備了PUE?COS CM，這是由于低溫研磨破壞了葛根素的晶格，導致其轉變?yōu)闊o定型狀態(tài)；傅里葉紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，葛根素與殼寡糖分子間發(fā)生了潛在的氫鍵相互作用；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PUE?COS CM呈不規(guī)則塊狀與顆粒狀，未見葛根素原料藥的長片狀和殼寡糖的球型特征。與葛根素原料藥相比，PUE?COS CM在漏槽條件下葛根素的累積溶出速率更快，在非漏槽條件下的溶出質量濃度更高，且可長時間維持過飽和狀態(tài)。這是由于PUE?COS CM中葛根素和殼寡糖發(fā)生了潛在的分子間氫鍵相互作用，抑制了共無定型中藥物的成核和晶體生長［17?18］。此外，在過飽和系統(tǒng)中，藥物的濃度高于藥物的平衡溶解度，會促進更多游離的藥物被人體吸收，且過飽和狀態(tài)時間維持越長，藥物的吸收效果越好［19］。

將葛根素原料藥和殼寡糖制備成PUE?COS CM，可有效提高葛根素的體外溶出度，且可長時間維持過飽和狀態(tài)，提高難溶性藥物葛根素的生物利用度，且殼寡糖進一步擴大了共無定型的配體類型，為其他新型藥用功能性輔料的開發(fā)和應用提供參考，也為解決其他難溶性藥物的溶解度/溶出度及生物利用度問題提供新的思路。