丙泊酚麻醉對孕中期大鼠子代學習記憶功能及HDAC2-CREB-NR2B信號通路的影響*

梅 靜，馬 琳，徐桂萍

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，新疆 烏魯木齊 830001）

孕中期是胎兒中樞神經(jīng)等功能組織形成的關鍵階段，孕期手術會導致處于孕中期胎兒的中樞神經(jīng)發(fā)育遭受不利影響的可能性增加［1］。更多的臨床研究和動物研究均關注了孕中期手術中麻醉劑暴露對新生兒認知功能的影響及其內(nèi)在作用機制［2?3］。孕中期使用麻醉劑對動物胎兒腦部發(fā)育及空間學習能力和記憶能力的影響至今尚無統(tǒng)一結(jié)論［4?5］。丙泊酚是外科手術中使用頻率較高的靜脈麻醉劑，可能對子代的長期行為產(chǎn)生影響，但結(jié)果仍存在不確定性［6］。研究表明，妊娠期暴露中高劑量的丙泊酚對子代空間學習與記憶能力的影響明顯高于低劑量［7］。增強海馬突觸可塑性可通過增加神經(jīng)營養(yǎng)和生長因子的水平介導神經(jīng)發(fā)生，從而改善空間學習和記憶能力［8］。突觸后密度蛋白95（PSD95）和生長相關蛋白43（GAP43）是突觸形成和神經(jīng)發(fā)育過程中必不可少的支架蛋白和促生長蛋白。組蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）?環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白（CREB）介導天冬氨酸受體亞型（NR2B）信號在學習和記憶缺陷、抑郁、癲癇和阿爾茨海默病中起著關鍵作用［9］，且NR2B的C末端可與PSD95蛋白PDZ域特異性結(jié)合。目前，丙泊酚暴露引發(fā)的子代學習和記憶缺失中HDAC2?CREB?NR2B信號通路扮演的角色仍不清楚。本研究中探討了孕中期大鼠母體丙泊酚暴露對子代海馬區(qū)HDAC2?CREB?NR2B信號通路的影響，以及該信號通路對子代空間學習和記憶能力的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：XR?XM101型視頻跟蹤系統(tǒng)（上海移動數(shù)據(jù)有限公司）；ECGenieTM型無創(chuàng)電遙測系統(tǒng)（美國Mouse Specifics公司）。

試藥：GAP43（批號為20200102X），PSD95（批號為20180982B），HDAC2（批號為20190709X），磷酸化HDAC2（p?HDAC2，批號為20190904A），CREB（批號為20190315Y），磷 酸 化CREB（p?CREB，批 號 為20200992X），NR2B（批號為20190903B），內(nèi)參蛋白磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的第一抗體（批號為20200476Y）和對應第二抗體羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）H＆L（HRP，批號為A2021030X1），均購于美國Abcam公司；中性紅染色試劑盒（批號為19?3X?09?03），丙泊酚（批號為2012?02?12X），均購于美國Sigma Aldrich公司；羅米地辛（美國Selleck化學公司，批號為12R?C?03）。

動物：36只SPF級SD雌性大鼠，6周齡，體質(zhì)量（150±10）g；12只雄性大鼠，6周齡，體質(zhì)量（170±10）g，均購于新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心，生產(chǎn)許可證號為SYXK（新）2016?0001，動物合格證號為NO.65000200000364。所有動物均飼養(yǎng)于（24±1）℃的環(huán)境中，光照/黑暗周期為12 h/12 h，動物自由獲得食物和水。所有實驗程序和實驗方案均獲得我院實驗動物倫理委員會批準，并按美國國立衛(wèi)生研究院《實驗動物的護理和使用指南》原則，使所用動物的總數(shù)及動物的痛苦最小化。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠的麻醉劑暴露、剖腹探查術

前1 d的18：00，將3只雌鼠與1只隨機選擇的雄鼠關于一籠中［2］，共12籠，自由交配，24 h后通過陰道涂片檢測到雌鼠的陰道栓子或精子，認為雌鼠在孕0 d，以此推算并選擇孕期為14 d的孕鼠36只。于自制透明塑料瓶中固定孕期為14 d的孕鼠，行頸靜脈穿刺，放置靜脈導管，并將孕鼠隨機分為對照組和丙泊酚組，各18只。對照組經(jīng)頸靜脈注射生理鹽水（2 mL/kg），丙泊酚組經(jīng)頸靜脈注射1.5%丙泊酚（2 mL/kg）行麻醉誘導，以20 mg/（kg·h）的速率持續(xù)靜脈泵注丙泊酚，并行剖腹探查術，麻醉時間為4 h。

剖腹探查術：丙泊酚組大鼠麻醉誘導后剪去腹毛，暴露皮膚，使用75%乙醇消毒3遍，以0.125%布比卡因0.2 mL局部麻醉，行腹部3 cm縱切。無菌探查腹腔范圍，包括膈肌（肝臟）、盆腔、膀胱、兩側(cè)腹中線水平（脾臟或腎臟）。用2 mL 37℃無菌生理鹽水沖洗腹腔，吸凈液體，用75%乙醇消毒切口，用4?0縫線間斷縫合腹膜和肌層，用3?0縫線間斷縫合皮膚并消毒，擦干切口血漬，于25 min內(nèi)完成手術。大鼠蘇醒后放回原籠，繼續(xù)妊娠。

監(jiān)測：丙泊酚組動物麻醉后用ECGenieTM心電圖分析系統(tǒng)監(jiān)測心電圖、血壓、血氧飽和度，麻醉結(jié)束后立即取母鼠髂外靜脈行血氣分析。質(zhì)控：以翻正反射消失作為動物麻醉誘導成功的標準。孕鼠麻醉期間監(jiān)測血氧飽和度、血壓、心率，剔除血氧飽和度低于95%或平均動脈壓超出或低于基礎值20%的動物。最終從對照組和丙泊酚組中隨機選擇12只血氧飽和度、血壓、心率均正常的孕中期大鼠，繼續(xù)妊娠。

生殖發(fā)育參數(shù)：從孕0 d開始到子代出生后，統(tǒng)計兩組大鼠的妊娠期，以及子代大鼠（簡稱子鼠）的性別比例、數(shù)量和體質(zhì)量。

1.2.2 子鼠學習和記憶功能試驗

子鼠出生后30 d，各組母鼠所產(chǎn)雄性子鼠進行學習和空間記憶檢測（為排除發(fā)情周期對嚙齒動物行為的影響，僅對雄性子鼠進行行為測試）。采用Morris水迷宮（MWM）系統(tǒng)檢測子鼠的學習和記憶功能。MWM系統(tǒng)直徑為1.6 m，深度為0.6 m，第Ⅱ象限中有可移動的圓柱形平臺（直徑為0.15 m），置固定的測試間內(nèi)，每日8：00開始測試，水溫（23±1）℃，第Ⅱ象限的平臺在水下1 cm，每日訓練1次。第1～5天（出生后30～34 d）觀察子鼠的定位航行能力，從離平臺最遠的第Ⅲ象限選擇一固定入水點將子鼠背對平臺放入水中；若90 s內(nèi)子鼠找到平臺，則將其留在平臺上20 s；若90 s內(nèi)未能找到平臺，將其引上平臺同樣停留20 s。記錄子鼠尋找到平臺的時間，即為逃避潛伏期；若90 s內(nèi)未找到平臺，按90 s計算。第6天（出生后35 d）行空間探索實驗，撤去水中平臺，于固定的進入點將子鼠放入水中，記錄90 s內(nèi)在第Ⅱ象限的停留時間及穿越原平臺的次數(shù)，即為記憶潛伏期。以視頻跟蹤系統(tǒng)（上海移動數(shù)據(jù)有限公司）記錄游泳速度和逃生潛伏期，每次實驗后，大鼠毛發(fā)干燥后用熱燈溫暖5 min，放回常規(guī)籠。取同一母鼠所產(chǎn)所有子鼠成績的平均值作為最終測定結(jié)果。

1.2.3 注射抑制劑子鼠學習和空間記憶測試

取丙泊酚組子鼠（出生后第36天，測試完成后1 d）6只，腹膜內(nèi)注射2.5 mL HDAC2的特異性抑制劑Romidepsin 2.5 mg/kg，每日1次，持續(xù)7 d（出生后36～42 d），作為丙泊酚+Romidepsin組。取6只出生后36 d的丙泊酚組子鼠腹腔注射2.5 mL生理鹽水，每日1次，持續(xù)7 d，作為丙泊酚+Saline組。出生后第43～48天，以MWM法檢測子鼠的學習與記憶能力。

1.2.4 蛋白免疫印跡（Werstern blot）法分析

取對照組、丙泊酚組、丙泊酚+Romidepsin組及丙泊酚+Saline組子鼠，測試完成后用斷頭法處死，分離腦海馬組織，勻漿，采用Werstern Blot法測定GAP43，PSD95，HDAC2，p?HDAC2，CREB，p?CREB，NR2B，GAPDH的表達水平。經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE）分離，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。將膜與GAP43（1∶600），PSD95（1∶500），HDAC2（1∶900），p?HDAC2（1∶500），CREB（1∶600），p?CREB（1∶800），NR2B（1∶1 000），GAPDH（1∶1 000）的一抗和對應的二抗孵育后。通過增強化學發(fā)光法使蛋白條帶顯色，并通過ImageJ軟件進行定量，每組3只，重復3次。

1.2.5 中性紅染色評估海馬神經(jīng)元丟失程度

隨機選取丙泊酚+Romidepsin組及丙泊酚+Saline組子鼠，各3只，先后用鹽水和4%多聚甲醛經(jīng)心血灌流，取出腦組織，于4℃下以4%多聚甲醛固定，過夜。使用?20℃冷凍切片機將冷凍的腦組織切成30μm厚的冠狀切片，于載玻片上風干，切片在1%中性紅溶液中孵育1 min，檢測細胞活力，評估海馬神經(jīng)元丟失程度。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件處理。計量資料（平臺穿越次數(shù)、原平臺所在象限停留時間、體質(zhì)量、均出生總子鼠數(shù)、細胞丟失程度以及p?HDAC2，p?CREB，NR2B）兩組間的差異以±s表示，采用單因素方差分析（one?way ANOVA），當one?way ANOVA分析有差異時，采用LSD?t進行多重比較；水迷宮逃避潛伏期數(shù)據(jù)采用重復測量兩因素方差分析（RMtwo?way ANOVA），以種鼠或子鼠處理為主體間因素，MWM實驗訓練天數(shù)（時間）為主體內(nèi)因素，當RMtwo?way ANOVA分析有差異時，采用PostHoctests（LSD?t）行多重比較。計數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 對生殖和子代發(fā)育的影響

與對照組比較，丙泊酚組大鼠的妊娠期天數(shù)、產(chǎn)仔數(shù)量、雄/雌比、雄性子鼠的體質(zhì)量差異均不顯著（P>0.05），表明孕中期接觸丙泊酚未對大鼠生殖及子代發(fā)育造成影響。詳見表1。

表1 對照組和丙泊酚組大鼠生殖和發(fā)育參數(shù)（±s，n=12）Tab.1 Reproductive and developmental parameters of the rats in the control group and the propofol group（±s，n=12）

表1 對照組和丙泊酚組大鼠生殖和發(fā)育參數(shù)（±s，n=12）Tab.1 Reproductive and developmental parameters of the rats in the control group and the propofol group（±s，n=12）

組別對照組丙泊酚組t值P值妊娠期（d）21.60±0.04 20.20±0.91 0.031 0.822產(chǎn)仔數(shù)（只）11.36±1.78 11.31±1.82 0.447 0.681雄/雌比1.03±0.17 1.15±0.42 0.955 0.322雄性子鼠1～30 d體質(zhì)量（g）1 d 7.08±0.04 7.01±0.06 1.314 0.189 7 d 14.82±0.05 14.73±0.06 1.020 0.366 14 d 34.45±0.19 35.71±0.63 0.712 0.473 21 d 50.76±0.42 50.15±0.37 0.607 0.341 30 d 121.38±0.56 125.15±0.77 1.053 0.217

2.2 對子代學習記憶的影響

與對照組比較，丙泊酚組子鼠的逃避潛伏期顯著延長（P<0.05），平臺穿越次數(shù)顯著減少，第Ⅱ象限停留時間顯著縮短（P<0.05）。詳見圖1至圖3。

圖1 對照組與丙泊酚組子鼠逃避潛伏期注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2至圖3和表2同。Fig.1 Escape latency of the offspring rats in the control group and the propofol groupNote：Compared with those in the control group，*P<0.05，**P<0.01（for Fig.1?3 and Tab.2）.

圖3 對照組和丙泊酚組子鼠各象限停留時間Fig.3 Residence time in each quadrant of the offspring rats in the control group and the propofol group

2.3 對子代海馬組織CREB信號通路的影響

與對照組比較，丙泊酚組子鼠的海馬組織中HDAC2和p?HDAC2的蛋白表達顯著上調(diào)，p?CREB和NR2B的蛋白表達顯著下調(diào)（P<0.05）。詳見圖4和表2。

表2 對照組和丙泊酚組子鼠HDAC2，p-HDAC2，CREB，p-CREB，NR2B蛋白表達水平比較Tab.2 Comparison of the expression levels of HDAC2，p-HDAC2，CREB，p-CREB and NR2B protein of the offspring rats in the control group and the propofol group

2.4 Romidepsin通過調(diào)節(jié)HDAC2-CREB-NR2B信號通路影響孕中期丙泊酚暴露后子代的學習與記憶能力

與丙泊酚+Saline組比較，丙泊酚+Romidepsin組子鼠的逃避潛伏期縮短，第Ⅱ象限停留時長和平臺穿越次數(shù)顯著增加（P<0.05）。詳見圖5和表3。與丙泊酚+Saline組比較，丙泊酚+Romidepsin組子鼠海馬組織中的p?HDAC2的蛋白表達顯著下調(diào)（P<0.05），p?CREB，NR2B，GAP43，PSD95的蛋白表達均顯著上調(diào)（P<0.05）。詳見圖6和表4。與丙泊酚+Saline組比較，丙泊酚+Romidepsin組子鼠缺失的海馬神經(jīng)元部分恢復，但未達到健康組大鼠的神經(jīng)元數(shù)量。詳見圖7。

圖7 中性紅染色觀察各組子鼠海馬組織神經(jīng)元細胞缺失程度（×200）Fig.7 Comparison of the neuronal loss extent in the hippocampus of the offspring rats in each group（Neutral red staining，×200）

表3 各組子鼠Morris水迷宮測試結(jié)果（±s）Tab.3 Results of MWM test for the offspring rats in each group（±s）

表3 各組子鼠Morris水迷宮測試結(jié)果（±s）Tab.3 Results of MWM test for the offspring rats in each group（±s）

組別對照組丙泊酚組丙泊酚+Saline組丙泊酚+Romidepsin組F值P值平臺穿越次數(shù)（次）3.989±0.219 2.345±0.202 2.491±0.157 3.952±0.286*127.502 0.012第Ⅱ象限停留時長（s）26.448±0.107 15.925±0.059 14.878±0.083 26.354±0.084*95.952 0.016

表4 各組子鼠HDAC2，p-HDAC2，CREB，p-CREB，NR2B，PSD95，GAP43蛋白表達水平比較（±s）Tab.4 Comparison of expression levels of HDAC2，p-HDAC2，CREB，p-CREB，NR2B PSD95 and GAP43 protein of the offspring rats in each group（±s）

表4 各組子鼠HDAC2，p-HDAC2，CREB，p-CREB，NR2B，PSD95，GAP43蛋白表達水平比較（±s）Tab.4 Comparison of expression levels of HDAC2，p-HDAC2，CREB，p-CREB，NR2B PSD95 and GAP43 protein of the offspring rats in each group（±s）

組別對照組丙泊酚組丙泊酚+Saline組丙泊酚+Romidepsin組F值P值HDAC2 1.000±0.100 0.981±0.075 0.969±0.086 0.971±0.062 13.525 0.106 p?HDAC2 1.000±0.121 2.185±0.115 2.036±0.221 1.089±0.318*185.415 0.028 CREB 1.000±0.045 0.974±0.033 1.104±0.028 0.987±0.092 10.362 0.587 p?CREB 1.000±0.012 0.515±0.025 0.502±0.032 0.869±0.022*102.621 0.009 NR2B 1.001±0.080 0.312±0.041 0.364±0.058 0.855±0.023*197.203 0.005 PSD95 1.001±0.021 0.151±0.021 0.166±0.074 0.677±0.029*235.851 0.0003 GAP43 1.001±0.029 0.233±0.052 0.241±0.071 0.662±0.036*321.369 0.0002

圖5 各組子鼠逃避潛伏期測試結(jié)果注：與丙泊酚+Saline組比較，*P<0.05。表3和表4同。Fig.5 Results of escape latency test for the offspring rats in each groupNote：Compared with those in the propofol+Saline group，*P<0.05（for Fig.5 and Tab.3?4）.

1.對照組2.丙泊酚組圖4對照組和丙泊酚組子鼠HDAC2，p-HDAC2，CREB，p-CREB，NR2B蛋白表達水平1.The control group 2.The propofol groupFig.4 Comparison of the expression levels of HDAC2，p-HDAC2，CREB，p-CREB and NR2B protein of the offspring rats in the control group and the propofol group

圖2 對照組和丙泊酚組子鼠平臺穿越次數(shù)Fig.2 The times of crossing platform of the offspring rats in the control group and the propofol group

3 討論

孕中期為胎兒腦發(fā)育的關鍵時期，全身麻醉藥物對腦發(fā)育期中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有潛在神經(jīng)毒性作用。本研究結(jié)果顯示，HDAC2抑制劑Romidepsin可抑制HDAC2蛋白的表達水平，改善孕中期丙泊酚麻醉后對子鼠學習與記憶功能的負面影響。孕中期大鼠頸內(nèi)注射1.5%丙泊酚暴露，并以20 mg/（kg·h）的速率持續(xù)靜脈泵注丙泊酚4 h，對大鼠的生殖和子代的發(fā)育均無影響，但海馬組織的突觸可塑性標記物表達減少，且子鼠的學習與記憶能力明顯變差。其中，使用Romidepsin激活CREB?NR2B信號，改善了子鼠的學習與記憶缺失。

1.對照組2.丙泊酚組3.丙泊酚+Saline組4.丙泊酚+Romidepsin組圖6各組子鼠HDAC2，p-HDAC2，CREB，p-CREB，NR2B，PSD95，GAP43蛋白表達水平1.The control group 2.The propofol group 3.The propofol+Saline group 4.The propofol+Romidepsin groupFig.6 Comparison of the expression levels of HDAC2，p-HDAC2，CREB，p-CREB，NR2B PSD95 and GAP43 protein of offspring rats in each group

丙泊酚是臨床實踐中廣泛應用的鎮(zhèn)靜劑，是一種抑制GABA能神經(jīng)元的藥物。研究表明，患者在接受丙泊酚鎮(zhèn)靜的麻醉下進行手術時，輕度鎮(zhèn)靜與深度鎮(zhèn)靜均能導致其記憶缺失甚至譫妄，但輕度麻醉的發(fā)生率較深度麻醉降低50%，提示丙泊酚可能是誘導患者神經(jīng)退行性疾病的重要危險因素［10］。麻醉劑對未成熟的神經(jīng)元細胞有毒性作用，懷孕小鼠中、高劑量丙泊酚單次暴露2 h可損害子代的學習和記憶功能［11?12］。然而，丙泊酚應用于孕中期大鼠的手術中是否會對子鼠的認知能力造成影響仍不明確。本研究結(jié)果顯示，孕中期大鼠暴露于丙泊酚，會導致子代的學習和記憶功能障礙。學習和記憶障礙是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害非常重要的癥狀，也是阿爾茨海默病和帕金森病的主要特征［9，13］。目前，尚無可靠的藥物來治療此類具有學習和記憶缺陷的神經(jīng)退行性疾病。本研究中使用HDAC2的抑制劑Romidepsin抑制HDAC2后，子鼠缺失的學習和記憶能力部分恢復。提示HDAC2可能是丙泊酚誘導子代認知功能障礙的關鍵調(diào)節(jié)靶點，通過靶向調(diào)節(jié)此信號有助于改善丙泊酚暴露導致的子代學習和記憶缺失。

突觸可塑性對于記憶的形成和記憶存儲至關重要［14］。海馬區(qū)HDAC2?CREB?NR2B信號通路與海馬區(qū)神經(jīng)突觸可塑性調(diào)節(jié)密切相關，在HDAC家族成員中，HDAC2起調(diào)節(jié)突觸可塑性和對神經(jīng)回路產(chǎn)生持久變化的作用，對學習和記憶產(chǎn)生負面影響［15］，HDAC2作為組蛋白脫乙?；?，被抑制后可恢復學習功能，并促進神經(jīng)退變動物長期記憶的恢復［16］。抑制HDAC2可為神經(jīng)退行性疾病引起的記憶障礙提供治療途徑。HDAC2的過度磷酸化可降低cAMP應答元件結(jié)合蛋白CREB的磷酸化，導致CREB蛋白水平降低［12］。使用HDAC2的抑制劑SAHA后，可升高乙?；M蛋白水平，并伴隨p?CREB與NR2B亞基的啟動子中結(jié)合位點的結(jié)合增強，導致大鼠海馬中NR2B蛋白水平升高，通過維持突觸可塑性改善機體的認知功能障礙［15］。本研究結(jié)果顯示，使用HDAC2抑制劑Romidepsin可激活CREB?NR2B信號，明顯恢復丙泊酚麻醉孕中期大鼠導致的子鼠的空間學習和記憶缺陷，并檢測到突觸可塑性標志物GAP43和PSD95的表達明顯上調(diào)。提示HDAC2?CREB?NR2B信號通路通過調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性改善子鼠的認知障礙；母體被麻醉劑暴露后，海馬神經(jīng)元中與NR2B共定位的PSD95表達水平降低，而上調(diào)PSD95可改善子代的空間和學習記憶缺陷［17］，且PSD95和NR2B的表達水平降低可能會導致長期自發(fā)性反復的行為缺陷［18］?？梢?，HDAC2?CREB?NR2B信號通路調(diào)節(jié)的突觸可塑性與空間學習和記憶功能密切相關。

研究表明，子代海馬組織的神經(jīng)元損失程度在丙泊酚暴露后明顯增加［12］。本研究中使用HDAC2抑制劑Romidepsin抑制其激活后，海馬組織的神經(jīng)元缺失程度減少，提示海馬神經(jīng)元的活性可能受到HDAC2?CREB?NR2B信號通路的調(diào)節(jié)，與文獻［15］的報道一致。

本研究存在的局限性，首先，選擇大鼠的樣本數(shù)較少，需擴大樣本量；其次，為避免子鼠受發(fā)情期影響，子代僅選用雄性大鼠，文獻［19］指出，麻醉藥物對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性可能存在性別差異，故選擇雄性大鼠作為實驗對象。

綜上所述，丙泊酚麻醉孕中期大鼠引發(fā)子代的認知障礙，其關鍵作用機制之一是激活HDAC2并抑制CREB?NR2B信號，抑制HDAC2導致CREB?NR2B信號的激活可能給治療孕中期丙泊酚暴露致子鼠空間學習和記憶能力的缺陷提供幫助。