年齡及孕周對(duì)雙胎妊娠孕婦胎兒游離DNA濃度的影響

李珊珊 張 萌 王 威 王 昕 陳玉嬌 陰赪宏 王一鵬

隨著高齡高危孕婦比例增加和輔助生殖技術(shù)的蓬勃發(fā)展，近年來，雙胎妊娠的出生率從2.2%增長到3.0%，增加了雙胎妊娠產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷的復(fù)雜性和難度[1,2]。由于傳統(tǒng)的產(chǎn)前血清學(xué)篩查技術(shù)對(duì)雙胎妊娠孕婦胎兒染色體非整倍體篩查能力有限，既往雙胎妊娠孕婦多通過侵入性產(chǎn)前診斷排除胎兒染色體病。但傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查的假陽性率及侵入性產(chǎn)前診斷流產(chǎn)、感染等發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性，給孕婦造成焦慮和恐慌，也降低了孕婦對(duì)侵入性產(chǎn)前診斷的依從性[3～5]。近年來隨著分子遺傳技術(shù)的飛速發(fā)展，無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(non-invasive prenatal test, NIPT)等技術(shù)受到越來越多的關(guān)注和應(yīng)用。有研究表明，相較于傳統(tǒng)的血清學(xué)生化指標(biāo)的產(chǎn)前篩查方法，NIPT檢測(cè)雙胎非整倍體的準(zhǔn)確性更高，假陽性率更低，其檢測(cè)雙胎非整倍體的準(zhǔn)確性接近于單胎檢測(cè)[6]。

NIPT檢測(cè)流程較為復(fù)雜，其質(zhì)量控制影響因素較多，其中胎兒游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)濃度與NIPT的準(zhǔn)確性密切相關(guān)，為保證NIPT的準(zhǔn)確性，cfDNA濃度至少達(dá)到4%的最低檢測(cè)濃度標(biāo)準(zhǔn)[7,8]。本研究擬對(duì)筆者醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行NIPT的雙胎妊娠孕婦就診及測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析，評(píng)價(jià)雙胎妊娠孕婦進(jìn)行NIPT的cfDNA濃度可能存在的影響因素。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：回顧性研究2019年1～12月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院就診，接受NIPT的3900例孕婦臨床信息，其中雙胎妊娠孕婦244例，單胎妊娠孕婦3656例。依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室NIPT的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)檢測(cè)樣本cfDNA濃度<3.5%時(shí)，判斷為不合格，經(jīng)過孕婦知情同意后進(jìn)行二次采血檢測(cè)。當(dāng)二次采血檢測(cè)cfDNA濃度≥3.5%，判為合格，并以二次采血樣本作為檢測(cè)對(duì)象進(jìn)入之后測(cè)序數(shù)據(jù)分析；當(dāng)二次采血檢測(cè)cfDNA濃度<3.5%，判為檢測(cè)失敗，無法得出準(zhǔn)確測(cè)序數(shù)據(jù)分析結(jié)果。本研究已經(jīng)通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：2019-KY-046-01)，依據(jù)《孕婦外周血游離胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》,所有參與研究的孕婦均簽署知情同意書接受NIPT檢測(cè)。

2.研究方法：分組回顧性整理歸納雙胎/單胎妊娠孕婦NIPT檢測(cè)的篩查年齡、采樣孕周分布，分析不同篩查年齡、采樣孕周的雙胎/單胎妊娠孕婦cfDNA濃度的差異。

結(jié) 果

1.研究對(duì)象基本特征：依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室NIPT的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，排除連續(xù)兩次檢測(cè)cfDNA濃度<3.5%的樣本，即入組分析雙胎妊娠孕婦241例和單胎妊娠孕婦對(duì)照3639例。雙胎妊娠孕婦平均篩查年齡為31.72±3.45歲，平均采樣孕周為15.30±1.94周，平均cfDNA濃度為8.84%±3.96%；單胎妊娠孕婦平均篩查年齡為33.14±3.73歲，平均采樣孕周為16.19±2.94周，平均cfDNA濃度為8.45%±3.50%(表1)。

雙胎妊娠孕婦中篩查年齡25～29歲、30～34歲占比較高，分別為66例(27.39%)和119例(49.38%)；單胎妊娠孕婦對(duì)照組30～34歲、35～39歲占比較高，分別為1482例(40.73%)和1369例(37.62%)。

表1 雙胎/單胎妊娠孕婦一般資料分析

雙胎/單胎妊娠孕婦，采樣孕周均集中在12～19周，16～17周占比最高，分別為96例(39.83%)和1022例(28.08%)。

2.雙胎/單胎妊娠孕婦NIPT篩查年齡對(duì)cfDNA濃度的影響：以不同年齡分組，20～24歲、25～29歲、30～34歲、35～39歲和≥40歲年齡組的雙胎妊娠孕婦與單胎的cfDNA濃度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。

圖1 不同篩查年齡的雙胎/單胎妊娠孕婦cfDNA濃度對(duì)比

3.雙胎/單胎妊娠孕婦NIPT采樣孕周對(duì)cfDNA濃度的影響：以不同采樣孕周分組，12～13周、14～15周和≥20周組的雙胎與單胎妊娠孕婦的cfDNA濃度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，16～17周、18～19周組的雙胎妊娠孕婦cfDNA濃度高于同組單胎(P<0.05，圖2)。

圖2 不同采樣孕周的雙胎/單胎妊娠孕婦cfDNA濃度對(duì)比

4.雙胎/單胎妊娠孕婦NIPT建庫成功率對(duì)比：244例雙胎妊娠孕婦中，7例因cfDNA濃度<3.5%首次采血建庫檢測(cè)不合格，其成功率為97.13%。經(jīng)知情同意后對(duì)首次采血建庫不合格孕婦行二次采血建庫，4例檢測(cè)成功，其成功率為57.14%。

3656例單胎妊娠孕婦中，34例因cfDNA濃度<3.5%首次采血建庫檢測(cè)不合格，其成功率為99.07%。經(jīng)知情同意后對(duì)首次采血建庫不合格孕婦行二次采血建庫，17例檢測(cè)成功，其成功率為50.00%。

雙胎妊娠孕婦NIPT首次采血建庫成功率低于單胎(P<0.05)，單胎妊娠孕婦NIPT首次采血建庫成功的可能性高于雙胎；雙胎妊娠孕婦二次采血建庫成功率與單胎比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；雙胎與單胎妊娠孕婦NIPT總體成功率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 雙胎/單胎妊娠孕婦NIPT建庫成功率差異分析

討 論

中國是出生缺陷高發(fā)國之一，出生缺陷發(fā)生率為5.6%，每年新增出生缺陷數(shù)約為90萬例，出生缺陷兒給社會(huì)和家庭帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力[9]。染色體病是造成出生缺陷的重要原因之一，患者常常具有智力低下、器官畸形及性功能低下等一系列臨床癥狀。研究表明，雙胎妊娠發(fā)生染色體異常和嚴(yán)重并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于單胎妊娠[10]。傳統(tǒng)單胎妊娠的產(chǎn)前篩查是通過血清學(xué)生化指標(biāo)和超聲影像學(xué)篩查評(píng)估胎兒染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)性，但雙胎妊娠母體血清生化指標(biāo)水平受多個(gè)胎兒的影響，異常值被正常胎兒平均，使其產(chǎn)前篩查方式更具有復(fù)雜性，其血清學(xué)生化篩查的準(zhǔn)確性不如單胎準(zhǔn)確，所以臨床多采取侵入性產(chǎn)前診斷的方式檢測(cè)胎兒染色體作為雙胎妊娠產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。不同于傳統(tǒng)血清學(xué)篩查，NIPT技術(shù)具有無創(chuàng)性、檢出率高、敏感度高等特點(diǎn)，對(duì)雙胎妊娠孕婦也有較高的篩查價(jià)值，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)篩查方法。

NIPT檢測(cè)流程較為復(fù)雜，因采樣失敗、cfDNA濃度低、生物信息學(xué)等測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控不合格等均能造成檢測(cè)失敗。其中cfDNA濃度是影響NIPT檢測(cè)的成功率和準(zhǔn)確性重要因素。為保證NIPT的成功率和準(zhǔn)確性，cfDNA濃度至少達(dá)到4%的最低檢測(cè)濃度標(biāo)準(zhǔn)。孕婦外周血中cfDNA，是因胎兒細(xì)胞通過胎盤進(jìn)入母體血循環(huán)被母體免疫系統(tǒng)破壞，致其DNA以游離的形式存在于母體外周血中。有研究分析，與單胎比較，雙胎妊娠孕婦NIPT的cfDNA檢測(cè)失敗受孕婦年齡、孕周、雙絨毛膜雙胎等因素影響[11,12]。

目前，我國依據(jù)《中華人民共和國母嬰保健法實(shí)施辦法》、《產(chǎn)前診斷技術(shù)管理辦法》及《雙胎妊娠產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范(2021年更新版)》等要求，無論單胎或雙胎妊娠，產(chǎn)前篩查的年齡仍按照其適用指征，預(yù)產(chǎn)期年齡≥35歲的孕婦推薦進(jìn)行產(chǎn)前診斷[13～15]。有研究發(fā)現(xiàn)，31歲的雙胎妊娠孕婦與35歲單胎妊娠孕婦胎兒患染色體非整倍體三體綜合征的風(fēng)險(xiǎn)一致，建議修正雙胎妊娠產(chǎn)前診斷的年齡[16]。2000年，加拿大婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(huì)(Society of Obstetricians and Gynaecologists of Canada,SOGC)發(fā)布建議32歲以上的雙絨毛膜雙胎妊娠孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷[17]。根據(jù)本研究數(shù)據(jù)分析顯示，雙胎妊娠孕婦NIPT檢測(cè)篩查年齡不同于單胎，主要集中在25～34歲，而單胎妊娠孕婦的篩查年齡主要集中在30～39歲。雖然雙胎/單胎妊娠的篩查年齡分布不同，但不同篩查年齡組雙胎妊娠孕婦的cfDNA濃度與單胎比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，除外≥40歲組，其他不同年齡組cfDNA濃度均可達(dá)到8%以上，25～29歲組其cfDNA濃度均值達(dá)到9%以上。所以建議對(duì)于雙胎妊娠孕婦可根據(jù)其產(chǎn)前診斷等臨床指征及考慮其個(gè)人意愿等情況，可選擇適當(dāng)提前NIPT的篩查年齡，以保證NIPT檢測(cè)的成功率和準(zhǔn)確性。

除外個(gè)體差異，一般來講孕婦外周血中cfDNA濃度會(huì)隨著其孕周增加而增加，與采樣孕周呈正相關(guān)[18]。本研究中，NIPT檢測(cè)雙胎、單胎妊娠采樣孕周均集中在12～19周，其中16～17周占比最高；在不同采樣孕周，雙胎妊娠孕婦cfDNA濃度均高于單胎孕婦，在不同采樣孕周組的cfDNA濃度均已經(jīng)達(dá)到8%以上，達(dá)到4%的單胎最低檢測(cè)濃度標(biāo)準(zhǔn)的2倍以上，且當(dāng)采樣孕周為18周及以上時(shí)，其cfDNA濃度均值達(dá)到10%以上，為單胎妊娠的同孕周組近1.25倍。故建議以臨床指征為基礎(chǔ)，對(duì)于雙胎妊娠孕婦可適當(dāng)延后采樣孕周，保證NIPT檢測(cè)的成功率和準(zhǔn)確性。

有研究發(fā)現(xiàn)，NIPT檢測(cè)孕婦中因cfDNA濃度低而造成檢測(cè)失敗占0.1%～6.1%，與單胎妊娠比較，雙胎妊娠的cfDNA檢測(cè)失敗率升高[11,19]。本研究因cfDNA濃度低于3.5%引起雙胎妊娠孕婦NIPT的失敗率為1.23%，符合2016年我國頒布的《國家衛(wèi)生計(jì)生委辦公廳關(guān)于有序開展孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷工作的通知》對(duì)檢測(cè)失敗<5%的要求。本研究中，而雙胎妊娠NIPT檢測(cè)首次采血建庫成功率低于單胎(P<0.05)，單胎妊娠孕婦NIPT檢測(cè)首次采血建庫成功的可能性高于雙胎；經(jīng)過二次采血后，雙胎與單胎妊娠孕婦NIPT總體成功率分別為99.54%和98.77%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明對(duì)于雙胎妊娠，可通過適當(dāng)延后采樣孕周，提高檢測(cè)的cfDNA濃度以提高NIPT的成功率。

目前臨床應(yīng)用雙胎妊娠NIPT檢測(cè)多是采用孕婦外周血中胎兒游離的總DNA含量作為cfDNA濃度來進(jìn)行評(píng)估，無法分辨出雙胎中單一cfDNA所占的比例。但因雙胎妊娠的遺傳的復(fù)雜性，單卵雙胎因其相同的遺傳背景，適用于4%的單胎最低檢測(cè)濃度標(biāo)準(zhǔn)；而雙卵雙胎的遺傳物質(zhì)不一致，而孕婦外周血總游離DNA含量達(dá)到最低檢測(cè)4%的濃度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，結(jié)果可能被所占比例較大的胎兒結(jié)果所掩蓋，造成假陽性或假陰性的結(jié)果[20]。鑒于雙胎妊娠特殊性和其NIPT檢測(cè)的局限性，應(yīng)用NIPT作為產(chǎn)前篩查檢測(cè)時(shí)，應(yīng)充分知情告知雙胎妊娠孕婦其技術(shù)不能檢測(cè)所有染色體的異常，不能替代侵入性產(chǎn)前診斷。同時(shí)，雙胎妊娠孕婦cfDNA個(gè)體差異較大，可根據(jù)其臨床指征，對(duì)雙胎妊娠孕婦的NIPT篩查年齡及孕周做出適宜選擇，適當(dāng)提前NIPT篩查年齡、延后采樣孕周，以減少因cfDNA濃度不足造成NIPT的檢測(cè)失敗。