自噬激動劑LYN-1604在肝細胞炎性損傷中的保護作用

張璐懿 石春霞 陳 倩 龔作炯

肝臟可由于各種致病因素而導致損傷，肝損傷是多數肝臟疾病共有的狀態(tài)，嚴重的肝損傷可導致急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)的發(fā)生。ALF為多種因素導致的短時間內肝細胞大量死亡的結局，肝臟代謝解毒功能嚴重障礙，并可在短期內導致死亡或進行肝移植[1]。ALF患者常伴有嚴重的腸道微生態(tài)失衡，引起腸道內毒素血癥[2]。這樣的環(huán)境刺激免疫細胞產生大量炎性細胞因子如TNF-α等，在肝細胞死亡中起著重要的作用[3]。D-Gal是一種氨基糖，在肝臟中通過半乳糖途徑代謝，具有較強的肝特異性毒性作用，可引起嚴重的肝細胞壞死，常用來對肝細胞造模[4]。TNF-α/ D-Gal可用來聯合誘發(fā)體外肝細胞炎性損傷模型[5]。自噬是將多余或有害的物質和細胞器隔離在自噬體中并與溶酶體融合后降解的過程。自噬的起始是ULK1。LYN-1604是ULK1的潛在激動劑，其相關研究僅有在三陰乳腺癌、干眼癥和神經系統(tǒng)疾病中有少數報道。本研究主要探討LYN-1604在體外肝細胞炎性損傷模型中的作用。

材料與方法

1.實驗材料與試劑:正常人肝L02細胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學)，TNF-α(貨號H8916)和D-Gal(貨號G0500)購自美國Sigma-Aldrich公司，LYN-1604(貨號S8597)購自美國Selleck公司，BCA蛋白定量試劑盒購自武漢碧云天公司，CCK8試劑盒購自合肥蘭杰柯科技公司，ULK1抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，人LDH酶聯免疫吸附測定試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，人蘋果酸脫氫酶酶聯免疫吸附測定試劑盒購自武漢華美生物有限公司，MDH1抗體購自武漢三鷹公司。

2.細胞培養(yǎng)：收到L02細胞后，離心去掉細胞凍存液，加入DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，于37 ℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱，適當濕度環(huán)境中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細胞貼壁情況與生長情況，等細胞生長狀態(tài)至對數生長期用于實驗。

3.CCK8法測定LYN-1604對L02細胞活性的影響：將L02細胞分為8組，LYN-1604的濃度分別為：0(對照組)、0.1、0.5、1、5、10、50、100μmol/L。每組設置3個復孔以及相應空白孔。在96孔板中接種適宜且相同細胞濃度的細胞懸液100微升/孔，于培養(yǎng)箱孵育24h，去除培養(yǎng)液，按以上濃度加入含不同濃度LYN-1604的新鮮培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱孵育24h，去除含藥物的培養(yǎng)液后再加入100μl新鮮培養(yǎng)液，每孔再加入10μl CCK8溶液，于培養(yǎng)箱孵育1h后用酶標儀測定在450nm處的吸光度值。各實驗組的細胞活性表示為：細胞活性(%)=A實驗組/A對照組×100%(實驗組和對照組A值均用空白孔調零)。

4.細胞ULK1相對含量:將L02細胞均勻種于6孔板中，分為5組，即正常組、模型組、低劑量LYN-1604組、中劑量LYN-1604組和高劑量LYN-1604組。細胞種入培養(yǎng)皿后于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，低劑量LYN-1604組、中劑量LYN-1604組和高劑量LYN-1604組分別用1、5、10μmol/L 的LYN-1604處理，孵育2h后對模型組、低劑量LYN-1604組、中劑量LYN-1604組和高劑量LYN-1604組均用TNF-α(50ng/ml)和D-Gal(70mmol/ml)處理。繼續(xù)孵育24h后，將各組細胞收集至離心管中，冰浴下超聲碎裂，4℃離心后取上清液，BCA法測定蛋白總量，調整各組蛋白濃度，加蛋白上樣緩沖液后混勻，煮沸10min。以10%SDS-PAGE丙烯酰胺凝膠進行電泳，每孔加樣10μl，電泳后恒流200mA進行110min電轉，室溫下用5%脫脂奶粉進行封閉1h，然后加入一抗4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜后熒光二抗室溫下避光孵育1h，TBST洗膜后用Odyssey系統(tǒng)掃膜，檢測并對比各組ULK1相對量。

5.細胞培養(yǎng)物上清LDH含量檢測:將L02細胞均勻種于6孔板中，分為上述5組，各組細胞經上述方法造模處理，繼續(xù)孵育24h后，取細胞培養(yǎng)物上清，酶聯免疫吸附法檢測其LDH含量，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

6.細胞內MDH1含量檢測:將L02細胞均勻種于6孔板中，分為上述5組。各組細胞經上述方法造模處理，繼續(xù)孵育24h后，將各組細胞收集至離心管中，冰浴下超聲碎裂，4℃離心后取上清液，酶聯免疫吸附法檢測其MDH1含量，且每組MDH1含量用樣本蛋白質總濃度進行標準化，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

7.免疫熒光法測定MDH1含量:將L02細胞均勻種于24孔板中，分為上述5組。各組細胞經上述方法造模處理，繼續(xù)孵育24h后，用細胞固定液固定25min，然后用PBS清洗3次。0.2%Triton透化20min，0.5%BSA封閉30min。MDH1一抗孵育過夜。次日，二抗孵育1h，DAPI染核3min, PBS清洗5次，滴加抗熒光猝滅劑后封片，于共聚焦顯微鏡下觀察。

結 果

1.CCK8檢測不同濃度的LYN-1604對L02細胞活性的影響:當LYN-1604濃度≤10μmol/L時，藥物對L02細胞活性與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖1)。據此本實驗將低、中、高劑量組的LYN-1604的藥物濃度分別定為1、5和10μmol/L。

圖1 不同濃度的LYN-1604對L02細胞活性的影響與0μmol/L比較，*P<0.05

2.蛋白免疫印跡法測細胞內ULK1相對含量：與正常組比較，模型組、低劑量LYN-1604組、中劑量LYN-1604組和高劑量LYN-1604組的ULK1相對含量較低(P<0.05，圖2)。與模型組比較，低劑量LYN-1604組的ULK1相對含量較高(P<0.05)。與低劑量LYN-1604組比較，中劑量LYN-1604組的ULK1相對含量較高(P<0.05)。與中劑量LYN-1604組比較，高劑量LYN-1604組ULK1相對含量較高(P<0.05)。

圖2 各組細胞內ULK1相對含量A.蛋白免疫印跡法結果；B.ULK1相對含量；1.正常組；2.模型組；3.低劑量LYN-1604組；4.中劑量LYN-1604組；5.高劑量LYN-1604組。與1比較，*P<0.05；與2比較，#P<0.05；與3比較，ΔP<0.05；與4比較，◇P<0.05

3.酶聯免疫吸附法測細胞培養(yǎng)物上清LDH含量:與正常組比較，模型組、低劑量LYN-1604組、中劑量LYN-1604組和高劑量LYN-1604組細胞培養(yǎng)物上清內的乳酸脫氫酶含量均升高(P<0.05，圖3)。與模型組比較，低劑量LYN-1604組的細胞培養(yǎng)物上清內的乳酸脫氫酶含量降低(P<0.05)。與低劑量LYN-1604組比較，中劑量LYN-1604組的細胞培養(yǎng)物上清內的乳酸脫氫酶含量降低(P<0.05)。與中劑量LYN-1604組比較，高劑量LYN-1604組細胞培養(yǎng)物上清內的乳酸脫氫酶含量進一步降低(P<0.05)。

圖3 各組細胞培養(yǎng)物上清中乳酸脫氫酶的含量1.正常組；2.模型組；3.低劑量LYN-1604組；4.中劑量LYN-1604組；5.高劑量LYN-1604組。與1比較，*P<0.05；與2比較，#P<0.05；與3比較，ΔP<0.05；與4比較，◇P<0.05

4.酶聯免疫吸附法測細胞內MDH1含量:與正常組比較，模型組、低劑量LYN-1604組、中劑量LYN-1604組和高劑量LYN-1604組細胞內MDH1含量均下降(P<0.05，圖4)。與模型組比較，低劑量LYN-1604組的細胞內MDH1含量較高(P<0.05)。與低劑量LYN-1604組比較，中劑量LYN-1604組的細胞內MDH1含量較高(P<0.05)。與中劑量LYN-1604組比較，高劑量LYN-1604組細胞內MDH1含量較高(P<0.05)。

圖4 各組細胞內蘋果酸脫氫酶1含量1.正常組；2.模型組；3.低劑量LYN-1604組；4.中劑量LYN-1604組；5.高劑量LYN-1604組。與1比較，*P<0.05；與2比較，#P<0.05；與3比較，ΔP<0.05；與4比較，◇P<0.05

圖5 各組細胞內蘋果酸脫氫酶1免疫熒光A.共聚焦顯微鏡下熒光圖像；B.MDH1相對熒光值。1.正常組；2.模型組；3.低劑量LYN-1604組；4.中劑量LYN-1604組；5.高劑量LYN-1604組。與1比較，*P<0.05；與2比較，#P<0.05；與3比較，ΔP<0.05；與4比較，◇P<0.05

5.疫熒光法測定MDH1含量：與正常組比較，模型組、低劑量LYN-1604組、中劑量LYN-1604組和高劑量LYN-1604組細胞內MDH1相對熒光值均下降(P<0.05，圖5)。與模型組比較，低劑量LYN-1604組的細胞內MDH1相對熒光值較高(P<0.05)。與低劑量LYN-1604組比較，中劑量LYN-1604組的細胞內MDH1相對熒光值較高(P<0.05)。與中劑量LYN-1604組比較，高劑量LYN-1604組細胞內MDH1相對熒光值較高(P<0.05)。

討 論

肝臟是人體最主要的代謝器官，引起肝臟功能障礙的疾病可以導致肝臟代謝失衡。各種原因都可以導致肝損傷，嚴重的肝損傷會導致ALF。在肝損傷相關研究中發(fā)現，自噬水平的增加能夠降低炎性細胞因子水平，減緩肝細胞的損傷[6, 7]。在ALF中，氧化應激會導致線粒體結構蛋白和DNA發(fā)生變化，從而導致ATP耗竭和ATP產生受損；活性氧的聚集可以導致線粒體失活，加重氧化應激和肝細胞損傷[8]。線粒體是調節(jié)細胞能量穩(wěn)態(tài)的重要細胞器，對適應生理需求和應激狀態(tài)具有重要的作用，而線粒體總是暴露在高活性的活性氧中，易受到損傷。線粒體凋亡途徑是線粒體內凋亡相關因子進入細胞質激活胱天蛋白酶系統(tǒng)引起凋亡的過程，在包括急性肝衰竭在內的各類肝臟疾病都有一定的作用[9]。因此線粒體有自身質量控制體系保證其質量和功能[10]。線粒體自噬就是其中一條重要途徑。線粒體自噬是一種選擇性的自噬性降解，它能夠去除功能障礙及多余的線粒體，也可以使一些細胞內的能量物質循環(huán)利用，維持能量平衡[11]。ULK1是人類自噬相關的核心基因之一，是自噬的起始。在原代肝細胞的相關研究中發(fā)現，ULK1的缺乏會導致線粒體自噬缺陷，使得線粒體形態(tài)異常及膜電位缺陷[12]。可見在肝細胞中線粒體自噬與ULK1存在明顯的相關性。

自噬是細胞和機體維持正常生理活動不可缺少的過程，在眾多疾病中起著十分重要的作用[13]。在細胞處于缺乏葡萄糖的情況下，AMPK可以通過Ser317和Ser777等位點的磷酸化直接激活ULK1來促進自噬；相反，在營養(yǎng)充足的情況下，高mTOR活性可破壞ULK1與AMPK之間的互相作用來阻止ULK1的激活[14]。一些研究者通過計算機的集成篩選、化學合成以及幾輪激酶篩選，最終篩選出LYN-1604對激活ULK1是最有效的[15]。在本研究中，LYN-1604在對肝細胞無明顯活性抑制的藥物濃度范圍內，隨著LYN1604濃度的增加，ULK1的水平也增加，說明在該模型中，LYN-1604可激活L02細胞的ULK1，且作用呈濃度依賴性。LYN-1604在干眼癥中被證明可以促進自噬，降低角膜炎性水平，緩解眼表炎癥并治療干眼癥[16]。本實驗中檢測細胞培養(yǎng)物上清的LDH含量發(fā)現，肝細胞炎性損傷模型組比起正常組LDH含量顯著升高，可能是由于細胞損傷后細胞膜結構遭破壞導致細胞質中的LDH釋放到培養(yǎng)基中，據此可提示細胞損害的嚴重程度[17]。使用LYN-1604干預后，細胞培養(yǎng)物上清LDH含量比起模型組顯著下降，且在一定的濃度范圍內，LYN-1604的劑量越大，細胞培養(yǎng)物上清LDH的含量越低，說明了LYN-1604對炎性損傷的肝細胞具有保護作用，且呈濃度依賴性。綜上所述，LYN-1604對炎性損傷的肝細胞具有保護作用且可能與ULK1的激活相關。

MDH1為胞質蘋果酸脫氫酶，主要催化草酰乙酸加氫還原為蘋果酸，而線粒體內有線粒體蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase 2，MDH2)，將蘋果酸脫氫形成草酰乙酸和氫，從而將還原形式的氫間接轉運至線粒體基質中[18]。在具有正常線粒體功能的細胞中，多數ATP是通過線粒體內三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)的結合所產生的。OXPHOS是由NADH驅動的，NADH可以是三羧酸循環(huán)產生，也可以通過蘋果酸穿梭提供[19]。蘋果酸脫氫酶對于蘋果酸穿梭和OXPHOS是至關重要的[20]。在一項肺癌研究中發(fā)現，活檢組織中基因和蛋白質表達水平存在MDH1和MDH2的上調，但是MDH1在遺傳和代謝組學研究中被發(fā)現具有明顯更高的活性，與MDH2耗竭比較，MDH1的遺傳耗竭對細胞具有選擇毒性[21]。MDH1與細胞能量代謝密切相關，其水平可以間接說明細胞內生產能量的水平。

本研究中模型組比起正常組細胞內MDH1的水平顯著下降，說明模型組中肝細胞的OXPHOS可能受損，由有氧氧化帶來的能量供應可能不足，而給予LYN-1604的實驗組細胞內MHD1水平顯著高于模型組，說明LYN-1604對肝炎性損傷中的肝細胞供能有所改善。在一項慢加急性肝衰竭的研究中發(fā)現，慢加急性肝衰竭患者的代謝特征表現為糖酵解、三羧酸循環(huán)和尿素循環(huán)受抑制，而脂肪酸氧化增強，谷煙酰胺回補增強[22]。所以LYN-1604在肝細胞炎性損傷模型中保護肝細胞的可能機制為激活了ULK1，促進了線粒體自噬，進而改善了肝細胞內能量產生的情況從而對肝細胞的存活提供了幫助。

LYN-1604在肝細胞炎性損傷的細胞模型中，能激活ULK1，提高細胞內MDH1水平，降低細胞培養(yǎng)物上清中的LDH含量。其保護肝細胞的機制可能與其激活ULK1促進線粒體自噬，改善了細胞的能量供應情況有關。本研究僅在體外肝細胞炎性損傷細胞模型中進行，需在動物實驗中對該作用進行進一步驗證，并增加糖酵解和三羧酸循環(huán)通路中的代謝物檢測，進一步驗證線粒體自噬在其中的作用。激活ULK1改善能量代謝，可能是改善急性肝衰竭預后的一個有潛力的治療方向。