一例罕見抗-Chido/Rodgers抗體的鑒定及特征分析*

王貞 魏玲 駱宏 廖志堅(jiān) 莫春妍 姬艷麗 羅廣平

Chido/Rodgers血型系統(tǒng)的抗原并不位于紅細(xì)胞膜的固有結(jié)構(gòu)上，而是攜帶于結(jié)合在紅細(xì)胞膜表面的補(bǔ)體第四成分（C4）的C4d片段上；C4具有C4A和C4B兩個(gè)同種型，分別由兩個(gè)緊密連鎖的基因C4A和C4B基因編碼，大多數(shù)情況下，Ch抗原攜帶在C4B上，而Rg抗原攜帶在C4A上，共價(jià)結(jié)合在紅細(xì)胞表面[1]。Chido/Rodgers抗原可以被經(jīng)典的紅細(xì)胞血型鑒定方法檢測到，且在這些抗原和C4之間的關(guān)系被證實(shí)之前，已經(jīng)被當(dāng)作血型抗原，因此Chido/Rodgers被歸納為第17個(gè)人類血型系統(tǒng)[2]。目前，在Chido/Rodgers血型系統(tǒng)中已鑒定出9種抗原，其中8種為高頻抗原，其中Ch1（CH/RG1）至Ch6（CH/RG6）、Rg1（CH/RG11）和Rg2（CH/RG1）抗原頻率超過90%，個(gè)別抗原頻率高達(dá)99%[2]。針對(duì)Chido/Rodgers抗原的抗體是IgG抗體，主要是IgG2和IgG4[3]，通常不會(huì)引起溶血性輸血反應(yīng)或新生兒溶血[2，4-5]。由于Chido/Rodgers抗原多為高頻抗原，因此抗-Chido/Rodgers抗體極為罕見，本文對(duì)國內(nèi)首例疑似抗-Chido/Rodgers抗體進(jìn)行鑒定，并對(duì)鑒定方法報(bào)道如下：

材料與方法

1 研究對(duì)象 患者，漢族，女性，32歲。無輸血史，曾有2次不良孕產(chǎn)史，此次診斷為雙胎妊娠胚胎停育，需手術(shù)終止妊娠，在手術(shù)備血過程中發(fā)現(xiàn)交叉配血不合，標(biāo)本送至本中心臨床輸血研究所進(jìn)行檢測。

2 主要試劑與儀器 單克隆抗-A、抗-B 試劑（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號(hào)20190610），Rh血型分型卡（江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：202002006），反定型試劑紅細(xì)胞、抗體篩選細(xì)胞及試劑譜細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室自制），胰酶（sigma公司，批號(hào)：SLBS8956），菠蘿酶（sigma公司，批號(hào)：BCCC9201），Coombs微柱凝膠卡（西班牙Grifols公司，批號(hào)：17071.01），離心機(jī)KA-2200（日本，KUBOTA 公司），恒溫孵育箱及卡式離心機(jī)（西班牙Grifols公司）。

3 血型鑒定 試管法鑒定患者ABO血型，Rh血型分型卡鑒定患者Rh型，應(yīng)用Coombs微柱凝膠卡進(jìn)行間接抗人球?qū)嶒?yàn)（IAT）確證患者RhD血型。

4 抗體篩選試驗(yàn) 將患者血清與抗體篩選細(xì)胞分別在鹽水介質(zhì)與Coombs微柱凝膠卡中進(jìn)行反應(yīng)，觀察凝集強(qiáng)度，同時(shí)將患者血清與患者自身紅細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)作為對(duì)照。

5 血型單特異性抗體鑒定實(shí)驗(yàn) 將患者血清與試劑譜細(xì)胞在Coombs微柱凝膠卡中進(jìn)行反應(yīng)，觀察凝集強(qiáng)度。

6 患者血清與酶處理譜細(xì)胞反應(yīng) 分別將胰酶和菠蘿酶與壓積試劑譜細(xì)胞以4∶1體積比混合，37℃孵育30 min，用生理鹽水洗滌3次后與患者血清在Coombs微柱凝膠卡中進(jìn)行反應(yīng)，觀察凝集強(qiáng)度。

7 患者血清與新鮮血漿的中和抑制試驗(yàn) 將患者血清與3人份獻(xiàn)血者新鮮血漿以4∶1體積比混勻，同時(shí)將患者血清與磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）以相同體積比混合做為稀釋對(duì)照，于室溫孵育30 min，然后將混合有新鮮血漿的患者血清與譜細(xì)胞在微柱凝膠卡中反應(yīng)，對(duì)照組同樣進(jìn)行微柱凝膠卡反應(yīng)，觀察凝集強(qiáng)度。

結(jié) 果

1 血型鑒定 患者血型為O型，Ccdee。

2 抗體篩選試驗(yàn) 患者血清與Ⅰ號(hào)篩選細(xì)胞反應(yīng)呈2+凝集，與Ⅲ號(hào)篩選細(xì)胞反應(yīng)呈弱陽性，與Ⅱ號(hào)篩選細(xì)胞及自身細(xì)胞反應(yīng)陰性，結(jié)果提示患者血清中存在不規(guī)則抗體。

3 血型單特異性抗體鑒定實(shí)驗(yàn) 患者血清僅與9號(hào)和11號(hào)譜細(xì)胞反應(yīng)陰性，與6號(hào)及10號(hào)譜細(xì)胞反應(yīng)呈弱陽性，與其余細(xì)胞反應(yīng)均呈2+凝集（結(jié)果見表1），對(duì)照譜細(xì)胞格局表無法判斷抗體的特異性，需進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。

4 患者血清與酶處理譜細(xì)胞反應(yīng) 分別采用胰酶和菠蘿酶處理譜細(xì)胞后，患者血清與酶處理細(xì)胞反應(yīng)均為陰性（結(jié)果見表1），根據(jù)此結(jié)果結(jié)合與常規(guī)譜細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度不一致的特性，推測該患者血清中可能存在抗-Chido/Rodgers抗體。

5 患者血清與新鮮血漿的中和抑制試驗(yàn) 應(yīng)用新鮮血漿吸收后的患者血清與譜細(xì)胞在微柱凝膠卡中反應(yīng)，結(jié)果均為陰性，PBS稀釋對(duì)照組結(jié)果與未吸收的患者血清的譜細(xì)胞反應(yīng)格局一致（結(jié)果見表1），說明該患者血清中的抗體可被新鮮血漿中和，符合抗-Chido/Rodgers抗體可被新鮮血漿中的補(bǔ)體成分中和的關(guān)鍵特性，證實(shí)為抗-Chido/Rodgers抗體。

表1 譜細(xì)胞反應(yīng)格局表

討 論

高頻抗體通常會(huì)與所有譜細(xì)胞凝集或僅有極個(gè)別的細(xì)胞呈陰性反應(yīng)，無法直接通過譜細(xì)胞反應(yīng)格局進(jìn)行抗體判定，同時(shí)還需要與自身抗體導(dǎo)致的譜細(xì)胞全凝集以及混合抗體導(dǎo)致的譜細(xì)胞全凝集進(jìn)行區(qū)別。高頻抗體通常直抗陰性，可與自身抗體導(dǎo)致的譜細(xì)胞全凝集進(jìn)行區(qū)分，而與混合抗體的鑒別則需要與酶處理細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)加以區(qū)分，根據(jù)不同的酶對(duì)于不同抗原的作用不同，通過酶處理譜細(xì)胞反應(yīng)格局進(jìn)行抗體的鑒定。

在進(jìn)行抗體篩查及抗體鑒定時(shí)應(yīng)同時(shí)采用自身紅細(xì)胞與血漿反應(yīng)作為自身對(duì)照，如果自身對(duì)照無凝集，則可排除自身抗體。在本案例中，患者血漿與自身細(xì)胞反應(yīng)呈陰性，首先排除了自身抗體?；颊哐迮c11個(gè)譜細(xì)胞中的9個(gè)譜細(xì)胞均發(fā)生凝集反應(yīng)，并且凝集強(qiáng)度不一致，與其余2個(gè)譜細(xì)胞反應(yīng)陰性，此反應(yīng)格局首先懷疑存在混合抗體，因此我們進(jìn)一步采用了胰酶、菠蘿酶處理的譜細(xì)胞分別進(jìn)行抗體鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者血清與胰酶和菠蘿酶處理后的譜細(xì)胞反應(yīng)均為陰性，不符合常規(guī)混和抗體特征。初步判斷為高頻抗體，但通常高頻抗體會(huì)導(dǎo)致譜細(xì)胞全凝集且凝集強(qiáng)度均一，如本實(shí)驗(yàn)室曾鑒定出的抗-JMH抗體及Cromer血型系統(tǒng)的抗-IFC抗體等，而本案例抗體與譜細(xì)胞反應(yīng)凝集強(qiáng)度不一致，因此提示患者血清中可能存在抗-Chido/Rodgers抗體。

Chido/Rodgers同樣是高頻抗原，但由于Chido/Rodgers抗原不表達(dá)于紅細(xì)胞固有結(jié)構(gòu)上，而是位于來自血漿結(jié)合在紅細(xì)胞表面的補(bǔ)體C4上，不同個(gè)體間的補(bǔ)體水平差異較大，結(jié)合于紅細(xì)胞膜上的補(bǔ)體C4也有很大的差異，對(duì)應(yīng)的不同個(gè)體間Chido/Rodgers抗原變化很大，而且很難將弱陽性的紅細(xì)胞與陰性的紅細(xì)胞區(qū)分開來，因此盡管抗-Chido/Rodgers抗體是高頻抗體，但其與不同的細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度不一致，甚至?xí)霈F(xiàn)反應(yīng)為陰性的情況[2，6-8]，這是抗-Chido/Rodgers抗體的重要特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此相符；同時(shí)紅細(xì)胞膜上的Chido/Rodgers抗原可被多種酶破壞[8]，經(jīng)多種酶處理后的紅細(xì)胞與抗-Chido/Rodgers抗體反應(yīng)陰性，本案例抗體鑒定結(jié)果與這些特性均相符合。但其他血型系統(tǒng)的一些抗體，如JMH血型系統(tǒng)抗體、Inb血型抗體也與多種酶處理后的譜細(xì)胞反應(yīng)陰性，因此需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以甄別。

抗-Chido/Rodgers抗體有一個(gè)區(qū)別于其他血型抗體的最關(guān)鍵特性，即可以被新鮮血漿中的補(bǔ)體成分中和，抑制其與紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)[9-10]，為了進(jìn)一步確證，在本案例中，我們采用了新鮮混合血漿對(duì)患者血清進(jìn)行中和抑制試驗(yàn)，中和后的患者血清與譜細(xì)胞反應(yīng)均為陰性，說明其抗體可被新鮮血漿中和，符合抗-Chido/Rodgers抗體的關(guān)鍵特征，證實(shí)患者血清中的抗體為抗-Chido/Rodgers抗體。吳梅筠曾報(bào)道一例歐美病例產(chǎn)生抗-Chido抗體，應(yīng)用譜細(xì)胞進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)患者血漿與其中一個(gè)譜細(xì)胞反應(yīng)為陰性，與其他譜細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度為1+或2+，再應(yīng)用另一套不同的譜細(xì)胞鑒定時(shí)，同樣出現(xiàn)反應(yīng)強(qiáng)度不一致（1+或2+），也有一個(gè)譜細(xì)胞反應(yīng)陰性，最后應(yīng)用血漿中和抑制試驗(yàn)及胰蛋白酶處理紅細(xì)胞與患者血漿反應(yīng)，最終鑒定為抗-Chido抗體[7]，與本文案例結(jié)果一致。

本文首次在國內(nèi)對(duì)一例疑似針對(duì)高頻抗原的罕見抗-Chido/Rodgers抗體進(jìn)行鑒定，該抗體屬于IgG抗體，目前報(bào)道的抗-Chido/Rodgers抗體絕大多數(shù)來自于反復(fù)輸血的患者，本文案例沒有輸血史，但是有2次不良孕產(chǎn)史，因此該類抗體可能經(jīng)免疫刺激產(chǎn)生。由于國內(nèi)市場商業(yè)化抗-Ch和抗-Rg抗體的缺乏，無法鑒定患者紅細(xì)胞Chido/Rodgers抗原；同時(shí)Chido、Rodgers抗原的編碼基因（C4B和C4A基因）高度同源（同源性高達(dá)99%）且緊密連鎖，均含有41個(gè)外顯子，其基因型及其復(fù)雜，不同的氨基酸序列編碼不同的同種型，但Ch和Rg表型與特定的同種異型體之間并無直接關(guān)聯(lián)[2]，對(duì)C4B和C4A基因進(jìn)行分子檢測仍然無法準(zhǔn)確判定其表型，因此在臨床鑒定時(shí)進(jìn)行基因測序分析的意義不大。應(yīng)用不同種酶處理譜細(xì)胞與患者血漿反應(yīng)，以及應(yīng)用新鮮混合血漿對(duì)患者血清進(jìn)行中和抑制試驗(yàn)，是目前臨床上用以鑒定抗-Chido/Rodgers抗體最適合的實(shí)驗(yàn)手段，而其中最關(guān)鍵的是新鮮混合血漿的中和抑制實(shí)驗(yàn)，在初步判斷抗體可能為抗-Chido/Rodgers抗體時(shí)，必須進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行最終鑒別診斷及確證。由于血漿中的補(bǔ)體活性在室溫存放2小時(shí)后開始下降，因此在進(jìn)行補(bǔ)體中和抑制試驗(yàn)時(shí)應(yīng)盡可能采用新鮮采集的外周血樣本血漿，以確保中和抑制試驗(yàn)的順利進(jìn)行。

抗-Chido/Rodgers抗體在紅細(xì)胞輸注中目前被認(rèn)為沒有臨床意義，沒有造成明顯的溶血性輸血反應(yīng)的報(bào)道，而且用放射性標(biāo)記Chido陽性紅細(xì)胞輸注給有抗-Chido抗體的患者，患者無免疫性輸血反應(yīng)[11-12]，因此臨床檢出抗-Chido/Rodgers抗體的患者需要輸注紅細(xì)胞治療時(shí)可以選擇配血中不凝集或凝集強(qiáng)度最弱的血液輸注；在極少數(shù)的個(gè)例中，曾發(fā)現(xiàn)抗-Chido/Rodgers抗體與一些輸入新鮮冰凍血漿、血漿因子及含有血漿的濃縮血小板后引發(fā)的嚴(yán)重過敏反應(yīng)有關(guān)[13-15]，有此類抗體的患者在輸注血漿類血液成分時(shí)需引起臨床注意。

在臨床輸血工作中，常常會(huì)遇到抗體篩查或抗體鑒定全凝集反應(yīng)，通常為混合抗體或者高頻抗體，酶處理紅細(xì)胞在此類抗體的鑒定中具有重要作用，在臨床進(jìn)行輸血前檢查發(fā)現(xiàn)譜細(xì)胞全凝集時(shí)，需應(yīng)用酶處理譜細(xì)胞進(jìn)行鑒定，應(yīng)用不同的酶處理譜細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，再根據(jù)反應(yīng)格局結(jié)合不同血型系統(tǒng)抗體的特性進(jìn)一步判斷，必要時(shí)增加相關(guān)特異性實(shí)驗(yàn)加以確證，進(jìn)而保障臨床輸血安全。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突