合成大麻素類新精神活性物質(zhì)AB-CHMINACA的體內(nèi)與體外代謝研究

李 靜，彭慧飛，花鎮(zhèn)東，王優(yōu)美

（1.公安部禁毒情報技術(shù)中心，北京 100193； 2.中國刑事警察學(xué)院法化系，遼寧 沈陽110854）

近年來，多種合成大麻素和卡西酮類衍生物在全球范圍內(nèi)被報道發(fā)現(xiàn)，并在世界多地引起了社會公共安全問題。新興的毒品較之前藥效更強(qiáng)，并多次導(dǎo)致死亡案例發(fā)生。 AB-CHMINACA 為吲唑-3-甲酰胺類合成大麻素類新精神活性物質(zhì)，合成大麻素原體曾被發(fā)現(xiàn)存在固體組織，然而因合成大麻素的廣泛代謝性致其母藥在尿液中罕見，故尿液中代謝產(chǎn)物的鑒定對臨床和法庭科學(xué)分析起著至關(guān)重要的作用。 然而，因國內(nèi)尚未進(jìn)行有關(guān)其藥理學(xué)、毒理學(xué)、安全性及代謝的相關(guān)研究，給檢測吸食后尿液中的標(biāo)志物帶來困難，又因開展人體體內(nèi)實驗受限等客觀因素，開展體外代謝從成本及便捷性方面來講均更有利于評價其代謝產(chǎn)物及代謝途徑。 本研究旨在通過體外人肝微粒體模型模擬人體代謝環(huán)境，從而確定AB-CHMINACA 的I 相代謝產(chǎn)物，并將其結(jié)果與1 例真實濫用者的尿液樣本比對，從而確定合適的生物標(biāo)志物，以進(jìn)一步為臨床和法庭科學(xué)鑒定提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

戴安超高壓液相系統(tǒng)（Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 RSLC）串聯(lián)帶有熱電離噴霧離子化源（HESI）的 Q Exactive Plus 質(zhì)譜儀。 待分析物 ABCHMINACA（CHNO：m/z 356.2212，由國家毒品實驗室繳獲物純化）。 還原型酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）再生系統(tǒng)溶液A5 mL，CorningGentest，NADPH 再生系統(tǒng)溶液B 1 mL，CorningGentest，0.1 mol·L磷酸鉀緩沖液100 mL[匯智泰康生物技術(shù)有限公司 （北京）]。混合男性肝微粒體（pHLM；蛋白質(zhì)量濃度：20mg·mL）。 微粒體送達(dá)后于 37 ℃解凍、分裝并儲存于-80 ℃直至使用。

液質(zhì)級乙腈（CHCN）、甲醇（CHOH）和甲酸（FA）（德國 Merck 公司）；超純水（德國 Merck 公司的Milli-Q Advantage A10 自動蒸餾水機(jī)制備）；其他所有試劑和溶劑均為分析純。

1.2 儀器工作條件

色譜柱為ACQUITY UPLCHSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫為35 ℃，樣品盤溫度為4 ℃；流動相為乙腈（B）-0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸溶液（A），梯度洗脫，流量和洗脫程序如下:0.0 ～7.0 min時，70%A降至40%A；7.0 ～7.2 min時，40%A降至10%A；7.2 ～9.0min時，保持10%A；9.0～9.1min 時，10%A升至70%A；9.1～12.0 min 時，保持70%A；流量持續(xù)保持在0.4 mL·min（表1）。

表1 流動相梯度洗脫程序

超高壓液相系統(tǒng)（Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 RSLC）串聯(lián)帶有熱電離噴霧離子化源（HESI）的 Q Exactive Plus 質(zhì)譜。 儀器在使用前進(jìn)行正離子模式下的質(zhì)量校準(zhǔn)。 離子源條件如下：離子傳輸毛細(xì)管溫度為350 ℃；輔氣加熱溫度為350 ℃；鞘氣流速為35 AUs；輔氣流速為10 AUs；噴霧電壓為 3.50 kV，S-透鏡RF 水平 20.0。 MS 采用正離子全掃描模式，并選取特定質(zhì)荷比（m/z）的離子作為目標(biāo)物進(jìn)行二級子離子掃描。代謝產(chǎn)物的精確分子量通過軟件Thermo MetWorks 1.3 SP4.200 版本計算得出。 全掃描數(shù)據(jù)采集參數(shù)設(shè)置如下：分辨率為70 000；自動增益控制（AGC）1e；最大注入時間（IT）100ms；掃描范圍m/z70～1050。目標(biāo)離子的二級參數(shù)設(shè)置如下：分辨率為17 500；目標(biāo)物AGC 為1e；最大IT 為50 ms；分離窗m/z 0.6；正態(tài)碰撞能量為20%、40%、60%。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

將AB-CHMINACA溶于甲醇制備成濃度約為5 mmol·L的溶液，吸取2 μL該溶液與初始孵育反應(yīng)體系混合（由20 μL 0.1 mol·L磷酸鉀緩沖液、156 μL超純水和2 μL NADPH再生系統(tǒng)溶液B組成），充分渦旋混合后加入10μL HLMs（pHLM；蛋白質(zhì)量濃度：20 mg·mL），渦旋混勻并將其置于37 ℃環(huán)境中預(yù)孵育3 min，再加入10 μL NADPH再生系統(tǒng)溶液A，渦旋混勻后將其置于37 ℃環(huán)境中孵育1 h。 1 h后，加入200μL乙腈終止反應(yīng)，渦旋后，以14 000 r·min離心10 min。 吸取100 μL上清液并將其轉(zhuǎn)移入玻璃進(jìn)樣瓶中，置于4 ℃環(huán)境下待分析。 利用TF軟件Xcalibur Qual Browser 4.0.27.10版本進(jìn)行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)采集。

將空白溶液和未加母藥的孵育反應(yīng)系統(tǒng)溶液作為對照同樣進(jìn)行分析。同樣進(jìn)行合成大麻素ABCHMINACA 在未加入微粒體的孵育體系中的穩(wěn)定性研究（37 ℃，搖床1 h）以確證代謝產(chǎn)物由微粒體的引入而生成。

1.3.2 樣本前處理

將一例AB-CHMINACA 濫用者的尿液于-80 ℃條件下取出并解凍，吸取200 μL 該尿液并加入600μL 乙腈稀釋渦旋后，以 14 000 r·min離心 10 min。吸取100 μL 上清液并將其轉(zhuǎn)移入玻璃進(jìn)樣瓶中，置于4℃環(huán)境下待分析。利用TF 軟件Xcalibur Qual Browser 4.0.27.10 版本進(jìn)行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)采集。

2 結(jié)果

AB-CHMINACA 體外代謝實驗共發(fā)現(xiàn)AB-CHMINACA 的 10 種體外代謝 產(chǎn)物 ，AB-CHMINACA 的保留時間為6.85 min，10 種代謝產(chǎn)物的保留時間在1.46～8.34 min 之間，檢測誤差均在 2.0 ppm 以內(nèi)（圖 1～2，表 2），分別為甲酰胺水解代謝產(chǎn)物 1 種（M1）、酰胺水解代謝產(chǎn)物 1 種（M2）、N-脫烷基代謝產(chǎn)物1種（M3）、甲基丙基側(cè)鏈羥化代謝產(chǎn)物5 種（M4～M8）、環(huán)己基甲基羥化代謝產(chǎn)物 1 種（M9）、N-脫烷基合并甲酰胺水解代謝產(chǎn)物1 種（M10）。 從羥化代謝發(fā)生的位點、數(shù)目及峰面積上來看，羥化代謝反應(yīng)優(yōu)先發(fā)生在甲基丙基側(cè)鏈，其次是環(huán)己基甲基部分，羥化的目的是使分子極性增大，更有利于體內(nèi)通過代謝后排出體外。 圖 2 為母藥 ABCHMINACA 及其所有代謝產(chǎn)物的提取離子峰色譜圖。 圖3 闡釋了所有代謝產(chǎn)物的特征碎片離子及碎裂途徑。 根據(jù)提取離子色譜峰的峰面積可知，體外代謝的主要代謝產(chǎn)物為甲酰胺水解代謝產(chǎn)物、甲基丙基側(cè)鏈羥化代謝產(chǎn)物、N-脫烷基代謝產(chǎn)物和酰胺水解代謝產(chǎn)物。 經(jīng)提取尿液樣本中這些代謝產(chǎn)物的提取離子色譜圖發(fā)現(xiàn)，甲酰胺水解代謝產(chǎn)物M1、甲基丙基側(cè)鏈羥化代謝產(chǎn)物M4 和N-脫烷基合并甲酰胺水解代謝產(chǎn)物M10 在AB-CHMINACA 濫用者的尿液樣本中也均有發(fā)現(xiàn)。 表2 總結(jié)了人肝微粒體體外代謝孵育實驗1h 后所有代謝產(chǎn)物的代謝反應(yīng)類型、保留時間、母離子的理論質(zhì)荷比[M+H]（m/z）、實測質(zhì)荷比[M+H]（m/z）、質(zhì)量誤差、化學(xué)分子式、離子碎片和峰面積。 代謝產(chǎn)物被標(biāo)記為“M”，代謝途徑如圖3 所示。

圖1 AB-CHMINACA 的體外代謝產(chǎn)物提取離子流色譜圖

圖2 AB-CHMINACA（A）和其代謝產(chǎn)物（B-G）的質(zhì)譜圖、推測結(jié)構(gòu)和斷裂模式

圖3 AB-CHMINACA 在人肝微粒體中的代謝途徑

表2 AB-CHMINACA 在人肝微粒體孵育1h 后的推測代謝產(chǎn)物

3 討論

AB-CHMINACA 的體內(nèi)代謝研究結(jié)果顯示，原藥僅出現(xiàn)在固體組織中，在血液和尿液樣本中均未被發(fā)現(xiàn)。 WURITA 等報道了 8 種 AB-CHMINACA代謝產(chǎn)物，僅有2 種非葡醛酸結(jié)合代謝產(chǎn)物出現(xiàn)在尿液樣本中，分別為4-羥基環(huán)己基甲基代謝產(chǎn)物和甲酰胺水解代謝產(chǎn)物。本研究并未在尿液中發(fā)現(xiàn)4-羥基環(huán)己基甲基代謝產(chǎn)物，僅發(fā)現(xiàn)了甲酰胺水解代謝產(chǎn)物（表 3）。 ERRATICO 等的體外代謝研究發(fā)現(xiàn)，在肝微粒體體外代謝模型中，共檢測發(fā)現(xiàn)了7 種單羥化代謝產(chǎn)物、6 種雙羥化代謝產(chǎn)物、1 種N-脫烷基代謝產(chǎn)物和2 種酰胺水解代謝產(chǎn)物。 但在本實驗的研究中并未發(fā)現(xiàn)雙羥化代謝產(chǎn)物，單羥化代謝產(chǎn)物也僅發(fā)現(xiàn)了5 種，其他代謝產(chǎn)物的數(shù)量與種類均與該報道文獻(xiàn)一致。 結(jié)合前期相關(guān)實驗研究發(fā)現(xiàn)，AB-CHMINACA 濫用者的尿液樣本中代謝產(chǎn)物的種類存在顯著差異，數(shù)量從2 種至13 種不等，說明AB-CHMINACA 的代謝可能存在個體與種族間差異。從體外代謝產(chǎn)物的提取離子色譜圖峰面積得知，AB-CHMINACA 以甲酰胺水解代謝產(chǎn)物、甲基丙基側(cè)鏈羥化代謝產(chǎn)物、N-脫烷基代謝產(chǎn)物和酰胺水解代謝產(chǎn)物為主。綜上，推薦AB-CHMINACA 的甲酰胺水解代謝產(chǎn)物（2-（1-（環(huán)己基甲基）-1H-吲唑-3-甲酰胺）-3-甲基丁酸）和甲基丙基側(cè)鏈羥化代謝產(chǎn)物（2-（1-（環(huán)己基甲基）-1H-吲唑-3-甲酰胺）-4-羥基-3-甲基丁酸）可作為AB-CHMINACA 濫用常規(guī)尿液樣本分析的生物標(biāo)志物。

表3 人體體外AB-CHMINACA 代謝產(chǎn)物和濫用者尿液樣本中代謝產(chǎn)物的對比

本研究建立了在肝微粒體體外代謝模型基質(zhì)中與體內(nèi)尿液樣本中合成大麻素類新精神活性物質(zhì)AB-CHMINACA 代謝產(chǎn)物的LC-HRMS 分析檢測方法。 該方法簡便快捷，為臨床和法庭科學(xué)案例中濫用此新精神活性物質(zhì)的檢測提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。