甲狀腺微小乳頭狀癌hsa_circRNA_001059表達(dá)及其臨床價(jià)值研究

周聰 彭文 陳吉柏 吳乾富

甲狀腺微小乳頭狀癌（papillary thyroid microcarci‐noma，PTMC）是一種增長速度較快的常見惡性腫瘤，其甲狀腺癌原發(fā)病灶的最大徑≤1 cm。近年來，PTMC的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)有上升且呈年輕化趨勢，部分PTMC患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)甚至死亡[1]。PTMC病灶隱匿，病程緩慢，對其診斷較為困難，常規(guī)超聲檢查方法已不能滿足臨床的需求。近年來研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）作為一種新出現(xiàn)的具有相對穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，在惡性腫瘤中存在特異性表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤、遷移和凋亡等過程，circRNA可能為PTMC的診斷和治療提供新思路[2-3]。有研究表明，hsa_circRNA_001059在PTMC患者中異常表達(dá)，其表達(dá)水平變化與PTMC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有關(guān)，可能對預(yù)測PTMC的發(fā)生、發(fā)展有重要幫助[4]。然而，關(guān)于hsa_circRNA_001059在PTMC中的具體作用機(jī)制及其對PTMC的診斷價(jià)值尚未明確?；诖耍狙芯客ㄟ^分析hsa_circRNA_001059在PTMC患者中的表達(dá)情況，探討其與PTMC患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并分析其對PTMC的診斷價(jià)值，以期為PTMC的診療提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年1月至2021年5月儋州市人民醫(yī)院收治的PTMC患者102例（PTMC組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）PTMC經(jīng)病理組織檢查確診，均行甲狀腺切除術(shù)；（2）年齡≥18歲，首次確診PTMC。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前已接受放療、化療或其他抗腫瘤治療者；（2）有頸部手術(shù)、頭頸部放療史，合并嚴(yán)重心肺、肝腎疾病及其他惡性腫瘤者。PTMC組男26例，女76例；年齡25～68（47.30±11.36）歲；頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例，無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例。另選取同期50名在本院體檢正常者作為對照組，其中男15名，女35名；年齡28～65（46.52±10.17）歲。兩組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。收集PTMC組患者PTMC組織與配對的癌旁正常組織作為研究材料。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑 ABI 7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒和Trizol試劑盒均購自美國Life Technologies公司，高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司。

1.2.2 PTMC組與對照組血漿hsa_circRNA_001059表達(dá)水平檢測 采集PTMC組患者術(shù)前、對照組體檢時(shí)空腹靜脈血3 ml，置于EDTA抗凝管中，離心分離血漿，使用RT-PCR技術(shù)檢測血漿hsa_circRNA_001059表達(dá)水平，方法同1.2.4。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)與合成。hsa_circRNA_001059引物：上游：5'-ACT‐GCTGAGATCTGCTGAGAGCA-3'，下游：5'-TCGAGAG‐CACGAGTGCTATCG-3'；內(nèi)參 GAPDH 上游：5'-TC‐CAATTCTGTCTAAGGAGAAT-3'，下游：5'-AACGAAGGCACTGCTATCAT-3'。

1.2.4 PTMC組織與癌旁正常組織hsa_circRNA_001059表達(dá)水平檢測 使用Trizol試劑提取組織總RNA，紫外分光光度法測量RNA的濃度。首先用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲取反轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸，再使用ABI 7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time PCR,RT-PCR）。PCR總反應(yīng)體系為20 μl：1 μl引物及探針Mix（20×），10 μl TaqMan通用混合物溶液（2×），1.33 μl反轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸，7.67 μl雙蒸水。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min 1個(gè)循環(huán)，95℃變性15 s、60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算 hsa_circRNA_001059 表達(dá)水平。

1.3 觀察指標(biāo) （1）比較PTMC組與對照組血漿hsa_circRNA_001059表達(dá)水平；（2）比較PTMC組織與癌旁正常組織hsa_circRNA_001059表達(dá)水平；（3）比較PTMC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者與無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織、血漿hsa_circRNA_001059表達(dá)水平；（4）分析hsa_circRNA_001059表達(dá)水平對PTMC的診斷價(jià)值及對PTMC患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組內(nèi)比較采用配對t檢驗(yàn)，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用ROC曲線分析hsa_circRNA_001059對PTMC及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTMC組與對照組血漿hsa_circRNA_001059表達(dá)水平比較 PTMC組患者血漿hsa_circRNA_001059表達(dá)水平為2.40±1.02，明顯高于對照組的0.74±0.16，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.811，P＜0.05）。見圖1。

圖1 PTMC組與對照組血漿hsa_circRNA_001059表達(dá)水平比較

2.2 PTMC組織與癌旁正常組織hsa_circRNA_001059表達(dá)水平比較 PTMC組織hsa_circRNA_001059表達(dá)水平為2.87±1.15，明顯高于癌旁正常組織的0.81±0.20，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.835，P＜0.05）。見圖2。

圖2 PTMC組織與癌旁正常組織hsa_circRNA_001059表達(dá)水平比較

2.3 PTMC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者與無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織、血漿hsa_circRNA_001059表達(dá)水平比較 PTMC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織、血漿hsa_cir‐cRNA_001059表達(dá)水平均高于無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 PTMC頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者與無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織、血漿hsa_circRNA_001059表達(dá)水平比較

2.4 hsa_circRNA_001059表達(dá)水平對PTMC的診斷價(jià)值 ROC曲線分析顯示，癌組織、血漿hsa_circRNA_001059診斷PTMC的最佳截?cái)嘀禐?.72、1.50，AUC為0.855（95%CI：0.794～0.912）、0.813（95%CI：0.755～0.874），靈敏度為 0.830、0.816，特異度為0.857、0.782。見表2和圖3。

圖3 hsa_circRNA_001059表達(dá)水平診斷PTMC的ROC曲線

表2 hsa_circRNA_001059表達(dá)水平對PTMC的診斷價(jià)值分析

2.5 hsa_circRNA_001059表達(dá)水平對PTMC患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值 ROC曲線分析顯示，癌組織、血漿hsa_circRNA_001059診斷PTMC患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的最佳截?cái)嘀禐?.17、2.65，AUC為0.894（95%CI：0.836～0.957）、0.860（95%CI：0.802～0.924），靈敏度為0.830、0.816，特異度為0.882、0.863。見表3和圖4。

圖4 hsa_circRNA_001059診斷PTMC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

表3 hsa_circRNA_001059表達(dá)水平對PTMC患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值分析

3 討論

PTMC是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，尋找一種簡單、快速的分子標(biāo)志物，早期診斷PTMC、早期發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對改善PTMC患者的預(yù)后有重大益處。circRNA是一類單鏈共價(jià)閉合非編碼RNA，具有細(xì)胞特異性、組織特異性和時(shí)間特異性，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可為惡性腫瘤的早期診斷、預(yù)后評估及臨床治療提供幫助[5-6]。Fan等[7]研究表明，hsa_circRNA_0000144在甲狀腺癌組織中異常高表達(dá)，能促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，有望成為甲狀腺癌早期診斷、療效監(jiān)測及靶向治療的潛在分子標(biāo)志物。另有研究認(rèn)為，hsa_circRNA_0058124作為一種致癌驅(qū)動因子，促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的細(xì)胞增殖、致瘤性、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，對腫瘤的發(fā)生和侵襲至關(guān)重要，可能是一個(gè)干預(yù)甲狀腺乳頭狀癌進(jìn)展的新的治療靶點(diǎn)[8]。

本研究顯示，PTMC組織hsa_circRNA_001059表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，PTMC組血漿hsa_cir‐cRNA_001059表達(dá)水平明顯高于對照組，提示hsa_cir‐cRNA_001059在PTMC患者中存在異常高表達(dá)，其可能通過發(fā)揮癌基因的作用來參與PTMC的發(fā)病過程。Cai等[9]研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中circRNA水平明顯高于癌旁組織，circRNA促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病密切相關(guān)。本研究中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織、血漿hsa_circRNA_001059表達(dá)水平均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，提示hsa_circRNA_001059高表達(dá)與PTMC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可促進(jìn)PTMC的病情進(jìn)展。Guo等[10]研究指出，與正常組織相比，腫瘤組織中circRNA存在異常表達(dá)，circRNA可能參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，可能是甲狀腺乳頭狀癌診斷和進(jìn)展評價(jià)的新型臨床標(biāo)記物。Li等[11]研究表明，circRNA作為腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子,在PTMC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用，是PTMC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物，對預(yù)后有重要影響。由此推測，hsa_cir‐cRNA_001059作為促癌因子，可通過調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡、自噬等生物學(xué)行為，參與PTMC的惡性進(jìn)展。

本研究ROC曲線分析顯示，血漿和組織hsa_cir‐cRNA_001059表達(dá)水平診斷PTMC的AUC均＞0.800，而且血漿和癌組織hsa_circRNA_001059表達(dá)水平診斷PTMC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移AUC也均＞0.800，說明無論采集血漿還是癌組織，hsa_circRNA_001059對PTMC診斷及預(yù)測其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的效能均較高，hsa_circRNA_001059有望作為PTMC診斷及預(yù)測其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物。由此可見，癌組織或血液中hsa_circRNA_001059高表達(dá)與PTMC發(fā)展有關(guān)，本研究通過采集PT‐MC患者術(shù)中癌組織、癌旁正常組織和術(shù)前血液進(jìn)行hsa_circRNA_001059檢測，對PTMC診斷及預(yù)測其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有較好的幫助，也為其治療提供了新的方向。有研究顯示，血清circRNA在PTMC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中高表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生密切相關(guān)，可能是術(shù)前預(yù)測PTMC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物[12]。Borran等[13]研究表明，circRNA參與甲狀腺癌的基因調(diào)控，是一種有前途的甲狀腺癌無創(chuàng)性分子標(biāo)志物，為甲狀腺癌的診斷和治療提供了一個(gè)新的潛在分子靶點(diǎn)。

綜上所述，PTMC患者癌組織和血漿hsa_circRNA_001059表達(dá)水平明顯升高，其高表達(dá)與PTMC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，對診斷PTMC及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有較好的臨床價(jià)值，可為PTMC的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療提供幫助。