骨碎補(bǔ)治療骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

高文鑫 陳云剛 姚康 郝延科

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250000 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP) 是以骨密度與骨量的下降, 骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)退變?yōu)樘卣鳎瑢?dǎo)致骨質(zhì)脆性的改變及人體全身骨代謝異常，因而常引起胸腰椎壓縮骨折、髖關(guān)節(jié)細(xì)微骨折等骨科病的一種退變性疾病[1-2]?！肮琴|(zhì)疏松癥”這一病名在中醫(yī)古籍中未有詳細(xì)準(zhǔn)確的記載，但由于其臨床癥狀大多表現(xiàn)為全身，尤其是腰背局部的廣泛性疼痛，且易發(fā)生細(xì)微骨折，與中醫(yī)“骨痿”的臨床癥狀較為相似，故常將其列為“骨痿”病的范疇[3]。骨碎補(bǔ)作為廣泛應(yīng)用于治療骨痿的傳統(tǒng)中藥，味苦、性溫，具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨、活血止血的作用?，F(xiàn)代藥理研究[4]表明，骨碎補(bǔ)能增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性，下調(diào)破骨細(xì)胞的活性，具有促成骨形成和減緩骨吸收的雙重作用。近年來，眾多學(xué)者對于骨碎補(bǔ)治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制和信號通路做了大量的實(shí)驗(yàn)研究，但缺少系統(tǒng)的歸納與總結(jié)。本文將從骨碎補(bǔ)對間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的作用及其對于骨質(zhì)疏松癥治療的作用機(jī)制通路，對骨碎補(bǔ)治療骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為下一步的臨床研究和實(shí)驗(yàn)開展提供更為深入詳細(xì)的理論指導(dǎo)。

1 骨碎補(bǔ)對于間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的作用

在生理?xiàng)l件下，成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞作為骨組織中的三種關(guān)鍵和重要的細(xì)胞類型形成了復(fù)雜的通信網(wǎng)絡(luò)，然而，過于活躍的成骨細(xì)胞介導(dǎo)的成骨活動(dòng)或破骨細(xì)胞依賴性骨吸收導(dǎo)致骨質(zhì)量或數(shù)量的病理學(xué)改變，從而出現(xiàn)骨質(zhì)的硬化或骨質(zhì)疏松癥[5]。骨碎補(bǔ)作為總黃酮類的一種混合物，其結(jié)構(gòu)多樣、純化困難，而柚皮苷屬于黃酮類單體物質(zhì)，稱多甲氧基黃酮，具備分子結(jié)構(gòu)清晰、相對分子質(zhì)量小、易于提純等特點(diǎn)。目前大部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明柚皮苷有促進(jìn)骨的形成、抑制破骨的發(fā)生、抗氧化、抗炎、保護(hù)神經(jīng)等作用，而在促進(jìn)成骨、抑制破骨等方面的研究最為廣泛[6-8]。

1.1 骨碎補(bǔ)對間充質(zhì)干細(xì)胞的作用

人類間充質(zhì)干細(xì)胞是人體內(nèi)的多能細(xì)胞，廣泛存在于成人骨髓中，可以未分化的細(xì)胞的身份進(jìn)行復(fù)制與增殖，同時(shí)也具備分化為間充質(zhì)組織的多向誘導(dǎo)分化能力[9]。間充質(zhì)干細(xì)胞具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，并且能夠遷移到炎性組織和腫瘤細(xì)胞的位置，具有歸巢效應(yīng)，被認(rèn)為是精確性和選擇性地傳遞抗癌藥物的有效載體[10]。近年來，隨著在基因?qū)用婧兔庖哒{(diào)節(jié)層面研究的更加深入，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可以產(chǎn)生具有向神經(jīng)元提供治療性RNA功能的外泌體，也可以通過直接的細(xì)胞-細(xì)胞接觸或通過其分泌體與先天性免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞進(jìn)行強(qiáng)有力的相互作用[11]。

骨碎補(bǔ)中有效提取物柚皮苷可增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用[12]。王軍松等[13]研究發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)總黃酮可能通過激活Wnt/β-catenin通路從而促進(jìn)β-catenin、Runx2的表達(dá)，抑制PPARG的表達(dá)來達(dá)到促進(jìn)BMSCs的倍增反應(yīng)和成骨分化的作用。周涵[14]在研究人牙周膜干細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可以通過激活具有調(diào)節(jié)多種發(fā)育過程的分泌性信號傳導(dǎo)通路Hedgehog信號通路，增強(qiáng)堿性磷酸酶活性和Runx2的表達(dá)，促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞的成骨分化，但過高濃度(10 mg/L和100 mg/L)的柚皮苷長期作用后可能會(huì)抑制細(xì)胞的增殖分化，降低其在長時(shí)間內(nèi)促成骨的作用。張虎林等[15]研究表明，不同劑量的骨碎補(bǔ)凍干粉(高劑量0.4 mg、中劑量0.1 mg、低劑量5 μg)可以誘導(dǎo)兔骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，誘導(dǎo)后的細(xì)胞可通過細(xì)胞免疫組化可以檢測Ⅱ型膠原的表達(dá)，尤其以低劑量組效果最佳。以上研究表明，在不同的組織和細(xì)胞中，合適濃度的骨碎補(bǔ)可以通過不同的信號通路來增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化作用，但需要在合適的濃度內(nèi)才能較好發(fā)揮作用，過高的藥物濃度反而會(huì)抑制細(xì)胞的增殖和分化能力。

1.2 骨碎補(bǔ)對成骨細(xì)胞的作用

成骨細(xì)胞是起源于多能間充質(zhì)干細(xì)胞的骨形成細(xì)胞，Runx2和Osx被認(rèn)為是成骨細(xì)胞譜系的主調(diào)節(jié)因子[16]。同時(shí)，成骨細(xì)胞是構(gòu)建骨骼的細(xì)胞，在其分化的所有階段都需要嚴(yán)格調(diào)節(jié)，從而保證適當(dāng)?shù)墓趋腊l(fā)育和機(jī)體穩(wěn)態(tài)[17]。成骨細(xì)胞衍生的血管內(nèi)皮生長因子可以改善骨再生和治療骨愈合缺陷，并有研究[18]發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長及骨量和骨血管的減少，血管內(nèi)皮生長因子的水平明顯下調(diào)，可能會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。

骨碎補(bǔ)提取物可通過調(diào)節(jié)多種代謝途徑和骨調(diào)節(jié)因子的表達(dá)來影響成骨細(xì)胞的增殖與分化。宋淵等[19]研究發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)含藥血清可明顯提高細(xì)胞增殖率、血清堿性磷酸酶(ALP)活性，有效促進(jìn)鈣鹽沉積、骨鈣素分泌，提高鈣化結(jié)節(jié)形成數(shù)量，從而證明骨碎補(bǔ)可有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與成骨分化。Ge等[20]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證明柚皮苷通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞自噬，增強(qiáng)細(xì)胞增殖與分化，有效提高骨密度。Shen等[21]將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分配成接受牽拉成骨技術(shù)治療組和常規(guī)骨折固定治療組，發(fā)現(xiàn)口服骨碎補(bǔ)總黃酮類化合物的大鼠通過調(diào)控PDGF-BB/PDGFR-β信號通路加快具有促進(jìn)骨的成血管-成骨耦聯(lián)作用的CD31Emcn血管的形成，對成骨和血管形成具有積極的調(diào)節(jié)作用。Li等[22]發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)總黃酮化合物可以促進(jìn)誘導(dǎo)膜中骨移植物的生長和礦化，促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟與增殖。孟春力[23]的研究發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)的乙醇提取物(濃度為0.02 g/mL)能對Runx2、OPN、OCN等成骨活性相關(guān)分子的表達(dá)有促進(jìn)作用，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的成骨活性，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞周期的快速發(fā)展與增殖，這種調(diào)節(jié)過程可能與PI3K/AKT信號通路、ERK1/2信號通路的活化有關(guān)。通過上述體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)可能通過激活不同的信號通路促進(jìn)細(xì)胞自噬、成骨及血管形成的過程，達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞的成骨和增殖分化的目的。

1.3 骨碎補(bǔ)對破骨細(xì)胞的作用

破骨細(xì)胞是多核巨細(xì)胞，其活性缺陷導(dǎo)致骨髓衰竭，過量活動(dòng)會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)流失甚至骨質(zhì)疏松癥，造成骨代謝紊亂[24]。破骨細(xì)胞在成人中是長壽的，并且它們的功能通過單個(gè)造血干細(xì)胞衍生的循環(huán)細(xì)胞與現(xiàn)有合胞體的迭代融合來維持[25]。數(shù)據(jù)表明，從親本細(xì)胞衍生的破骨細(xì)胞凋亡體的功能性遺傳顯示了它們在骨重塑中的破骨細(xì)胞-成骨細(xì)胞耦合中的橋接作用，對缺陷性修復(fù)區(qū)域血管生成和骨再生具有重要的影響[26]。

骨碎補(bǔ)提取液可抑制破骨樣細(xì)胞在骨髓體外培養(yǎng)時(shí)的分化增殖，通過抑制機(jī)制在破骨母細(xì)胞成熟轉(zhuǎn)化的過程中起作用，但與藥物濃度存在一定的聯(lián)系[27]。張峻瑋等[4]通過對去卵巢大鼠骨骼微細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)灌胃后可明顯提高去卵巢大鼠的骨密度、骨小梁數(shù)量等骨的微細(xì)結(jié)構(gòu)參數(shù)，調(diào)控破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性水平明顯下降，同時(shí)抑制對于骨組織結(jié)構(gòu)的吸收，具有明顯的骨保護(hù)作用。許金松等[28]通過對巨噬細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化進(jìn)行誘導(dǎo)的方法觀察不同濃度骨碎補(bǔ)含藥血清對巨噬細(xì)胞活性的影響，分析骨碎補(bǔ)總黃酮對破骨細(xì)胞分化成熟的作用。實(shí)驗(yàn)表明，巨噬細(xì)胞被不同濃度含藥血清誘導(dǎo)分化后，各組與其余未經(jīng)處理實(shí)驗(yàn)組相比，在破骨細(xì)胞數(shù)、融合指數(shù)等評價(jià)細(xì)胞分化水平的指標(biāo)上明顯減少，且降低程度與劑量呈正比關(guān)系，說明骨碎補(bǔ)含藥血清抑制大鼠巨噬細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的過程存在抑制。童徐[29]將小鼠顱頂骨的骨組織放入不同濃度的柚皮苷培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，對其進(jìn)行TRAP染色，發(fā)現(xiàn)隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組和對照組相比，著色的破骨細(xì)胞數(shù)量較前大幅度下降，且濃度為1 mg/L最為明顯。Wang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷通過促進(jìn)T細(xì)胞釋放IL-4來抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成和破骨細(xì)胞骨吸收。李風(fēng)波等[31]研究結(jié)果表明，柚皮苷可通過降低破骨細(xì)胞表達(dá)基因 Bcl-2/BAX比值，加速破骨細(xì)胞的凋亡過程，從而減少成熟破骨細(xì)胞數(shù)目，降低破骨細(xì)胞的骨吸收能力，凋亡原理可能是通過抑制破骨細(xì)胞表達(dá)基因 Bcl-2，促進(jìn)破骨細(xì)胞表達(dá)基因BAX，從而使BCL-2/降低，最終使 Caspase-3 活化，使破骨細(xì)胞進(jìn)入無法逆轉(zhuǎn)的凋亡。王琛[32]通過建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，對給予不同濃度柚皮苷標(biāo)品的牙周組織病理切片進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中牙槽嵴頂?shù)钠乒羌?xì)胞明顯減少，且4 %柚皮苷組有良好的抑制破骨能力。

綜上所述，骨碎補(bǔ)提取物對不同動(dòng)物、不同組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，對成骨細(xì)胞的成骨活性、細(xì)胞分化與增殖等具有促進(jìn)作用，同時(shí)可以有效抑制破骨細(xì)胞引起的骨吸收，從而達(dá)到維持骨代謝穩(wěn)態(tài)、改善骨質(zhì)疏松的作用。

2 骨碎補(bǔ)對于骨質(zhì)疏松癥治療的作用機(jī)制通路

骨碎補(bǔ)可通過多條通路，從細(xì)胞的增殖、分化與機(jī)體的免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多個(gè)方面，對干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、免疫細(xì)胞等產(chǎn)生調(diào)節(jié)與平衡作用[33]，通過參與調(diào)控骨吸收與骨合成，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)部骨代謝平衡，從而起到抗骨質(zhì)疏松的作用。其中，有兩大類信號通路被學(xué)者們廣泛研究，一種是通過參與支配骨的形成、促進(jìn)與骨形成相關(guān)信號蛋白的合成與釋放的信號通路，其中有較為典型的三種，分別是BMP-Smads信號通路、Wnt/β-catenin通路及 MAPK 信號通路；另一種是通過抑制骨吸收，降低骨質(zhì)流失，進(jìn)而避免骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的通路有OPG/RANKL/RANK 信號通路[34]。近年來，有一些實(shí)驗(yàn)研究表明，骨碎補(bǔ)亦可通過雌激素通路及Notch通路來達(dá)到改善骨質(zhì)疏松、調(diào)節(jié)骨代謝平衡的作用。

2.1 參與調(diào)控骨形成的信號通路

2.1.1骨碎補(bǔ)對于BMP-Smads信號通路的調(diào)控：骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)屬于轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β超家族成員，具有促進(jìn)胚胎發(fā)育、調(diào)控出生后骨骼生長及重建再生、誘導(dǎo)軟骨內(nèi)骨形成、維持成體穩(wěn)態(tài)平衡等作用[35]。Smads為BMP信號通路中的核心蛋白，對成骨細(xì)胞分化具有極為關(guān)鍵的影響[35]。BMP通過激活Smads蛋白進(jìn)一步轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)充當(dāng)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子及調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子核心結(jié)合蛋白影響成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)骨的形成。因此BMP-Smads 信號通路可以調(diào)控成骨細(xì)胞基因的表達(dá)，在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的成骨速率及進(jìn)一步的成骨分化過程中發(fā)揮重要的作用[36]。

沈智等[37]研究發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)總黃酮(6.75 mg/mL)能有效提高懸尾實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松大鼠細(xì)胞中BMP-2 mRNA的表達(dá)，從而起到抗骨質(zhì)疏松作用。董航等[38]在研究載骨碎補(bǔ)總黃酮磷酸鈣骨水泥對骨缺損模型大鼠誘導(dǎo)膜中成骨細(xì)胞分化的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)總黃酮可明顯促進(jìn)大鼠骨缺損區(qū)新生骨細(xì)胞中BMP-2、Smad1、Smad4、Smad7等蛋白的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟。Dong等[39]研究發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)及其標(biāo)記化合物(柚皮苷)可以通過抑制BMP-2和BMP-1A的結(jié)合，阻斷BMP-1A信號的傳導(dǎo)，同時(shí)促進(jìn)BMP-1B信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)骨細(xì)胞形成，從而控制細(xì)胞分化，導(dǎo)致成骨，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明骨碎補(bǔ)可能是骨組織工程的良好天然的BMP調(diào)節(jié)劑。通過以上研究結(jié)果可知，骨碎補(bǔ)可通過該通路的多個(gè)蛋白位點(diǎn)起作用，對具有骨誘導(dǎo)性的骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2作用尤為明顯，有效促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟分化，參與骨和軟骨的重建過程，進(jìn)而加速骨缺損修復(fù)，有效改善骨質(zhì)疏松癥。

2.1.2骨碎補(bǔ)對于Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控：Wnts是一類高度保守的分泌型糖蛋白，可以調(diào)節(jié)干細(xì)胞的多能性，在細(xì)胞增殖、分化及凋亡等分化發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[40]。Wnt/β-catenin 信號通路又稱為經(jīng)典Wnt信號通路，Wnt/β-catenin信號通路通過β-catenin的核異位，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，干預(yù)間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞等骨組織細(xì)胞的增殖及分化，廣泛參與骨代謝的調(diào)控[41]。

李琰等[42]對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠進(jìn)行骨碎補(bǔ)水煎液灌服處理后觀察大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)骨碎補(bǔ)水煎液灌服后大鼠BMSCs中Mnt10b、β-catenin、LRP5等基因表達(dá)顯著升高，LPL和PPARγ基因表達(dá)顯著下降，說明骨碎補(bǔ)可通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，抑制其成脂分化。李晉玉等[43]在實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用Wnt通路抑制劑DKK1，發(fā)現(xiàn)DKK1+骨碎補(bǔ)總黃酮組和DKK1+轉(zhuǎn)化生長因子β-catenin、LRP5、RUNX2、CyclinD1基因及蛋白表達(dá)明顯增加，且骨碎補(bǔ)總黃酮誘導(dǎo)的基因及蛋白表達(dá)水平與藥物劑量之間存在正比關(guān)系。陳云剛等[44]研究發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)含藥血清可明顯促進(jìn)BMSCs的增殖，提高ALP的活性和礦化結(jié)節(jié)數(shù)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)7 d后β-catenin、LRP5、RUNX2及Osterix mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，GSK-3β的表達(dá)顯著下調(diào)，胞質(zhì)中β-catenin、LRP5的蛋白表達(dá)水平升高，表明骨碎補(bǔ)含藥血清可能通過激活Wnt/β-catenin 信號通路來實(shí)現(xiàn)BMSCs的成骨分化。以上實(shí)驗(yàn)證明，骨碎補(bǔ)可通過激活Wnt/β-catenin 信號通路來誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖分化，從而有效治療骨質(zhì)疏松癥。

2.1.3骨碎補(bǔ)對于MAPK信號通路的調(diào)控：MAPK信號通路是調(diào)控成骨細(xì)胞生長、增殖分化的重要途徑，在眾多MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，ERK、p38 和 JNK 信號通路在細(xì)胞成骨分化中發(fā)揮著核心的作用[45]。EPK1和EPK2的許多底物參與控制細(xì)胞增殖、分化、存活和死亡的關(guān)鍵生理過程，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[46]。p38是一種多任務(wù)激酶，通過與大量底物相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞遷移和存活等，具有控制細(xì)胞周期進(jìn)展的能力[47]。JNK信號通路具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和存活的雙面性，可以誘導(dǎo)自噬來抑制癌細(xì)胞的凋亡[48]。

張力等[49]研究表明骨碎補(bǔ)總黃酮可加快成骨相關(guān)因子核結(jié)合因子α1 mRNA、堿性磷酸酶mRNA的轉(zhuǎn)錄，加入p38抑制劑SB203580后可使兩者表達(dá)明顯降低，說明骨碎補(bǔ)總黃酮可能通過MAPK/p38信號通路提高成肌細(xì)胞與成骨細(xì)胞之間的分化。齊鵬飛等[50]發(fā)現(xiàn)在模擬失重狀態(tài)下，骨碎補(bǔ)總黃酮可升高M(jìn)APK/ERK磷酸化水平，逆轉(zhuǎn)失重對細(xì)胞的影響，促進(jìn)細(xì)胞中出現(xiàn)較高的堿性磷酸酶表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，這可能與激活MAPK/ERK信號通路有關(guān)。以上研究表明，骨碎補(bǔ)總黃酮可能通過激活MAPK/p38和MAPK/ERK信號通路來促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。

2.2 參與調(diào)控抑制骨破壞的信號通路

骨碎補(bǔ)對于OPG/RANKL/RANK信號通路的調(diào)控：OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)以其在破骨細(xì)胞成熟、骨骼生長和骨重塑中的作用而聞名，NF-κB(RANK)的受體激活劑、NF-κB配體(RANKL)的受體激活劑和骨蛋白(OPG)是該信號系統(tǒng)的主要成分。OPG是特異性骨形成分泌蛋白，它與RANKL結(jié)合，發(fā)揮抗破骨細(xì)胞生成作用[51]。OPG作為RANKL的誘餌受體，參與抑制RANKL與RANK結(jié)合[51]。

張峻瑋等[52]對實(shí)驗(yàn)大鼠使用骨碎補(bǔ)水煎液灌胃處理后提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與破骨細(xì)胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)水煎液灌胃處理后OPG蛋白表達(dá)上升，RANKL及RANKL/OPG蛋白表達(dá)下降，說明骨碎補(bǔ)通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK信號通路來起到抑制破骨細(xì)胞分化成熟的作用。劉康等[53]發(fā)現(xiàn)不同濃度骨碎補(bǔ)總黃酮可使去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清雌二醇及OPG水平上調(diào)，RANKL及RANK水平明顯下降，從而達(dá)到減少破骨細(xì)胞的生成、抑制破骨細(xì)胞活化的目的。曾輝等[54]研究表明骨碎補(bǔ)總黃酮可使骨質(zhì)疏松大鼠下頜骨骨髓腔縮小，骨小梁間隙減小，同時(shí)通過調(diào)節(jié)大鼠血清OPG水平及OPG/RANKL比值，從而達(dá)到抑制下頜骨破壞吸收、防治下頜骨骨質(zhì)疏松的作用。以上研究表明，骨碎補(bǔ)總黃酮可能通過激活OPG/RANKL/RANK信號通路來抑制破骨細(xì)胞的分化成熟，從而起到防治骨質(zhì)疏松癥的作用。

2.3 骨碎補(bǔ)對于雌激素水平的調(diào)控

Wu等[55]實(shí)驗(yàn)證明柚皮苷增強(qiáng)了雌激素受體(ERα)向細(xì)胞核的易位及其反式激活活性，增加了具有骨缺陷的小鼠受損部位的ERα和ALP水平，同時(shí)提高了愈合率和骨強(qiáng)度。柚皮苷可以通過調(diào)節(jié)ERα依賴性ALP基因表達(dá)來改善成骨細(xì)胞礦化和骨愈合。Song等[56]的研究表明，柚皮苷可與雌激素受體結(jié)合，提高促進(jìn)血管生成的關(guān)鍵因子VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)基質(zhì)中的增殖和粘附，通過調(diào)控骨質(zhì)疏松大鼠的VEGF/VEGFR-2信號通路的方式來影響血管生成、促進(jìn)骨折愈合。雌激素水平的快速下滑是影響絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松較為突出的因素之一，對于骨碎補(bǔ)與雌激素信號通路的關(guān)系尚在研究中，但以上研究為我們提供了思路，說明骨碎補(bǔ)總黃酮可能通過雌激素受體激動(dòng)機(jī)制來調(diào)節(jié)骨代謝的平衡水平。

2.4 骨碎補(bǔ)對于Notch信號通路的調(diào)控

Notch受體家族包括4種類型的受體，分為Notch1、Notch2、Notch3和Notch4，在細(xì)胞分化和功能中起關(guān)鍵作用，其中Notch1和Notch2在機(jī)體整個(gè)發(fā)育過程中和成年哺乳動(dòng)物中的許多組織中廣泛表達(dá)[57]。Notch信號傳導(dǎo)控制破骨細(xì)胞分化和骨吸收活性，要么直接作用于破骨細(xì)胞前體，要么間接作用于成骨細(xì)胞譜系的細(xì)胞和免疫系統(tǒng)的細(xì)胞[58]。

黃敏玲等[59]研究發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)總黃酮可促進(jìn)大鼠骨組織中血管內(nèi)皮生長因子、CD31、Hes-1、BMP-2、Notch-1的表達(dá)，這可能與骨碎補(bǔ)總黃酮激活Notch通路從而促進(jìn)成骨-成血管耦聯(lián)、促進(jìn)骨組織的修復(fù)有關(guān)。黃翔宇等[60]發(fā)現(xiàn)JaggedⅠ(Notch配體)聯(lián)合去甲酸及骨碎補(bǔ)可下降Notch-1、Hes-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，抑制Notch信號通路，改善骨質(zhì)疏松。韓亞力等[61]骨碎補(bǔ)總黃酮可以提高血鈣和血磷水平，降低Notch-1、Hes-1 mRNA蛋白的表達(dá)，同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)總黃酮可以下調(diào)去甲酸所致的大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞Notch-1、Hes-1 mRNA和蛋白水平的升高，從而調(diào)節(jié)骨代謝平衡，這可能與對于Notch信號通路的抑制有關(guān)。

近年來，針對藥物通過調(diào)控Notch信號通路來治療骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究日益增多。國外有研究[62]指出一種可溶性的骨靶向融合蛋白D114激活Notch信號傳導(dǎo)，提高細(xì)胞成骨能力，促進(jìn)小鼠的骨形成，且不會(huì)導(dǎo)致不良反應(yīng)。國內(nèi)在此方面的研究以單味中藥為主，尤以對于淫羊藿的研究為多。有研究表明，淫羊藿發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松療效主要是與其對Notch通路具有活化或抑制的雙重作用有關(guān)[63]。鑒于目前國內(nèi)對于骨碎補(bǔ)通過調(diào)控Notch信號通路來治療骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究較少，且實(shí)驗(yàn)結(jié)論上存在較大差異，因此，結(jié)合與骨碎補(bǔ)同為補(bǔ)腎強(qiáng)骨類中藥淫羊藿的研究結(jié)果，能夠?yàn)檫M(jìn)一步研究探討骨碎補(bǔ)對Notch信號通路是否具有雙向調(diào)節(jié)作用，明確其基本作用機(jī)制具有重要的思路借鑒和理論指導(dǎo)，同時(shí)，也為骨碎補(bǔ)治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制研究提供了新的思路和方向。

3 結(jié)語

如何有效防治骨質(zhì)疏松、調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)部骨代謝平衡水平的臨床實(shí)驗(yàn)研究一直是醫(yī)學(xué)研究的熱門話題，尤其是近年來對于傳統(tǒng)中藥如何有效防治骨質(zhì)疏松、調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)部骨代謝平衡水平的臨床研究取得較為顯著的成果，其中骨碎補(bǔ)作為補(bǔ)腎強(qiáng)骨、活血化瘀類中藥的代表，對于其有效成分和作用機(jī)制研究更是成為熱點(diǎn)。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，在細(xì)胞分子水平，骨碎補(bǔ)可以通過調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化水平來有效防治骨質(zhì)疏松，但針對不同的細(xì)胞組織哪種濃度的骨碎補(bǔ)提取物效果最佳尚未得出明確的結(jié)論；在通路機(jī)制水平，骨碎補(bǔ)總黃酮可以通過作用于不同的通路機(jī)制來起到防治骨質(zhì)疏松的作用，但具體通過哪種類型的通路起到最佳的治療效果尚未明確，尤其是對于激活還是抑制Notch信號通路來起作用尚需進(jìn)一步研究，而且不同分子通路之間的相互作用需要進(jìn)一步明確。另外，骨碎補(bǔ)總黃酮是由多種化合物混合而成，需要進(jìn)一步純化有效成分，才能更有針對性治療骨科各類疾病。同時(shí)骨碎補(bǔ)總黃酮在以往的研究中多關(guān)注在防治骨質(zhì)疏松癥方面，近年來又發(fā)現(xiàn)它在促進(jìn)周圍神經(jīng)再生作用、促進(jìn)骨內(nèi)血管再生、改善骨內(nèi)血管微循環(huán)、抗炎止痛作用等方面的優(yōu)勢，這一發(fā)現(xiàn)為骨碎補(bǔ)總黃酮在臨床治療中的應(yīng)用開辟了更為全面的研究方向。