高齡女性卵子微環(huán)境的代謝組學(xué)研究進(jìn)展

甘冬英，周紅

高齡不孕女性生育力下降主要表現(xiàn)為卵巢儲備功能和卵子質(zhì)量降低。卵巢儲備功能降低表現(xiàn)為基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)減少、抗苗勒管激素水平下降及基礎(chǔ)卵泡刺激素（basic follicle-stimulating hormone，bFSH）水平升高等。卵子質(zhì)量降低表現(xiàn)為妊娠率下降、流產(chǎn)率增加等。因此，年齡相關(guān)性不孕已成為生殖醫(yī)學(xué)研究的熱點問題，但卵子衰老機(jī)制尚不明確。高齡女性生殖功能減退伴隨卵子微環(huán)境代謝物改變，涉及葡萄糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等，影響卵子的發(fā)育、成熟、受精等[1]。因此，卵子微環(huán)境代謝組學(xué)分析可篩選出與卵子質(zhì)量及數(shù)量下降相關(guān)的代謝物，探索年齡相關(guān)生殖功能減退的實質(zhì)，為改善體外受精-胚胎移植結(jié)局提供理論依據(jù)。

1 糖代謝

糖是體內(nèi)的主要供能物質(zhì)，葡萄糖是卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus oocyte complex，COC）產(chǎn)生腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的重要代謝物。在COC中，葡萄糖的代謝途徑包括無氧氧化、有氧氧化、磷酸戊糖途徑、己糖胺生物合成途徑等。大部分葡萄糖通過有氧氧化途徑提供能量。磷酸戊糖途徑提供COC成熟過程中DNA合成所需的嘌呤、核酸和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）等，為卵母細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的成熟提供底物。己糖胺生物合成途徑在細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)張和O-連接蛋白糖基化過程中為透明質(zhì)酸的生成提供底物。因此，葡萄糖代謝在卵子成熟過程中起重要作用[2]。

1.1 糖的無氧氧化糖的無氧氧化分為糖酵解和乳酸生成2個階段。在COC中，由于卵子缺乏胰島素調(diào)節(jié)的高親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體和糖酵解的限速酶磷酸果聚糖酶，糖酵解幾乎全部在卵丘細(xì)胞中進(jìn)行。卵丘細(xì)胞代謝葡萄糖，產(chǎn)生丙酮酸和乳酸鹽等代謝物，這些分子通過縫隙連接輸送至卵子[2]。丙酮酸和乳酸是糖無氧氧化的重要代謝物，丙酮酸通過乳酸脫氫酶生成乳酸。對牛的大、小卵泡研究發(fā)現(xiàn)，小卵泡氧含量較低，葡萄糖快速代謝產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致卵泡液乳酸堆積，損害卵子發(fā)育[3]。采用高分辨率1H-核磁共振波譜對超過40歲和25～35歲的女性卵泡液進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)超過40歲女性的卵泡液葡萄糖水平降低，乳酸水平升高。這與卵巢顆粒細(xì)胞葡萄糖攝取、乳酸脫氫酶和磷酸果糖激酶基因表達(dá)增加有關(guān)[4]。高齡女性糖的無氧氧化增加，導(dǎo)致葡萄糖利用率下降，可能通過上調(diào)糖酵解的相關(guān)基因表達(dá)，增加線粒體自噬及促凋亡蛋白表達(dá)，從而降低卵子發(fā)育潛能[5]。

1.2 糖的有氧氧化卵子生長過程中，卵丘細(xì)胞及卵子共同合作完成糖的有氧氧化。卵丘細(xì)胞產(chǎn)生丙酮酸輸送至卵子。丙酮酸在線粒體轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，乙酰輔酶A通過三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈生成ATP（ATP生成的主要途徑）。卵子上調(diào)卵丘細(xì)胞的糖酵解基因以確保自身丙酮酸的需求。葡萄糖通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化提供大量ATP，對卵泡正常生長和發(fā)育是必不可少的[2]。隨著年齡增長，女性機(jī)體抗氧化能力逐漸下降，活性氧（reactive oxygen species，ROS）堆積。卵子線粒體長期暴露于ROS，線粒體突變和功能異常的可能性增加，導(dǎo)致ATP產(chǎn)生減少，影響卵子質(zhì)量[6]。

高齡女性可補(bǔ)充脫氫表雄酮激活能量代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子活性，進(jìn)而調(diào)控下游生物發(fā)生相關(guān)基因，上調(diào)糖酵解基因表達(dá)，增加線粒體氧化磷酸化，增強(qiáng)細(xì)胞能量代謝。富含能量的細(xì)胞因衰老引起的程序性細(xì)胞死亡（如線粒體自噬、凋亡等）減少[7]。線粒體營養(yǎng)物質(zhì)輔酶Q10是一種隨著年齡增長而下降的脂溶性電子轉(zhuǎn)移劑，給高齡小鼠補(bǔ)充輔酶Q10可延緩卵巢儲備減少，修復(fù)卵巢線粒體基因表達(dá)，提高線粒體活性[8]。雖然使用線粒體營養(yǎng)素聽起來很吸引人，但其臨床效果仍需進(jìn)一步研究。

1.3 磷酸戊糖途徑磷酸戊糖途徑是一條參與機(jī)體多種代謝反應(yīng)、多種物質(zhì)信息傳遞的代謝途徑，由氧化階段和基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)階段組成。磷酸戊糖途徑除了受葡萄糖-6-磷酸脫氫酶制約外，還受細(xì)胞內(nèi)NADPH的調(diào)節(jié)[9]。NADPH在6-磷酸葡萄糖氧化為6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯的過程中產(chǎn)生。NADPH為脂質(zhì)和氨基酸的合成提供供氫體，并且是卵子發(fā)育過程中的主要還原劑之一，如可用于維持谷胱甘肽（glutathione，GSH）的還原狀態(tài)[2]。在豬卵子體外成熟過程中，抑制磷酸戊糖途徑后NADPH減少，GSH水平顯著降低，ROS水平增加，這說明磷酸戊糖途徑在維持高水平GSH和低水平ROS中發(fā)揮重要作用[5]。高齡小鼠卵子內(nèi)NADPH比年輕小鼠低[10]，這可能是高齡女性卵泡液磷酸戊糖途徑代謝異常導(dǎo)致GSH還原酶和過氧化氫酶水平下降的原因[11]。此外，磷酸戊糖途徑代謝物嘌呤核苷酸調(diào)節(jié)減數(shù)分裂進(jìn)程，NADPH調(diào)節(jié)卵子促成熟因子活性，共同參與卵子成熟[5]。如果抑制磷酸戊糖途徑，則降低卵子質(zhì)量，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低囊胚形成率[12]，這或許是高齡女性卵子非整倍體率增加的原因之一。

2 脂代謝

脂質(zhì)包括三酰甘油、膽固醇和磷脂等。三酰甘油儲存于卵子中，是卵子最豐富的脂質(zhì)之一，占脂質(zhì)的50%以上，是卵子巨大的能量儲備，用于線粒體β氧化產(chǎn)生能量。另外，膽固醇和磷脂的濃度是卵子受精后快速分裂形成膜的關(guān)鍵因素。因此，卵子微環(huán)境脂質(zhì)改變會影響卵子的能量代謝和發(fā)育[13]。

2.1 三酰甘油在排卵期間，卵子排出極體、顆粒細(xì)胞增殖、卵丘細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)等均是能量消耗的過程。三酰甘油通過脂肪動員生成甘油及脂肪酸。卵子通過線粒體氧化游離脂肪酸，增加能量消耗，這是一種比糖代謝更有效的ATP來源，如一分子葡萄糖氧化產(chǎn)生30或32個ATP，而等量脂肪酸棕櫚酸酯氧化卻產(chǎn)生106個ATP。COC的游離脂肪酸來自卵泡液攝取或細(xì)胞脂質(zhì)分解，后經(jīng)肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ進(jìn)入線粒體轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。經(jīng)β氧化產(chǎn)生的乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)徹底氧化生成ATP，產(chǎn)生的還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（reduced flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)ADH2）和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 （reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）經(jīng)呼吸鏈氧化，與腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）磷酸化耦聯(lián)生成ATP[2]。如果卵泡液中游離脂肪酸過多，產(chǎn)生毒性，會導(dǎo)致COC形態(tài)發(fā)育不良，影響卵子的核成熟[14]。反之，如果游離脂肪酸過少，則β氧化底物不足，亦影響卵子發(fā)育潛能[15]。與體內(nèi)成熟的COC相比，體外成熟的卵子和卵丘細(xì)胞的β氧化水平均降低，可能體外培養(yǎng)的COC缺乏左旋肉堿，導(dǎo)致β氧化供能不足。哺乳動物卵子質(zhì)量隨年齡增長而下降，部分歸因于游離脂肪酸及與β氧化有關(guān)的酶水平的降低[16]。

高齡女性卵子體外培養(yǎng)過程中補(bǔ)充左旋肉堿可提高卵子發(fā)育潛能，特別是提高優(yōu)質(zhì)胚胎率和囊胚形成率，增加健康新生兒出生數(shù)量。這是因為左旋肉堿可增加線粒體轉(zhuǎn)錄因子a和核呼吸因子1基因的表達(dá)，減少線粒體分布異常的卵子數(shù)，增加富含線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的卵子數(shù)，增加超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）的表達(dá)，促進(jìn)游離脂肪酸β氧化，保護(hù)卵子免受游離脂肪酸的毒性，從而提高獲卵數(shù)和囊胚形成率[15,17]。

2.2 膽固醇卵巢中的膽固醇是類固醇激素的合成前體，對卵泡的生長發(fā)育有重要影響。卵丘細(xì)胞是卵子膽固醇的主要來源。卵子不能從乙酸酯合成膽固醇，也不能通過受體介導(dǎo)選擇性地攝取膽固醇，因為高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）受體[如B族Ⅰ型清道夫受體（scavenger receptor class B type 1，SR-B1）]、低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）及膽固醇生物合成途徑中的7種轉(zhuǎn)錄酶均不在卵子中表達(dá)，但在卵丘細(xì)胞中高表達(dá)[18]。研究發(fā)現(xiàn)雖然卵泡液總膽固醇含量與年齡無關(guān)[19]，但高齡女性如21-羥基孕烯醇二硫酸酯、孕二醇-3-葡萄糖醛酸等類固醇的生成減少，孕酮、17α-羥基孕酮含量增加，這可能是由于膽固醇代謝增加所致[20]，也可能是由于膽固醇反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)受膽固醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白、FSH、LDLR及SR-B1等調(diào)控[18]。這些因素受膽固醇穩(wěn)態(tài)控制機(jī)制監(jiān)測，如當(dāng)類固醇激素減少時，F(xiàn)SH增強(qiáng)卵丘細(xì)胞LDLR和SRB1的表達(dá)，進(jìn)而增加卵丘細(xì)胞對膽固醇的攝取[18]。HDL是卵泡液中膽固醇的主要脂蛋白，因血液-卵泡屏障存在，其他大分子脂蛋白如低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白等在卵泡液中幾乎不存在[19]。

研究發(fā)現(xiàn)，HDL代謝與卵子發(fā)育間存在復(fù)雜的相互作用。血液HDL水平與胚胎質(zhì)量呈正相關(guān)[21]，但在體外培養(yǎng)中，HDL濃度過高對胚胎質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響[22]。蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法分析顯示，高齡女性卵泡液HDL比年輕女性低，且載脂蛋白A1和載脂蛋白CⅡ水平隨年齡增長而降低，載脂蛋白E反而升高，這提示高齡女性膽固醇與載脂蛋白的相互作用及分布對生育力有一定影響[23]?？偟膩碚f，與年齡相關(guān)的膽固醇代謝、調(diào)節(jié)及分布的改變，可能影響卵子質(zhì)量，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

2.3 磷脂作為生物膜的重要組成部分，磷脂分為甘油磷脂和鞘磷脂，在酶調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)運(yùn)中不可或缺。對35歲以上和35歲以下女性卵泡液脂質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，35歲以上女性的卵泡液一系列鞘磷脂類、甘油磷脂類等水平均發(fā)生顯著變化，提示鞘糖脂、甘油磷脂和磷脂酰肌醇磷酸可作為前瞻性脂質(zhì)生物標(biāo)志物[23]。一項關(guān)于小鼠MⅡ卵子的研究顯示，高齡小鼠卵子有26種磷脂類下降，如磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰絲氨酸等，而過氧化氫處理過的年輕小鼠卵子有35種磷脂類下降，二者下降的磷脂類重復(fù)率很高，提示卵子膜磷脂是衰老過程中氧化應(yīng)激的靶點，高齡小鼠卵子膜的完整性與其受精和發(fā)育潛能密切相關(guān)[24]。另一項研究使用超高效液相色譜和高分辨率質(zhì)譜對年輕（28～34歲）及高齡女性（35～48歲）卵泡液進(jìn)行代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，有3種磷脂代謝物下調(diào)[LysoPC(16:1)、LysoPC(20:4)、LysoPC(20:3)]和2種磷脂代謝物上調(diào)[LysoPC(18:3)、LysoPC (18:1)]，且體外受精結(jié)局亦提示獲卵率、2PN卵裂率和可移植胚胎率隨年齡增長而降低。提示溶血卵磷脂參與卵泡發(fā)育和卵子成熟的調(diào)節(jié)，其復(fù)雜的變化與卵泡發(fā)育密切相關(guān)[23]。

3 蛋白質(zhì)代謝

正常人卵泡液含有的蛋白質(zhì)參與細(xì)胞進(jìn)程，如受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、補(bǔ)體激活等，涉及的生物學(xué)功能包括細(xì)胞分化、增殖和凋亡等，與卵泡發(fā)育和卵子成熟密不可分。此外，這些蛋白質(zhì)在高齡女性及年輕女性中表現(xiàn)的差異性為與年齡有關(guān)的卵巢功能減退提供了生物學(xué)基礎(chǔ)[25]。

一項研究發(fā)現(xiàn)，年輕女性（20～32歲）與高齡女性（38～42歲）的卵泡液有19種蛋白存在差異，經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，高齡組有5種蛋白質(zhì)（補(bǔ)體C3及C4、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、血液結(jié)合素、激肽原）表達(dá)發(fā)生下調(diào)。其中，補(bǔ)體的活化可致血管內(nèi)皮生長因子缺乏，影響卵子成熟。而抗氧化蛋白血清轉(zhuǎn)鐵蛋白及血液結(jié)合素減少可致ROS過多而影響生育。激肽原促進(jìn)卵泡和黃體的生理性血管生成，年齡相關(guān)的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)損傷可能是原始卵泡和卵巢間質(zhì)血管生成不足所致，導(dǎo)致卵子的質(zhì)量及數(shù)量降低[23]。另外，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對卵丘細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行檢測，鑒定出1 423個蛋白，其中110個在高齡女性（40～45歲）和年輕女性（20～33歲）中存在差異，62個蛋白豐度增加，48個蛋白豐度減少，主要涉及脂肪酸代謝、氧化磷酸化和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制。參與脂肪酸代謝的蛋白表達(dá)增加，參與氧化磷酸化的蛋白和轉(zhuǎn)錄后RNA加工的蛋白表達(dá)減少[26]。因此，對卵子微環(huán)境蛋白質(zhì)組學(xué)的認(rèn)識可加深對卵泡發(fā)育過程的理解，有利于卵子質(zhì)量評價，為臨床改善年齡相關(guān)的生育力減退提供新的干預(yù)措施。

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的肽亞基。卵泡液和COC中關(guān)鍵氨基酸缺乏影響許多重要信號分子、受體和酶，進(jìn)而改變信號、代謝途徑及后續(xù)的卵子質(zhì)量。此外，氨基酸在卵子發(fā)育過程中獲得RNA轉(zhuǎn)錄信息，且參與DNA甲基化調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，如蛋氨酸通過形成S-腺苷蛋氨酸在DNA甲基化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[27]。

一項研究在卵泡液中鑒定出4種氨基酸，包括蛋氨酸、肌酸、組氨酸和反式-4-羥脯氨酸，且這4種氨基酸在高齡女性中的表達(dá)水平顯著高于年輕女性。其中蛋氨酸是同型半胱氨酸和肌酸的前體，同型半胱氨酸氧化產(chǎn)生自由基，對血管內(nèi)皮有毒性作用，可降低卵子成熟率。組氨酸具有血管生成和抗血管生成的特性，隨著年齡增長，可能抗血管生成占優(yōu)勢，進(jìn)而影響卵巢功能。反式-4-羥脯氨酸對卵巢作用的研究有限。年齡依賴性增加的蛋氨酸、組氨酸和反式-4-羥脯氨酸與卵子數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，可能是卵巢功能隨年齡增長而下降的原因[20,28]。相反，有些氨基酸隨年齡增長而下降，如D-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、脯氨酸。D-天冬氨酸可以誘導(dǎo)激素的生物合成和釋放，D-天冬氨酸水平越高，MⅡ卵子形態(tài)越好[23]。L-苯丙氨酸通過苯丙氨酸羥化酶參與神經(jīng)遞質(zhì)合成，其不足可影響下丘腦-垂體功能，對卵子發(fā)育不利[1]。脯氨酸保護(hù)膜和酶，清除自由基，作為鉀離子調(diào)節(jié)劑和抗氧化劑調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)滲透平衡，參與卵子的有絲分裂和減數(shù)分裂過程[1]。

4 結(jié)語和展望

高齡女性生育力下降的原因非常復(fù)雜，涉及到基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白以及代謝物等各個層面。卵子與局部微環(huán)境雙向?qū)υ?，涉及葡萄糖、脂質(zhì)、氨基酸等，對卵子發(fā)育成熟、受精及后續(xù)胚胎發(fā)育具有重要作用。由于代謝物與卵子及胚胎發(fā)育潛能之間的確定關(guān)聯(lián)及具體機(jī)制尚不明晰，未來還需進(jìn)一步從卵子局部微環(huán)境代謝物改變的角度探討年齡相關(guān)性生育力下降的可能因素，以期揭示年齡相關(guān)性卵巢功能減退的內(nèi)在機(jī)制，為改善高齡女性助孕生育結(jié)局提供方法。