生物信息學(xué)技術(shù)在生殖領(lǐng)域中的研究進(jìn)展

周理韡，鄭書(shū)棟，黃碩，魯婷，劉悅，丁之德

生物信息學(xué)（bioinformatics）是一個(gè)誕生于20世紀(jì)的新學(xué)科，其通過(guò)使用計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)和算法分析研究生物過(guò)程及生物大分子。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）2022年將生物信息學(xué)定義為：與遺傳學(xué)和基因組學(xué)相關(guān)的生物信息學(xué)，是一門(mén)涉及使用計(jì)算機(jī)技術(shù)收集、存儲(chǔ)、分析和傳播生物數(shù)據(jù)和信息的科學(xué)，如DNA和氨基酸的序列或這些序列的注釋?？茖W(xué)家和臨床醫(yī)生使用數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)組織和索引此類(lèi)生物信息，以增加對(duì)健康和疾病的了解。在某些情況下，生物信息學(xué)技術(shù)可運(yùn)用于臨床決策，從而作為整個(gè)醫(yī)療過(guò)程的部分工作[1]。在生殖系統(tǒng)的研究中，生殖細(xì)胞的多樣性、細(xì)胞發(fā)育環(huán)境的復(fù)雜性以及個(gè)體的差異性增加了研究的難度，為了進(jìn)行高效而又精確的研究，生物信息學(xué)分析技術(shù)在很大程度上為研究者提供了新的方法和思路?，F(xiàn)針對(duì)生物信息學(xué)在生殖系統(tǒng)中的研究現(xiàn)況，介紹近年在生殖系統(tǒng)研究中常用的生物信息學(xué)技術(shù)，以及在該領(lǐng)域取得的研究進(jìn)展，為后續(xù)研究提供新的思路。

1 基因組相關(guān)的生物信息學(xué)技術(shù)

1.1 二代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing）二代測(cè)序技術(shù)以其高通量和高準(zhǔn)確度為特點(diǎn)而進(jìn)入科研工作者們的視野，并已成為被廣泛使用的基因組技術(shù)之一。

1.1.1 外顯子測(cè)序（exome sequencing）外顯子測(cè)序常用來(lái)為生殖系統(tǒng)疾病的科學(xué)研究提供原始基因數(shù)據(jù)，進(jìn)而為后續(xù)研究奠定必要的基礎(chǔ)。Wei等[2]運(yùn)用該技術(shù)對(duì)人前列腺癌組織基因進(jìn)行分析并發(fā)現(xiàn)了210種基因突變，其中有133種突變發(fā)生在臨床前列腺癌研究中已知且易產(chǎn)生突變的基因片段。與未治療的前列腺癌患者相比，接受雄激素去勢(shì)治療且失敗的患者其前列腺癌組織中編碼CELSR3、CSMD1和FGD5等多個(gè)蛋白的基因片段有更多突變，表明這些基因突變可能是潛在的癌癥驅(qū)動(dòng)突變（driving mutations），該研究也為尋找前列腺癌治療的新靶點(diǎn)提供了方向。此外，Ballabio等[3]用外顯子測(cè)序檢測(cè)27份冷凍保存的腫瘤活檢標(biāo)本，初步確定了高級(jí)別漿液性上皮性卵巢癌患者共有的基因組異常，獲得的異常測(cè)序數(shù)據(jù)也在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中被用于識(shí)別體細(xì)胞拷貝數(shù)變化。

1.1.2 靶基因測(cè)序（targeted sequencing）靶基因測(cè)序能夠用于生殖系統(tǒng)組織器官的目的基因測(cè)序，以及疾病病理性質(zhì)和病變情況分析。Wei等[2]利用該技術(shù)驗(yàn)證了相關(guān)基因突變后發(fā)現(xiàn)，不同前列腺癌患者的腫瘤組織以及同一腫瘤組織不同位置處的基因突變并不完全相同，證明了前列腺癌在癌間和癌內(nèi)均存在異質(zhì)性。此外，Lee等[4]對(duì)217個(gè)與卵巢癌相關(guān)的基因進(jìn)行了靶向測(cè)序，還補(bǔ)充了常見(jiàn)單核苷酸突變的靶基因測(cè)序，從而確定了卵巢癌患者在新輔助化療后仍存在的殘留病變組織的基因組改變譜。該研究還發(fā)現(xiàn)，與沒(méi)有同源重組修復(fù)（homologous recombination repair，HRR）基因突變的患者相比，有HRR突變患者的腫瘤突變負(fù)荷更高，這表明該類(lèi)患者具有更多的潛在治療靶點(diǎn)。

1.1.3 染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序（chromatin immunoprecipitation-sequencing，ChIP-Seq）基于二代測(cè)序技術(shù)，ChIP-Seq技術(shù)可用于目的基因測(cè)序或識(shí)別基因變異等。Stelloo等[5]用ChIP-Seq技術(shù)對(duì)雄激素受體基因進(jìn)行測(cè)序，為后續(xù)的差異基因分析提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，Corona等[6]也運(yùn)用ChIP-Seq技術(shù)識(shí)別調(diào)控元件以及被獲得性非編碼變異干擾的基因，對(duì)原發(fā)性卵巢腫瘤中染色質(zhì)活性的組織類(lèi)型特異性進(jìn)行了表征。

1.2 DNA微陣列分析技術(shù)（DNA microarray）微陣列分析技術(shù)是一種先進(jìn)的全基因組拷貝數(shù)變異檢測(cè)技術(shù)，可以在排除正常生殖系統(tǒng)基因拷貝數(shù)變異的基礎(chǔ)上識(shí)別腫瘤特異性的基因組改變，因而在生殖系統(tǒng)領(lǐng)域基因組相關(guān)研究中具有重要地位，對(duì)相關(guān)疾病的病因分析和治療做出了貢獻(xiàn)[3]。

1.2.1 微陣列比較基因組雜交技術(shù)（array-comparative genomic hybridization，arrary-CGH）arrary-CGH可以為生殖系統(tǒng)相關(guān)疾病的病因分析提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐，也使研究過(guò)程更為嚴(yán)謹(jǐn)。如Yatsenko等[7]通過(guò)arrary-CGH對(duì)269例23～37歲的育齡女性和111例原發(fā)性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI）患者的X染色體進(jìn)行了高分辨率的基因拷貝數(shù)分析，并概述了兩者X染色體結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵差異，表明X染色體的拷貝數(shù)變異可能在POI病因?qū)W中發(fā)揮重要作用。此外，Ballabio等[3]也采用該方法對(duì)57份卵巢癌活檢標(biāo)本進(jìn)行了研究，并將研究范圍從外顯子測(cè)序能夠檢測(cè)到的編碼區(qū)域擴(kuò)大至整個(gè)基因組，發(fā)現(xiàn)2種不同的基因組技術(shù)獲得的體細(xì)胞拷貝數(shù)變化無(wú)差異，再次驗(yàn)證了高級(jí)別漿液性上皮性卵巢癌患者所共有的基因組異常，確保了研究的嚴(yán)謹(jǐn)性和科學(xué)性。

1.2.2 微陣列單核苷酸多態(tài)性技術(shù)（array-single nucleotide polymorphisms，array-SNP）基于單核苷酸多態(tài)性微陣列的核型定位能夠分析分布在整個(gè)基因組中的數(shù)千個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP），從而確定個(gè)體的基因型。Cariati等[8]發(fā)現(xiàn)通過(guò)將父母染色體中與待研究疾病相關(guān)的SNP與胚胎細(xì)胞中存在的SNP進(jìn)行比較，可以確定突變攜帶者。此外，該技術(shù)還可為生殖系統(tǒng)相關(guān)疾病的治療提供新的思路。如Cuppens等[9]用array-SNP對(duì)全基因組體細(xì)胞突變進(jìn)行了特征分析，深入了解并確定了潛在的子宮平滑肌肉瘤治療的新靶點(diǎn)，為這種治療方法有限的罕見(jiàn)惡性腫瘤提供了新的治療線(xiàn)索。

2 轉(zhuǎn)錄組相關(guān)的生物信息學(xué)技術(shù)

2.1 單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)（single cell RNA sequence，scRAN-Seq）傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)的測(cè)序?qū)ο缶窒抻诮M織內(nèi)的混雜細(xì)胞群，無(wú)法解答單一細(xì)胞間的異質(zhì)性表達(dá)。單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組分析則可以在細(xì)胞水平上研究基因的表達(dá)模式，開(kāi)啟了腫瘤等復(fù)雜組織組學(xué)研究的新篇。近年各種類(lèi)型的scRAN-Seq和相關(guān)的分析工具蓬勃發(fā)展并運(yùn)用于生殖系統(tǒng)的研究，如檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組信息、識(shí)別細(xì)胞亞型[10]、跟蹤細(xì)胞譜系[11]、構(gòu)建基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等[12]，為生殖系統(tǒng)組成細(xì)胞的特征提供了有意義的信息。

2.1.1 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（spatial transcriptome technology，ST）由于單一scRAN-Seq僅針對(duì)單個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞空間信息的丟失難以避免，而ST技術(shù)恰好能夠定位和區(qū)分功能基因在特定空間位置的表達(dá)情況，并識(shí)別腫瘤組織的空間異質(zhì)性。通過(guò)使用一種去卷積（deconvolution）的ST技術(shù)，Berglund等[13]首次分析了同一多灶性前列腺癌的近6 750個(gè)組織區(qū)域的轉(zhuǎn)錄組水平，發(fā)現(xiàn)不同組織區(qū)域內(nèi)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組水平存在顯著差異，確認(rèn)了腫瘤組織存在空間信息的價(jià)值。此外，基于ST技術(shù)定位的癌癥表達(dá)區(qū)域可以延伸到基于病理學(xué)標(biāo)注的腫瘤區(qū)域邊界之外，提示空間基因表達(dá)譜可用于預(yù)測(cè)癌癥、前列腺上皮內(nèi)瘤變（prostatic intraepithelial neoplasia）或炎癥的潛在侵襲區(qū)域。因此，這種大規(guī)模的組織區(qū)域分析可以作為基于轉(zhuǎn)錄組的癌癥組織臨床評(píng)估基礎(chǔ)，同時(shí)提供信息更為全面的腫瘤微環(huán)境基因表達(dá)譜。另外，Garcia-Alonso等[14]首次用單細(xì)胞測(cè)序和Visium空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)結(jié)合的方法分析了3份篩查潛在子宮內(nèi)膜疾病的子宮內(nèi)膜活檢樣本及6份死于非婦科原因的供體子宮內(nèi)膜樣本，成功繪制了育齡期婦女整個(gè)月經(jīng)周期的子宮細(xì)胞狀態(tài)圖譜，這為研究許多被忽視的子宮內(nèi)膜疾病提供了重要參考。

2.1.2 時(shí)間序列的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析（single-cell transcriptome analysis of time series）正常生理活動(dòng)的進(jìn)程或疾病的發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，時(shí)間序列的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析通過(guò)對(duì)同源同種細(xì)胞進(jìn)行差異時(shí)間采集分析，依次構(gòu)建出特定細(xì)胞隨傳代數(shù)增加而改變的表達(dá)譜，這對(duì)探究個(gè)體發(fā)育等進(jìn)程具有特殊意義。如Stévant等[11]對(duì)卵巢Nr5a1-綠色熒光蛋白（Nr5a1-GFP）陽(yáng)性體細(xì)胞使用時(shí)間序列單細(xì)胞RNA測(cè)序，確定了一個(gè)產(chǎn)生前顆粒細(xì)胞和潛在的類(lèi)固醇生成前體細(xì)胞的早期祖細(xì)胞群。此外，在比較XX和XY體細(xì)胞的時(shí)間序列單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，性腺支持細(xì)胞源于早期祖細(xì)胞，且分化過(guò)程中不涉及性別特異性表達(dá)。類(lèi)固醇生成前體細(xì)胞的分化具有類(lèi)似的特點(diǎn)，僅XX細(xì)胞表達(dá)有延遲。該研究結(jié)果從單細(xì)胞測(cè)序視角為進(jìn)一步研究睪丸和卵巢發(fā)育的分子和細(xì)胞程序提供了重要資源。此外，Cao等[15]對(duì)61只孕第9.5、10.5、11.5、12.5或13.5天的母鼠分別使用單細(xì)胞組合索引RNA測(cè)序技術(shù)（第3版）分析了約200萬(wàn)個(gè)小鼠胚胎細(xì)胞，由此形成的“小鼠器官發(fā)生細(xì)胞圖譜”可提供小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程的全局視圖，尤其是發(fā)育關(guān)鍵的窗口期細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。

2.2 生殖相關(guān)非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）轉(zhuǎn)錄組分析ncRNA是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控物，測(cè)序ncRNA及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有利于研究者理解生殖相關(guān)信號(hào)通路的走向及相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展的影響因素，為下一步的基礎(chǔ)研究奠定必要的基礎(chǔ)。Zeng等[16]基于共表達(dá)和競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA理論以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)手段挖掘出多囊卵巢綜合征發(fā)展的關(guān)鍵長(zhǎng)鏈非編碼RNA、微小RNA和mRNA，并尋找可能通過(guò)逆轉(zhuǎn)其表達(dá)而發(fā)揮作用的潛在治療藥物。此外，Guo等[17]利用RNA測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)衰老將會(huì)改變小鼠和人類(lèi)精子tRNA來(lái)源的小RNA（tRNA-derived small RNA，tsRNA）表達(dá)譜，且該變化能通過(guò)跨代遺傳導(dǎo)致子代發(fā)生焦慮。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)的生物信息學(xué)技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)的研究多應(yīng)用于腫瘤或生殖系統(tǒng)障礙的生物性標(biāo)志物的研究，同時(shí)也為臨床治療提供了新的靶點(diǎn)和視角[18]。目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究方式多為利用質(zhì)譜分析目標(biāo)蛋白[19]，再通過(guò)各種數(shù)據(jù)庫(kù)繪制其信號(hào)、生化通路或使用基因本體論富集分析（Gene Ontology，GO）研究目標(biāo)蛋白的作用[20]。

3.1 質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）及其聯(lián)用質(zhì)譜是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的常用方法，一般與各類(lèi)分離技術(shù)結(jié)合，分離復(fù)雜的生物樣品并從中檢測(cè)出目標(biāo)蛋白[21]。

3.1.1 基質(zhì)輔助激光解析/電離成像質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption/ionization-mass spectrometry imaging，MALDI-MSI）MALDI-MSI可用于尋找生殖系統(tǒng)相關(guān)疾病的生物標(biāo)志物，Lahiri等[22]利用MALDIMSI結(jié)合鳥(niǎo)槍蛋白質(zhì)組學(xué)（shotgun proteomics）發(fā)現(xiàn)睪丸中芳香化酶P450過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致生精障礙并出現(xiàn)炎癥，提示睪丸正常生精過(guò)程遭到破壞。因此，芳香化酶P450或可作為男性不育的診斷標(biāo)志物。此外，邱曉菲等[23]使用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)分析宮頸鱗癌組織切片，獲取早期浸潤(rùn)宮頸鱗癌的分子標(biāo)志物，并發(fā)現(xiàn)了7種有意義的差異蛋白，為宮頸癌的診斷及治療提供了新的思路。朱宇[24]利用MALDI-MSI分子成像技術(shù)對(duì)多囊卵巢綜合征患者子宮組織進(jìn)行檢測(cè)，為多囊卵巢綜合征小分子代謝物的研究提供了新的方法。

3.1.2 基于順序窗口采集所有理論質(zhì)譜（sequential window acquisition of all theoretical spectra MS，SWATH-MS）的無(wú)標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)SWATHMS在研究中的優(yōu)勢(shì)在于該方法可對(duì)復(fù)雜的大樣本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量，并保證高重復(fù)性和一致性。Kumar等[25]用SWATH-MS法在20名孕婦的高位陰道液（high vaginal fluid）蛋白質(zhì)組中確定了61種蛋白質(zhì)在妊娠中晚期發(fā)生了明顯的改變。

3.1.3 其他高新技術(shù)近年有很多的新型技術(shù)不斷涌現(xiàn)。有研究用元蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究女性感染人類(lèi)免疫缺陷性病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的可能性與自身狀況和陰道內(nèi)微生物的相關(guān)性，從而對(duì)不易培養(yǎng)的環(huán)境微生物蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，感染HIV的女性患者的生殖道黏膜蛋白出現(xiàn)功能障礙，而這些黏膜蛋白的變化與女性體內(nèi)激素異常、炎癥以及陰道微生物菌群的影響密切相關(guān)[26]。另外，也有研究通過(guò)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的分析策略，利用膜滲透活性探針表征位于細(xì)胞質(zhì)中溶酶體的相關(guān)功能性蛋白，從而在蛋白層面識(shí)別細(xì)胞群的異質(zhì)性[27]。

3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)常用數(shù)據(jù)庫(kù)實(shí)現(xiàn)高通量的研究離不開(kāi)對(duì)大量數(shù)據(jù)的運(yùn)算。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)可以快捷地儲(chǔ)存、提取生物數(shù)據(jù)，并進(jìn)行簡(jiǎn)單的分析和預(yù)測(cè)。

3.2.1 傳統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)一些尋找關(guān)鍵蛋白或者標(biāo)志物的研究常用GO富集分析對(duì)檢測(cè)到的大量蛋白質(zhì)進(jìn)行分類(lèi)，從而篩選出目標(biāo)蛋白。Hitit等[28]利用GO富集分析將高生育率公羊與低生育率公羊精子中的大量蛋白進(jìn)行富集，并對(duì)差異蛋白GO生物過(guò)程進(jìn)行標(biāo)注，發(fā)現(xiàn)其最具代表性的蛋白質(zhì)用于細(xì)胞呼吸，腺苷三磷酸（adenosine-triphosphate，ATP）代謝過(guò)程，纖毛或鞭毛依賴(lài)性細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；而對(duì)GO細(xì)胞組分分析發(fā)現(xiàn)，最具代表性的蛋白質(zhì)存在于線(xiàn)粒體基質(zhì)和運(yùn)動(dòng)纖毛等細(xì)胞器中。

另一方面，在一些信號(hào)通路或生化通路的研究中，京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)可以提供重要的靶分子通路信息。在對(duì)附睪各段解剖特征的分析研究中，Zhao等[29]對(duì)不同附睪分區(qū)的大量蛋白質(zhì)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)大量的附睪蛋白質(zhì)主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)通路，如蛋白質(zhì)處理和代謝相關(guān)的信號(hào)，而在附睪尾部發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)則參與了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和黏附過(guò)程。

3.2.2 新型數(shù)據(jù)庫(kù)除了傳統(tǒng)的GO分析和KEGG分析，更為先進(jìn)的通路分析軟件（Ingenuity Pathway Analysis，IPA）也逐漸在各類(lèi)研究中得到應(yīng)用。如對(duì)慢性高脂肪飲食小鼠睪丸蛋白的研究中，Jarvis等[30]使用IPA方法圍繞慢性高脂肪飲食對(duì)睪丸的影響進(jìn)行了通路分析，證實(shí)通過(guò)慢性高脂肪飲食改變的102種睪丸差異表達(dá)蛋白很多都是功能相關(guān)的。與傳統(tǒng)的GO富集分析和KEGG通路分析相比，IPA主要用于分析組學(xué)數(shù)據(jù)，以及構(gòu)建個(gè)性化通路，以更直觀地反映其內(nèi)在通路與上下游之間的關(guān)系。

4 代謝組相關(guān)的生物信息技術(shù)

與基因組和蛋白質(zhì)組分析相比，人類(lèi)代謝物僅由大概3 000種代謝物組成，較少的代謝物數(shù)量意味著可以更快地進(jìn)行分析，在臨床上具有實(shí)際運(yùn)用價(jià)值。

4.1 核磁共振光譜（nuclear magnetic resonance，NMR）NMR是分析生物流體的理想平臺(tái)，只需要制備少量小體積樣品即可快速、非破壞性地針對(duì)代謝物進(jìn)行分析。NMR可用于研究生殖系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的機(jī)體代謝差異。McClements等[31]通過(guò)高分辨率1HNMR比較子宮灌注壓降低誘導(dǎo)的母體心臟、胎兒心臟和胎盤(pán)的代謝組分變化，發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)和母體心臟的能量代謝、碳水化合物、脂質(zhì)和氨基酸代謝變化較大，而胎兒心臟的代謝變化較小。此外，NMR還可以幫助診斷生殖系統(tǒng)疾病。Reynolds等[32]利用1H-NMR對(duì)密度梯度離心后獲得的不同層次精子進(jìn)行代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，如所選的精子群體存在形態(tài)缺陷，則提示未成熟精子比例較高，且精子中乳酸、膽堿和甘油磷酸膽堿濃度也偏高，脂質(zhì)組成也同樣存在差異。NMR技術(shù)可從低濃度精子樣本中獲取大量分子信息，證明了其運(yùn)用于少精子癥、弱精子癥或畸形精子癥患者精子檢查分析的可行性。

4.2 質(zhì)譜及其聯(lián)用質(zhì)譜比NMR更為敏感，并且通常需要材料更少，動(dòng)態(tài)范圍也較廣，但質(zhì)譜的重現(xiàn)性較差。

4.2.1 液相色譜聯(lián)用（liquid chromatography-MS/MS，LC-MS/MS）LC-MS/MS可作為一種篩查工具，在不育原因不明的情況下檢測(cè)男性不育的因素。Engel等[33]用LC-MS/MS分析20名健康捐贈(zèng)者的精子和精漿中氨基酸、生物胺、糖等多個(gè)代謝物，發(fā)現(xiàn)精子中的代謝物與精子活力密切相關(guān)，而精漿中的代謝物與精子濃度和形態(tài)密切相關(guān)。Walters等[34]通過(guò)LC-MS/MS分析了94例體外受精婦女卵巢刺激后的血清與相匹配的單顯性卵泡液的類(lèi)固醇譜，發(fā)現(xiàn)在血清和卵泡液中均可檢測(cè)到孕酮、雌二醇、雌酮、脫氫異雄酮、雄烯二酮和睪酮，而只有少數(shù)血清和卵泡液樣品中檢出了二氫睪酮、3α,5α戊二醇、3β,5α雄固烷二醇，該研究未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)的可預(yù)測(cè)體外受精成功率的類(lèi)固醇因子。Yuan等[35]對(duì)鵝卵泡發(fā)育過(guò)程中的硬脂酰輔酶A氫酶（stearoyl-CoA desaturase，SCD）進(jìn)行代謝組學(xué)分析，在SCD過(guò)表達(dá)組和敲除組用LC-MS/MS測(cè)定顆粒細(xì)胞中SCD的功能，結(jié)果顯示膽固醇在過(guò)度表達(dá)組中變化最大，而泛醇在敲除組中變化最大。基于以上數(shù)據(jù)，該研究認(rèn)為膽固醇和泛醇可作為研究SCD相關(guān)脂質(zhì)代謝的潛在代謝組學(xué)生物標(biāo)志物。

4.2.2 高效液相色譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography/MS）高效液相色譜聯(lián)用可用于生殖系統(tǒng)疾病潛在病理機(jī)制的研究。Yu等[36]用高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)花生四烯酸的靶向代謝網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)弱精子癥患者異常的花生四烯酸代謝網(wǎng)絡(luò)可通過(guò)脂氧合酶、細(xì)胞色素P450和環(huán)氧合酶代謝途徑激活p38絲裂原活化蛋白激酶，從而降低精子活力。

4.2.3 氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用 （gas chromatography/MS，GC/MS）GC/MS常適用于尋找生殖系統(tǒng)疾病的潛在生物標(biāo)志物，以期幫助疾病的診斷和治療。Zhao等[37]通過(guò)運(yùn)用GC/MS的非靶向代謝組學(xué)方法對(duì)特發(fā)性弱精子癥患者和健康受試者的精子細(xì)胞樣本中含有的33種代謝物進(jìn)行了鑒定與分析，發(fā)現(xiàn)在特發(fā)性弱精子癥組中有27種代謝物減少，6種代謝物增加，其中有一些代謝物是首次被報(bào)道。

4.2.4 超高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用 （ultra-high performance liquid chromatography/MS，UHPLC/MS）UHPLC/MS主要借助了高效液相色譜的原理，涵蓋了小顆粒填料、快速檢測(cè)手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量、敏感度及色譜峰容量。UHPLC/MS可用于發(fā)現(xiàn)生殖系統(tǒng)疾病的潛在代謝標(biāo)志物。Ilhan等[38]使用UHPLC/MS分析女性宮頸陰道代謝物差異，共計(jì)發(fā)現(xiàn)475種已知代謝物，其中與HPV陰性組相比，HPV陽(yáng)性組和宮頸發(fā)育不良組的宮頸陰道代謝物的多樣性降低，特定的氨基酸和核苷酸類(lèi)代謝物減少，但宮頸癌患者的代謝物多樣性增加，尤其是多種脂質(zhì)類(lèi)代謝物增多。

此外，UHPLC/MS還可用于探索生殖系統(tǒng)疾病相關(guān)的毒理學(xué)機(jī)制研究。Shi等[39]使用UHPLC/MS和Q-Exactive高分辨率質(zhì)譜儀分析結(jié)果表明，暴露于PM2.5的小鼠精母細(xì)胞的總氨基酸濃度、核苷酸濃度顯著降低，且顯著減少的氨基酸大多參與了檸檬酸循環(huán)，證明暴露于PM2.5會(huì)導(dǎo)致小鼠睪丸精母細(xì)胞線(xiàn)粒體的功能受損，引起精母細(xì)胞損傷和精子活力下降。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

生物信息學(xué)在生殖系統(tǒng)中的應(yīng)用非常廣泛，基因組和轉(zhuǎn)錄組的研究為下游蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供了支持，而作為大部分生化過(guò)程的終產(chǎn)物，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究最為廣泛。利用二代測(cè)序技術(shù)和基因芯片技術(shù)等，根據(jù)差異表達(dá)的基因組和轉(zhuǎn)錄組，尋找出研究各類(lèi)組織及器官中的目標(biāo)基因，而后通過(guò)質(zhì)譜等方法研究其表達(dá)產(chǎn)物。后續(xù)可以通過(guò)KEGG和GO富集分析將目標(biāo)蛋白作為標(biāo)志物或臨床靶點(diǎn)研究，也可以利用其他數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白序列進(jìn)行建?；蝾A(yù)測(cè)性質(zhì)。目前，在生殖系統(tǒng)疾病的病理機(jī)制研究中，大部分都集中在對(duì)某一生殖系統(tǒng)疾病致病基因、標(biāo)志物蛋白或臨床靶點(diǎn)的探索等。另一方面，臨床上也常運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)代謝終產(chǎn)物進(jìn)行檢查分析。此外，精子的發(fā)育過(guò)程作為男性生殖的一個(gè)研究重點(diǎn)，其所處環(huán)境的特殊性、蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)空差異性和研究標(biāo)本的個(gè)體差異都增加了研究難度，這也使得生物信息學(xué)技術(shù)在此類(lèi)研究中的作用至關(guān)重要。需要指出的是，生物信息技術(shù)在生殖系統(tǒng)疾病病理機(jī)制探索中的應(yīng)用極大地推動(dòng)了相關(guān)疾病臨床診治進(jìn)程的優(yōu)化，如男性不育的診斷分子和治療靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)等，相信生物信息學(xué)技術(shù)必定會(huì)持續(xù)發(fā)揮巨大作用，也會(huì)更進(jìn)一步促進(jìn)生殖系統(tǒng)基礎(chǔ)理論研究的不斷創(chuàng)新。