3種致病菌多重real-time PCR檢測(cè)方法的建立及其在散裝即食肉制品中的應(yīng)用

范 維，高曉月，李賀楠，董雨馨，李宇軒，劉虹宇，郭文萍

（中國(guó)肉類食品綜合研究中心，北京食品科學(xué)研究院，北京 100068）

隨著人們膳食習(xí)慣的改變，食品生產(chǎn)加工模式和銷售方式也發(fā)生了變化，即食食品由于方便、快捷等優(yōu)點(diǎn)已成為廣大消費(fèi)者推崇的快銷食品[1-2]。此類食品主要是指不需要額外加工處理即可食用，該類食品或是未經(jīng)烹煮或已經(jīng)煮熟、燙熱或冰凍，無(wú)需再經(jīng)加熱處理（包括翻熱）[3]。即食食品較為常見的銷售形式為散裝銷售，散裝即食食品因略去繁瑣的包裝，買賣隨意方便，降低了食品的成本，倍受消費(fèi)者和生產(chǎn)者的青睞。但是由于散裝即食食品的制作、銷售過程中，銷售者與食品的接觸以及食品與空氣的接觸，導(dǎo)致微生物性“二次污染”的可能性加大，增加了散裝即食食品的致病菌污染風(fēng)險(xiǎn)，特別是熟肉制品、涼拌菜等[4-5]。目前，針對(duì)散裝即食食品國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)已經(jīng)擬訂了《散裝即食食品中致病菌限量》標(biāo)準(zhǔn)草案，該草案中對(duì)散裝即食食品中需檢測(cè)的致病菌以及各致病菌的限量提出了明確要求，其中熱處理散裝即食食品要求檢測(cè)的致病菌有沙門氏菌（Salmonella，SAL）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）和蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，BC）3種。對(duì)于這3種致病菌的檢測(cè)，傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)和鑒定方法一般要經(jīng)過增菌培養(yǎng)、分離純化、生化鑒定和血清學(xué)驗(yàn)證等多個(gè)步驟，檢測(cè)周期長(zhǎng)，操作繁瑣[6-7]；免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)存在靈敏度偏低、檢測(cè)通量小等缺點(diǎn)[8]；生物傳感器技術(shù)[9]、質(zhì)譜技術(shù)[10-11]成本較高，需要專業(yè)人員操作，不易在基層普及推廣。因此，建立一種高通量、準(zhǔn)確、快速的致病菌檢測(cè)方法顯得尤為重要。

多重實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技術(shù)因其在檢測(cè)通量、時(shí)效性、靈敏度以及成本方面的優(yōu)勢(shì)得到迅速發(fā)展[12-13]。Elisa等[14]利用三重real-time PCR方法實(shí)現(xiàn)了肉制品中SAL、大腸埃希氏菌O157:H7和單核細(xì)胞性李斯特菌3種食源性致病菌的同時(shí)檢測(cè)。Qin Hong等[15]利用多重real-time PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶中單核細(xì)胞性李斯特菌、坂崎克羅諾桿菌、SA的檢測(cè)。李濤等[16]利用多重realtime PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)海產(chǎn)品中霍亂弧菌、副溶血性弧菌和單核細(xì)胞性李斯特菌的快速檢測(cè)。但目前對(duì)于采用多重TaqMan探針real-time PCR技術(shù)同時(shí)定量檢測(cè)肉制品中SAL、SA和BC的研究較少。因此，本研究旨在建立一種高通量、快速、準(zhǔn)確、靈敏的SAL、SA和BC三重realtime PCR檢測(cè)方法，以應(yīng)用于市場(chǎng)上散裝即食肉制品的檢驗(yàn)，為監(jiān)管部門進(jìn)行散裝即食食品病原微生物風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與菌種

實(shí)驗(yàn)采用散裝即食肉制品指熟的純?nèi)庵破罚玑u牛肉、醬肘子、烤羊腿肉、熏鴨肉、熏雞胸肉等，購(gòu)自超市、門市店或農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

菌株共有27 株，包括SAL 6 株、SA 3 株、BC 3 株、非目標(biāo)菌株15 株，保存于-80 ℃冰箱。其中SA（ATCC 25923）、鴨沙門氏菌（ATCC 9270）、BC（ATCC 8187）、大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、伊氏李斯特氏菌（ATCC 19119）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（ATCC 13124）、志賀菌（ATCCA 9207）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、產(chǎn)氣腸桿菌（ATCC 13048）、英諾克李斯特氏菌（ATCC 33090）、副溶血性弧菌（ATCC 17802） 美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)；鼠傷寒沙門氏菌（CGMCC 1.1190）、SA（CGMCC 1.0089）、表皮葡萄球菌（CGMCC 1.2429）、弗氏檸檬酸桿菌（CGMCC 1.1732） 中國(guó)微生物菌種保藏中心；甲型副傷寒沙門氏菌（CICC 24167）、腸炎沙門氏菌（CICC 21482）、嬰兒沙門氏菌（CICC 21481）、乙型副傷寒沙門氏菌（CICC 10437）、BC（CICC 10041）、SA（CICC 10384）、阪崎腸桿菌（CICC 21544）、熒光假單胞菌（CICC 21620） 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；BC（CMCC 63303）、單核細(xì)胞性李斯特菌（CMCC 54002）、枯草芽孢桿菌（CMCC 63501）、普通變形桿菌（CMCC 49027） 中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）、腦心浸液肉湯（brain heart lnfusion，BHI）、胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）、緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）、李氏增菌肉湯（listeria enrichment broth base，LB）、7.5%氯化鈉肉湯（7.5%鹽）、胰酪胨大豆多黏菌素肉湯（trypticase soy polymyxin broth base，TSPBB） 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 廣州迪澳生物科技有限公司；2×PCR Premix ExTaqTM大連寶生物科技有限公司；引物、探針合成 上海英濰捷基科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FTC3000熒光定量PCR 加拿大楓嶺科技有限公司；DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TD4低溫高速離心機(jī) 鑫港儀器有限公司；SterilGARD III Advance 生物安全柜 美國(guó)貝克公司。

1.3 方法

1.3.1 引物與TaqMan探針設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中登錄的SALinvA基因、SASa442基因和BCCereolysin AB基因的保守序列，應(yīng)用Priemer Express和Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)，再通過GenBank中的BLAST以及Snapgene軟件驗(yàn)證引物和探針的可行性，具體序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及TaqMan探針序列Table 1 Primers and TaqMan probes used in this study

1.3.2 細(xì)菌的培養(yǎng)及模板DNA提取

考察不同增菌液對(duì)3種目標(biāo)菌同時(shí)增菌的效果。將3種目標(biāo)菌分別接種于BHI肉湯中，36 ℃培養(yǎng)24 h，各取1 mL進(jìn)行10 倍遞增稀釋（10-1～10-8），并選擇適當(dāng)稀釋濃度進(jìn)行傾注平板計(jì)數(shù)。將10-8稀釋水平的3種菌懸液進(jìn)行等體積混合后，分別用5 種常見的前增菌液（TSB、BPW、LB、7.5%鹽和TSPBB）于36 ℃條件下，對(duì)混合菌懸液進(jìn)行5 h前增菌。通過對(duì)比5 種增菌液中3種目標(biāo)菌的比生長(zhǎng)速率衡量其增菌效果。菌種比生長(zhǎng)速率按下式計(jì)算。DNA的提取采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，按照說(shuō)明書進(jìn)行，將DNA模板凍存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

式中：μ為菌種比生長(zhǎng)速率/%；N1和N2分別為t2/h、t1/h對(duì)應(yīng)的菌落總數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.3 多重real-time PCR體系及擴(kuò)增條件

反應(yīng)體系為50 μL：25 μL 2×PCR Premix ExTaqTM，3種探針（10 μmol/L）各1.0 μL，3種上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板3.0 μL，補(bǔ)水至50 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)延伸階段收集熒光信號(hào)。陽(yáng)性結(jié)果判定：Ct值不大于40且擴(kuò)增曲線呈S型。

1.3.4 特異性實(shí)驗(yàn)

提取12 株目標(biāo)菌株和15 株非目標(biāo)菌株的DNA，并以此為模板，分別進(jìn)行SAL、SA、BC三重real-time PCR實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)本方法的特異性。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及敏感性實(shí)驗(yàn)

將經(jīng)活菌計(jì)數(shù)的SAL 2416、SA 25923、BC 8187菌液，分別進(jìn)行10 倍梯度稀釋至10-7，各取1 mL進(jìn)行DNA提取。將提取后的3 株菌的DNA，依據(jù)同級(jí)別濃度梯度分別進(jìn)行等體積混合，以混合后的DNA為模板進(jìn)行realtime PCR擴(kuò)增，以濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

參考張靜等[17]的方法，分別在2 批次菌株培養(yǎng)液梯度稀釋樣本中選取3個(gè)梯度（103、104、105CFU/mL），用2 批次試劑進(jìn)行多重real-time PCR檢測(cè)，每一梯度重復(fù)檢測(cè)5 次，每次2個(gè)平行，計(jì)算Ct值的組間和組內(nèi)變異系數(shù)以評(píng)估其重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.3.7 多重real-time PCR方法檢出限

考察不同肉基質(zhì)樣品的檢出限。對(duì)比樣品不經(jīng)過增菌和經(jīng)過5 h增菌后進(jìn)行多重real-time PCR檢測(cè)，2 種前處理方法檢出限的差異，具體做法如下：取經(jīng)驗(yàn)證不含3種目標(biāo)致病菌的5 種即食肉制品（豬、牛、羊、雞、鴨）樣品各40 份（每份25 g），每種源性樣品平均分成4 組，向其中加入225 mL增菌液，均質(zhì)1 min。之后將活化好的菌懸液加入250 mL體系中，使體系中3種目標(biāo)菌（SAL 2416、SA 25923、BC 8187）的終濃度分別達(dá)到100、101、102、103CFU/mL，充分混勻。每組中取5 份樣品直接進(jìn)行多重real-time PCR檢測(cè)；另5 份樣品于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱增菌5 h后，進(jìn)行多重real-time PCR檢測(cè)。

1.3.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

從不同超市、門市店及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買即食肉制品樣品100 份，包括豬肉制品（20 份）、牛肉制品（20 份）、羊肉制品（20 份）、雞肉制品（20 份）、鴨肉制品（20 份），為了保證一定的檢出率，對(duì)其中40 份樣品進(jìn)行目標(biāo)菌人為污染，具體樣品信息見表2。取各樣品25 g添加225 mL增菌液制備250 mL體系，充分混勻后，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱增菌5 h。之后取1 mL增菌液進(jìn)行DNA提取及多重real-time PCR檢測(cè)。同時(shí)采用GB 4789.4—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》[18]、GB 4789.10—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》[19]及GB 4789.14—2014《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)》[20]對(duì)樣品中的SAL、SA和BC分別進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比2 種方法的檢測(cè)結(jié)果。

表2 40 份人為污染肉制品樣品信息及檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of real-time PCR and national standard method for 40 artificially contaminated meat samples

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 引物、TaqMan探針可行性及特異性驗(yàn)證結(jié)果

從NCBI獲取SAL、SA和BC的基因組序列，使用Snapgene軟件打開基因組序列，并將設(shè)計(jì)的引物、探針導(dǎo)入Snapgene軟件中，對(duì)其可行性進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。由圖1A～C可知，所設(shè)計(jì)的3 組引物、探針分別可以在各自對(duì)應(yīng)的目標(biāo)菌基因組序列中搜索到，說(shuō)明3 組引物探針可以用于SAL、SA和BC的real-time PCR檢測(cè)。此外，通過對(duì)27 株目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌進(jìn)行多重realtime PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，只有相對(duì)應(yīng)的目標(biāo)菌株出現(xiàn)“S型”陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，其他非目標(biāo)菌株均未出現(xiàn)。說(shuō)明針對(duì)這3種致病菌建立的多重real-time PCR方法具有較好的特異性，與其他食源性致病菌存在交叉反應(yīng)的概率較小，結(jié)果見圖1D。

圖1 引物、TaqMan探針可行性及特異性分析Fig. 1 Feasibility and specificity analysis of primers and TaqMan probes

2.2 增菌液的確定

為了選出一種增菌液可以使3種目標(biāo)菌均達(dá)到較好的增菌效果，本研究通過對(duì)比3種目標(biāo)菌在不同增菌液中的比生長(zhǎng)速率，確定最佳增菌液，結(jié)果見圖2。BPW、LB、7.5%鹽和TSPBB分別為GB 4789.4—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》[18]、GB 4798.30—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》[21]、GB 4789.10—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》、GB 4789.14—2014《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)》[20]中規(guī)定的SAL、單核細(xì)胞性李斯特菌、SA和BC的增菌液。BC在LB和7.5%鹽增菌液中，經(jīng)過5 h培養(yǎng)后并沒有生長(zhǎng)，比生長(zhǎng)速率為0；SAL和BC在TSB、BPW、TSPBB增菌液中的增菌效果相似（P＞0.05）；而SA在TSB和7.5%鹽增菌液中增菌效果較好（P＜0.05）。綜上，選取TSB作為3種目標(biāo)菌的增菌液。

圖2 不同增菌液增菌效果Fig. 2 Efficiencies of different enrichment solutions

2.3 多重real-time PCR方法敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以Ct值為縱坐標(biāo)（y），菌液濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖3所示。由圖3B～D可知，SAL 2416的標(biāo)準(zhǔn)曲線在3.8×102～3.8×108CFU/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性（y=-3.300 0x+43.587，R2=0.998 3），SA 25923的標(biāo)準(zhǔn)曲線在4.9×102～4.9×108CFU/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性（y=-3.631 8x+44.592，R2=0.995 7），BC 8187的標(biāo)準(zhǔn)曲線在5.7×102～5.7×108CFU/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性（y=-3.516 1x+43.073，R2=0.998 7）。由此可知，多重real-time PCR法定量下限分別為3.8×102、4.9×102CFU/mL和5.7×102CFU/mL。而當(dāng)3種目標(biāo)菌的濃度低于該檢出限時(shí)，仍有擴(kuò)增（Ct=35～40），但不呈線性關(guān)系，且重復(fù)性和準(zhǔn)確性差。

圖3 3種目標(biāo)菌擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 Amplification curves and standard curves for three target bacteria

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表3所示，SAL、SA、BC的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于2%，表明本方法具有良好的重復(fù)性。

表3 多重real-time PCR方法的重復(fù)性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Reproducibility of multiple real-time PCR

2.5 多重real-time PCR方法檢出限

以豬、牛、羊、雞和鴨5 種純?nèi)庵破纷鳛榛|(zhì)，對(duì)比樣品不經(jīng)過增菌和經(jīng)過5 h增菌，這2 種前處理方法多重real-time PCR檢出限的差異。從結(jié)果可知，不同純?nèi)饣|(zhì)對(duì)目標(biāo)菌的檢出限影響較小，這與Fereidoun[22]、Yang Youjun[23]和Suo Biao[24]等的研究結(jié)果一致，且SN/T 1059.7—2010《進(jìn)出口食品中沙門氏菌檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》[25]中對(duì)于不同食品基質(zhì)，SAL的檢出限相同。此外，通過對(duì)不同加標(biāo)濃度樣品檢測(cè)證明，2 種前處理方法多重real-time PCR的檢出限不同：未增菌組，5 種基質(zhì)中SAL、SA、BC的檢出限分別為3.8×102、4.9×102CFU/mL和5.7×102CFU/mL；增菌組，檢出限分別為3.8、4.9 CFU/mL和5.7 CFU/mL。該檢出限結(jié)果較Paola[26]、李新福[27]等的研究低，說(shuō)明本方法更為靈敏；與李慧芳[28]和Elisa等[14]的研究結(jié)果相似，但增菌時(shí)間（5 h）較短（12 h或18 h），可能是優(yōu)化了前增菌液的原因。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

采用本方法與國(guó)標(biāo)方法同時(shí)對(duì)100 個(gè)實(shí)際樣品（包括40 個(gè)人為污染樣品和60 個(gè)自然樣品）進(jìn)行檢測(cè)，其中除了人為添加的40 個(gè)樣品檢出目標(biāo)菌外，還有1個(gè)自然樣品檢出SAL，2個(gè)自然樣品檢出SA?？傮w上，2 種方法的檢測(cè)結(jié)果一致（表2、4），說(shuō)明所建方法結(jié)果可靠，可以用于即食肉制品中3種致病菌的檢測(cè)。

表4 不同方法檢測(cè)即食肉制品中SAL、SA、BC的陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果Table 4 Positive detection rates of SAL, SA and BC in ready-to-eat meat products determined by different methods

3 結(jié) 論

本研究建立即食肉制品中SAL、SA和BC的三重TaqMan探針real-time PCR檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增3種目標(biāo)菌，達(dá)到了縮短檢測(cè)時(shí)間、提高檢測(cè)效率的目的。TaqMan探針法由于只能結(jié)合特定的擴(kuò)增子，因此較SYBR-Green染料法具有更好的特異性，無(wú)需再借助熔解曲線分析鑒定PCR的單峰[29-30]。通過對(duì)12 株目標(biāo)菌和15 株非目標(biāo)菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)本方法具有良好的特異性，15 株非目標(biāo)菌均無(wú)典型擴(kuò)增曲線，且對(duì)6 種（SAL 9270、1.1190、24167、21482、21481、10437）同屬但不同血清型的SAL均可檢出。此外，該方法還具有較高的靈敏度和重復(fù)性，即食肉制品樣品中的檢出限可達(dá)100CFU/mL水平，滿足各標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)3種目標(biāo)菌限量值的要求，且定量檢測(cè)批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于2%。對(duì)100 份即食肉制品實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)均與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)的結(jié)果符合，且該方法從前增菌到多重realtime PCR檢測(cè)完成僅需7 h，遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)方法（檢測(cè)周期為2～6 d）。綜上，本研究建立的三重TaqMan探針realtime PCR檢測(cè)方法可以作為一種可靠地檢測(cè)手段，為監(jiān)管部門進(jìn)行散裝即食肉制品中病原微生物風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持。