同時(shí)檢測(cè)玉米中黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條的研制

盧迪莎，王 序，楊金易，羅 林，肖治理

（廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是所有真菌毒素中致癌性最高的，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）歸為一類(lèi)致癌物[1]，若人體不慎大量攝入會(huì)引發(fā)急性肝炎，長(zhǎng)期攝入甚至?xí)斐筛闻K癌變[2]。赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是赭曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的，主要損害人體的腎臟，還會(huì)引起免疫抑制，IARC已將其歸類(lèi)為2B類(lèi)致癌物[3-4]。為了保障人民食品安全，國(guó)家質(zhì)監(jiān)局要求AFB1與OTA為谷物類(lèi)食品的必檢項(xiàng)目，GB 2761—2017《食品的真菌毒素限量》規(guī)定AFB1在谷物及其制品中最大殘留限量為5.0～20 μg/kg，OTA為5.0 μg/kg[5]。由于真菌毒素污染廣泛[6]，且往往共同存在于食品中造成混合污染，引起的聯(lián)合毒性效應(yīng)給人畜帶來(lái)更大的威脅[7-8]，其中AFB1與OTA常同時(shí)污染谷物類(lèi)食品[9-10]，因此有必要開(kāi)發(fā)一種操作簡(jiǎn)便、成本較低、可對(duì)這2 種毒素同時(shí)進(jìn)行快速篩查的免疫檢測(cè)方法。

目前，食品中真菌毒素的多組分檢測(cè)方法已迅速發(fā)展，用于檢測(cè)AFB1和OTA的方法主要有高效液相色譜法[11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]等。基于抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫快速檢測(cè)方法也在不斷開(kāi)發(fā)，其中時(shí)間分辨熒光免疫層析方法（time-resolved fluorescence immunochromatographic assay，TRFICA）是以包埋了稀土元素離子螯合物的時(shí)間分辨熒光微球?yàn)槊庖咛结?，在層析體系中通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)的方法[16-19]。利用其熒光衰變期長(zhǎng)和發(fā)射光譜窄的特點(diǎn)，可使有效信號(hào)與非特異性的背景熒光信號(hào)區(qū)分，減少非特異性熒光的干擾，提高了靈敏度[18,20]。通過(guò)熒光讀數(shù)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度比值，對(duì)食品中的真菌毒素進(jìn)行定性或定量檢測(cè)，具有簡(jiǎn)單、快速和可視的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)[21-22]。目前已建立的免疫層析試紙條多集中于采用膠體金或量子點(diǎn)作為標(biāo)記探針實(shí)現(xiàn)多組分檢測(cè)。章先等[23]以膠體金為標(biāo)記載體，建立了OTA和玉米赤霉烯酮（zeralenone，ZEN）金標(biāo)二聯(lián)膠體金免疫層析檢測(cè)法，能應(yīng)用于污染樣品中OTA和ZEN的同時(shí)快速檢測(cè)。Beloglazova等[24]將一種基于非鎘量子點(diǎn)作為橫向免疫測(cè)定的信號(hào)標(biāo)簽，建立了新型的同時(shí)多組分免疫檢測(cè)方法，可對(duì)小麥和玉米樣品的ZEN和嘔吐毒素進(jìn)行快速多通路定性分析。然而，時(shí)間分辨熒光微球作為免疫探針同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素的免疫層析檢測(cè)方法鮮有報(bào)道。本研究基于前期制備的AFB1和OTA單克隆抗體，建立基于稀土銪熒光微球作為檢測(cè)信號(hào)，可同時(shí)檢測(cè)AFB1和OTA的TRFICA。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米樣品 溫氏食品集團(tuán)股份有限公司。

197 nm羧基化銪（III）時(shí)間分辨熒光微球（365/610，固含量1%） 美國(guó)Bangs Laboratories公司；硝酸纖維素膜（NC膜）（UniSart CN 95） 德國(guó)賽多利斯公司；樣品墊（RB65）、PVC底板（SMA31-40）、吸水紙（CH37K） 上海良信科技有限公司；96 孔酶標(biāo)板 深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司。

黃曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2，≥98%）、黃曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1，≥98%）、黃曲霉毒素G2（aflatoxin G2，AFG2，≥98%）、黃曲霉毒素M1（aflatoxin M1，AFM1，≥98%）、黃曲霉毒素M2（aflatoxin M2，AFM2，≥98%）、赭曲霉毒素B（ochratoxin B，OTB，≥98%）、赭曲霉毒素C（ochratoxin C，OTC，≥98%）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON，≥98%）、ZEN（≥98%）、伏馬菌素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1，≥98%）和T-2毒素（T-2，≥98%）標(biāo)準(zhǔn)品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；AFB1（≥98%）、OTA（≥98%）標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MES）、Procline 300美國(guó)Sigma公司；羊抗鼠IgG（HRP標(biāo)記）北京全式金生物科技有限公司；吐溫-20、蔗糖麥克林化學(xué)試劑有限公司；AFB1-MAb（2.45 mg/mL）、OTA-MAb（3.24 mg/mL）、包被抗原AFB1-OVA、包被抗原OTA-OVA由實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 儀器與設(shè)備

UNIQUE-R10純水儀 廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司；KQ-100E超聲波清洗器、CTS300數(shù)控裁條機(jī)、ZQ2000微電腦自動(dòng)斬切機(jī)、XYZ 3060劃膜儀、DHG 9245A鼓風(fēng)干燥機(jī)、AFB1快速檢測(cè)試紙、OTA快速檢測(cè)試紙 奧瑞特生物科技有限公司；FIA-680單通道免疫層析定量分析儀 廣州敏捷生物技術(shù)有限公司；Nexera x2高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

活化液：0.05 mol/L MES，pH 6.0。偶聯(lián)緩沖液：12.5 mmol/L Na2B4O7·10H2O，50 mmol/L H3BO3。封閉液：100 g BSA加入100 mL蒸餾水。熒光微球復(fù)溶液：0.5 mol/L PBS、3%海藻糖、3%蔗糖、1% BSA、0.4%Tween-20、0.03% Procline 300。樣品緩沖液：50 mmol/L Na2B4O7·10H2O，200 mmol/L H3BO3。

1.3.2 熒光探針的制備

采用羧基化時(shí)間分辨熒光微球制備熒光探針，具體操作步驟如下[25]：將10 μL時(shí)間分辨熒光微球均勻分散在1 mL活化液中，依次加入50 μL EDC溶液（0.5 mg/mL）和50 μL NHS溶液（0.5 mg/mL），超聲混勻，放置搖床振蕩（200 r/min）室溫活化15 min，14 000 r/min離心20 min棄上清液；復(fù)溶于1 mL偶聯(lián)緩沖液中，超聲振蕩，使熒光微球重懸；加入抗體，放置搖床振蕩室溫反應(yīng)30 min；隨后加入20 μL封閉液，放置搖床振蕩室溫封閉反應(yīng)60 min，離心棄上清液；用200 μL熒光微球復(fù)溶液復(fù)溶，4 ℃保存。

1.3.3 熒光免疫層析試紙條的組裝

試紙條由樣品墊、硝酸纖維素膜（NC膜）、吸水紙和PVC底板4個(gè)部分組成[26]，如圖1a所示。在NC膜上噴涂（0.8 μL/cm）OTA-OVA和AFB1-OVA分別作為檢測(cè)線（T1線和T2線），羊抗鼠IgG作為質(zhì)控線（C線），包被后置于37 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中烘12 h；將樣品墊、吸水紙、NC膜與PVC底板進(jìn)行組裝，切成寬3.05 mm的試紙條后避光干燥備用。

1.3.4 檢測(cè)步驟和結(jié)果判定

取100 μL樣品緩沖液或待測(cè)樣品液，加入含有熒光探針的微孔中吹打混勻，37 ℃孵育3 min；將試紙條插入微孔（圖1a），37 ℃反應(yīng)7 min，隨后對(duì)熒光層析試紙條進(jìn)行檢測(cè)分析。

反應(yīng)結(jié)束后30 s內(nèi)，將熒光層析試紙條插入熒光讀數(shù)儀讀取結(jié)果（圖1c），由熒光讀數(shù)儀讀取T1、T2線和C線的熒光信號(hào)值，并得出以B0為陰性樣本的T/C值，以B為陽(yáng)性樣本的T/C值。

紫外燈下，通過(guò)肉眼判斷定性結(jié)果（圖1b），當(dāng)含有一定濃度待測(cè)物時(shí)，熒光探針先與待測(cè)物結(jié)合且無(wú)多余特異性位點(diǎn)與T線上的包被抗原結(jié)合，結(jié)合形成的熒光探針-待測(cè)物復(fù)合物被C線上的羊抗鼠IgG截留，故T線不顯線，C線顯紅色熒光，則結(jié)果為陽(yáng)性，用“+”表示；相反，當(dāng)無(wú)待測(cè)物時(shí)，部分熒光探針被T線上的包被抗原截留，多余的熒光探針與C線上的羊抗鼠IgG結(jié)合，故T線和C線均顯紅色熒光，結(jié)果為陰性，用“-”表示。

圖1 TRFICA試紙條檢測(cè)原理（a）、定性檢測(cè)（b）和定量檢測(cè)（c）Fig. 1 Schematic diagrams of the principle of TRFICA strip for detection of two mycotoxins (a), and their qualitative detection (b) and quantitative detection (c)

1.3.5 熒光免疫層析試紙條檢測(cè)條件優(yōu)化

1.3.5.1 熒光微球活化pH值的選擇

用NaOH溶液（1 mol/L）將活化液的pH值調(diào)至6.5、6.0、5.5、5.0，在不同pH值條件下按照步驟1.3.2節(jié)活化熒光微球，分別加入抗體（AFB1-Mab為4.90 μg，OTA-Mab為3.24 μg）進(jìn)行偶聯(lián)，根據(jù)試紙條的T1、T2線和C線熒光強(qiáng)度，選擇熒光強(qiáng)度最強(qiáng)且消線效果明顯的為最適pH值[26]。

1.3.5.2 偶聯(lián)熒光微球的抗體用量選擇

在最優(yōu)熒光微球活化的pH值條件下，按1.3.2節(jié)步驟對(duì)偶聯(lián)熒光微球的抗體用量進(jìn)行優(yōu)化制備熒光探針，AFB1-MAb的量設(shè)定為1.78、2.50、3.50、4.90 μg，OTAMAb的量設(shè)定為0.96、1.44、2.16、3.24 μg。根據(jù)試紙條的T1、T2線和C線的熒光強(qiáng)度，選擇熒光強(qiáng)度強(qiáng)且消線效果明顯的為偶聯(lián)熒光微球的抗體最佳用量[24]。

1.3.5.3 抗體-熒光探針用量的選擇

在最優(yōu)pH值和偶聯(lián)熒光微球的抗體最優(yōu)用量條件下，按1.3.3節(jié)步驟制備試紙條，并分別取不同濃度的探針進(jìn)行檢測(cè)，AFB1熒光探針的量設(shè)定為4、5、6、7、8 μL，OTA熒光探針的量設(shè)定為1、2、3、4、5 μL[26]。根據(jù)試紙條的T1、T2線和C線熒光強(qiáng)度，選擇熒光強(qiáng)度強(qiáng)且消線效果明顯的熒光探針用量確定為最佳探針用量。

1.3.5.4 檢測(cè)線上包被抗原質(zhì)量濃度的選擇

在最優(yōu)熒光探針制備與加入量的條件下，按1.3.3節(jié)步驟對(duì)T線上包被抗原的質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化。T1線上OTAOVA（1.38 mg/mL）質(zhì)量濃度設(shè)為1.07、0.87、0.71、0.61、0.54 mg/mL，T2線上AFB1-OVA（4.28 mg/mL）質(zhì)量濃度設(shè)為1.38、0.83、0.41、0.28、0.21 mg/mL[25]。通過(guò)熒光免疫層析定量分析儀測(cè)定，選擇無(wú)待測(cè)物時(shí)T線和C線顯色明顯，且添加待測(cè)物時(shí)抑制率高的為T(mén)1和T2線最佳抗原質(zhì)量濃度。

1.3.5.5 質(zhì)控線上羊抗鼠IgG質(zhì)量濃度的選擇

在最優(yōu)熒光探針制備與加入量的條件下，按1.3.3節(jié)步驟對(duì)C線上羊抗鼠IgG的質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化。羊抗鼠IgG的質(zhì)量濃度設(shè)為0.25、0.20、0.17、0.14、0.12 mg/mL[28]。通過(guò)讀數(shù)儀測(cè)定，選擇無(wú)待測(cè)物時(shí)T線和C線顯色明顯，且添加待測(cè)物時(shí)抑制率高的為C線羊抗鼠IgG最佳濃度。

1.3.6 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

玉米粉碎過(guò)20 目篩，分裝避光保存。選取經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)不含AFB1和OTA的玉米樣品作為空白樣品。

1.3.6.1 提取溶液的選擇

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g玉米粉樣品，分別加入5 mL乙酸乙酯、乙腈、無(wú)水甲醇和甲醇-水（70∶30，V/V）提取劑，充分振蕩5 min，室溫4 000 r/min離心5 min；取100 μL上清液，用樣品緩沖液稀釋4 倍，制得待測(cè)樣品液[26]。

1.3.6.2 提取時(shí)間的選擇

準(zhǔn)確稱(chēng)取空白及加標(biāo)的1.0 g玉米粉樣品，加入5 mL甲醇提取劑，分別充分振蕩3、5、7 min和10 min，室溫4 000 r/min離心5 min；取100 μL上清液，用樣品緩沖液（0.2 mol/mL PB，pH 7.4）稀釋4 倍[26]，制得待測(cè)樣品液。

1.3.7 熒光免疫層析檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

1.3.7.1 靈敏度評(píng)價(jià)

按1.3.6節(jié)步驟制備得到空白樣品液，分別加入AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（100.00、33.33、11.11、3.70、1.23、0.41、0.14、0 μg/kg），OTA標(biāo)準(zhǔn)品（150.00、50.00、16.57、5.55、1.85、0.65、0.21、0.5、0 μg/kg），以1.3.5節(jié)步驟選擇的最佳測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)肉眼直接進(jìn)行定性檢測(cè)，使T1線和T2線消失的最小藥物濃度，分別確定為AFB1和OTA的可視檢測(cè)限（visible limit of detection，vLOD）[27-28]。使用熒光讀數(shù)儀得到檢測(cè)結(jié)果，以B/B0為縱坐標(biāo)，真菌毒素濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，通過(guò)Origin 9.0繪圖軟件分別建立AFB1和OTA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。定量限為20 個(gè)空白樣品檢測(cè)平均值與3 倍標(biāo)準(zhǔn)差[29]。

1.3.7.2 特異性評(píng)價(jià)

以交叉反應(yīng)率（cross-reactivity，CR）評(píng)價(jià)該方法的特異性。以其他常見(jiàn)真菌毒素作為交叉藥物，如AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、OTB、OTC、DON、ZEN、FB1和T-2。將交叉藥物配成梯度系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，按1.3.5節(jié)最佳條件用熒光免疫層析定量分析儀進(jìn)行測(cè)定，得出各競(jìng)爭(zhēng)物的半抑制濃度（half inhibition concentration，IC50），并按下式計(jì)算CR[26]：

式中：IC50為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的半抑制濃度/（μg/kg）。

1.3.7.3 添加回收實(shí)驗(yàn)

對(duì)玉米空白樣品添加低、中、高3個(gè)不同濃度的AFB1和OTA混合溶液，按1.3.5節(jié)最優(yōu)條件進(jìn)行樣品前處理后，按1.3.4節(jié)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，并計(jì)算加標(biāo)回收率評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確度，計(jì)算變異系數(shù)評(píng)價(jià)精確度[25]。

1.3.7.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)可以作為判斷試紙條能否長(zhǎng)期穩(wěn)定貯存的依據(jù)[29]。本研究將制好的熒光試紙條和鋪有熒光探針的酶標(biāo)微孔置于鋁箔袋內(nèi)，加入干燥劑，抽真空密封，置于37 ℃進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)。在第1、7、15天分別取出試紙條，并按照1.3.7.1節(jié)分別對(duì)試紙條的靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.7.5 儀器法比對(duì)

取30 份玉米樣品（均有不同水平的AFB1和OTA混合污染），分別采用本研究所建立的TRFICA和國(guó)標(biāo)的高效液相色譜法[30-31]2 種檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果的一致性進(jìn)行分析。

色譜條件：色譜柱為C18柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相由5 mmol/L乙酸溶液（流動(dòng)相A）和甲醇溶液（流動(dòng)相B）組成；流速0.8 μL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；梯度洗脫：0～5 min，95%～10% A、5%～90% B；5～7 min，10% A、90% B；7～10 min，95% A、5% B。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光探針的鑒定

通過(guò)電子顯微鏡對(duì)熒光探針進(jìn)行掃描，熒光微球呈圓球形（圖2a），無(wú)異形顆粒，大小均一，直徑大約為200 nm。標(biāo)記抗體后，微球周?chē)忻黠@的蛋白暈環(huán)（圖2b），且結(jié)構(gòu)完整，表明抗體已成功標(biāo)記在熒光微球表面。

圖2 時(shí)間分辨熒光微球的透射電子顯微鏡掃描圖Fig. 2 SEM images of fluorescent microspheres

2.2 TRFICA的優(yōu)化

2.2.1 標(biāo)記熒光微球的最佳活化pH值

在抗體標(biāo)記熒光過(guò)程中，熒光微球的活化pH值影響熒光探針制備效率和抗體活性。若pH值與抗體濃度適宜時(shí)，能提高活化效率，有利于抗體與熒光微球的共價(jià)結(jié)合。本研究采用不同pH值的MES緩沖液作為活化液，在同樣檢測(cè)條件下（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇以下檢測(cè)條件：C線0.1 mg/mL，T1線0.41 mg/mL，T2線0.61 mg/mL），選擇陰性T線顯色強(qiáng)度高，陽(yáng)性T線褪色明顯作為最佳條件。結(jié)果如圖3所示，隨著pH值的升高，T線顯色逐漸明顯，當(dāng)pH值為6.0時(shí)為最佳效果，但pH 6.5時(shí)顯色強(qiáng)度降低，故本研究選擇活化pH值為6.0。

圖3 熒光微球活化pH值對(duì)顯色結(jié)果的影響Fig. 3 Effects of different pH values for fluorescent microsphere activation on results of color development

2.2.2 標(biāo)記熒光微球的最佳抗體用量

在抗體標(biāo)記過(guò)程中，抗體的標(biāo)記用量是影響熒光探針制備效率和抗體活性的另一重要因素。若偶聯(lián)時(shí)的抗體濃度過(guò)高，沒(méi)有與微球結(jié)合的過(guò)量抗體會(huì)與T線的包被抗原、C線的羊抗鼠IgG競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，影響結(jié)果的判斷，造成假陰性，降低試紙條的檢測(cè)靈敏度。本研究采用不同用量的抗體與等量熒光微球偶聯(lián)，在同樣檢測(cè)條件下（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇以下檢測(cè)條件：C線0.1 mg/mL，T1線0.41 mg/mL，T2線0.61 mg/mL），隨著標(biāo)記抗體量越大，T線顯色越清晰（圖4），但AFB1-MAb和OTA-MAb標(biāo)記量分別超過(guò)3.50 μg和2.16 μg時(shí)，陽(yáng)性試紙條的抑制效果降低，當(dāng)標(biāo)記量分別小于2.50 μg和1.44 μg時(shí)，T線顯線不明顯。因此，選擇AFB1探針與OTA探針的標(biāo)記抗體用量分別為3.50 μg和2.16 μg。

圖4 標(biāo)記微球抗體用量對(duì)顯色結(jié)果的影響Fig. 4 Effect of different amounts of labeled microsphere antibody on results of color development

2.2.3 熒光探針用量

檢測(cè)過(guò)程中，免疫熒光探針用量會(huì)影響檢測(cè)靈敏度和陰陽(yáng)性的判斷。如圖5所示，探針用量過(guò)低時(shí)，T線顯色強(qiáng)度不夠清晰，且易造成檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性；探針過(guò)量時(shí)，探針上多余的結(jié)合位點(diǎn)，與T線上的包被抗原結(jié)合，造成檢測(cè)結(jié)果假陰性，因此本研究對(duì)探針用量進(jìn)行優(yōu)化。紫外燈下肉眼觀察，隨著探針用量的減少，陰性試紙條的T線逐漸下降，且陽(yáng)性試紙條消線明顯，均有良好的抑制效果。故選擇OTA熒光探針用量為2 μL，AFB1熒光探針用量為3 μL。

圖5 熒光探針用量對(duì)顯色結(jié)果的影響Fig. 5 Effect of fluorescent probe dosage on results of color development

2.2.4 包被抗原與羊抗鼠IgG質(zhì)量濃度

包被在NC膜上的抗原與羊抗鼠IgG的質(zhì)量濃度，會(huì)影響T線和C線的熒光強(qiáng)弱。高濃度的包被原使顯色強(qiáng)度過(guò)大，導(dǎo)致靈敏度下降；反之包被質(zhì)量濃度過(guò)低時(shí)，顯色較弱，用肉眼定性檢測(cè)時(shí)，難以識(shí)別。圖6結(jié)果表明，隨著包被抗原的質(zhì)量濃度下降，紫外燈下肉眼觀察到陰性試紙條T線顯色強(qiáng)度逐漸變?nèi)?，T1線與T2隨著包被抗原和羊抗鼠IgG的質(zhì)量濃度增加，試紙條的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且C線的顯色均一。熒光讀數(shù)儀測(cè)定，結(jié)果如圖7所示，陰性試紙條與陽(yáng)性試紙條的T/C值比較平均，當(dāng)T1包被抗原為0.71 mg/mL，T2包被抗原為0.41 mg/mL，羊抗鼠IgG為0.17 mg/mL，試紙條對(duì)OTA和AFB1的抑制率最高，分別為92.86%和93.92%。故最終選擇OTA-OVA、AFB1-OVA與C線的羊抗鼠質(zhì)量濃度分別為0.71、0.41 mg/mL和0.17 mg/mL。

圖6 包被抗原質(zhì)量濃度與羊抗鼠IgG質(zhì)量濃度對(duì)顯色結(jié)果的影響Fig. 6 Effects of coating antigen concentration and goat anti-mouse IgG concentration on results of color development

圖7 不同包被抗原質(zhì)量濃度的優(yōu)化結(jié)果（熒光儀讀數(shù)）（n =3）Fig. 7 Optimization of coating antigen concentrations (n = 3)

2.2.5 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件可以使樣品提取液對(duì)試紙條的基質(zhì)干擾減至最小，且保持其靈敏度，使空白測(cè)定結(jié)果與緩沖液測(cè)定結(jié)果接近，因此本研究對(duì)前處理的提取液與提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)比乙酸乙酯、乙腈、無(wú)水甲醇和甲醇-水溶液（70∶30，V/V）4 種提取液，加標(biāo)量為10 ng/g AFB1與10 ng/g OTA混合液的空白玉米樣品的回收率（圖8a），甲醇-水溶液的提取效果最好，基制干擾小，玉米樣品添加回收率高達(dá)93%。

使用甲醇-水溶液作為提取劑，分別對(duì)比提取時(shí)間3、5、7 min和10 min的提取效果（圖8b），加標(biāo)為5 ng/g AFB1與5 ng/g OTA混合液的空白玉米樣品，提取時(shí)間為5、7、10 min的回收率為96%左右，為縮短檢測(cè)時(shí)間達(dá)到快速檢測(cè)的目的，確定玉米樣品的提取液為甲醇-水（70∶30，V/V），提取時(shí)間為5 min。

圖8 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化（n=3）Fig. 8 Optimization of sample pretreatment conditions (n = 3)

2.3 試紙條性能評(píng)價(jià)

2.3.1 靈敏度

在優(yōu)化條件下進(jìn)行檢測(cè)，用肉眼進(jìn)行判讀，AFB1和OTA的vLOD分別為3.70 μg/kg和5.55 μg/kg（圖9）。通過(guò)熒光讀數(shù)儀讀取藥物濃度梯度稀釋系列的T/C數(shù)值，計(jì)算出B/B0，利用Origin 8.5的四參數(shù)擬合模塊擬合AFB1和OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖9），得到IC50分別為1.58 μg/kg和3.91 μg/kg，檢測(cè)范圍（IC20～I(xiàn)C80）分別為0.26～9.73 μg/kg和1.14～13.29 μg/kg，定量限分別為0.03、0.07 μg/kg（表1）。

表1 本方法檢測(cè)玉米中AFB1和OTA的性能參數(shù)（n=3）Table 1 Analytical figures of merit of TRFICA for AFB1 and OTA in corn samples (n = 3)

圖9 AFB1與OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線與實(shí)物圖（n=3）Fig. 9 Standard curves for determination of AFB1 and OTA and results of color development in strips (n = 3)

2.3.2 特異性

分別取AFB1和OTA和幾種常見(jiàn)真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)，按1.3.7.1節(jié)建立各種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到IC50和CR。由于抗體的特異性依賴(lài)于抗原的結(jié)構(gòu)，抗原的結(jié)構(gòu)相似時(shí)會(huì)導(dǎo)致抗體的交叉反應(yīng)，因此本方法與其他類(lèi)似真菌毒素存在一定的交叉反應(yīng)。如表2所示，與AFB2、AFM1的交叉率達(dá)到60%以上，與AFG1交叉率為38%，與AFG2、AFM2為20%以下。與其他常見(jiàn)真菌毒素，如DON、ZEN、FB1和T-2均無(wú)明顯交叉反應(yīng)。本方法與OTB交叉反應(yīng)率為58%，與其他常見(jiàn)真菌毒素均無(wú)明顯交叉反應(yīng)。

表2 本方法試紙條的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n =3）Table 2 Cross-reactivity of TRFICA (n = 3)

2.3.3 添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用試紙條對(duì)添加不同含量AFB1和OTA混合溶液的空白玉米樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)回收率和變異系數(shù)評(píng)估其準(zhǔn)確度和精確度。如表3所示，AFB1和OTA的回收率在92%～103%之間，變異系數(shù)均小于15%。故此檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和精確度較高，可以滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)的要求。

表3 本方法的回收率和變異系數(shù)=3）Table 3 Recoveries and coefficients of variation of TRFICA (n = 3)（n

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在加速老化實(shí)驗(yàn)中，考慮時(shí)間和溫度2個(gè)因素，試紙條有效期的確定常用37 ℃有效期的10 倍，隨著高溫保存時(shí)間的延長(zhǎng)，試紙條和熒光探針上的蛋白都開(kāi)始老化，在接近保質(zhì)期限時(shí)，靈敏度會(huì)逐漸減少至0。若一段時(shí)間熒光強(qiáng)度與靈敏度基本不變，說(shuō)明試紙條的穩(wěn)定性良好[29]。分別用在鼓風(fēng)干燥箱中放置1、7 d和15 d的試紙條進(jìn)行檢測(cè)。如表4所示，3 次測(cè)定結(jié)果相近，靈敏度與檢測(cè)范圍變化不大，且性能都符合殘留檢測(cè)的要求，故該熒光免疫層析試紙條穩(wěn)定性較好，可在4 ℃有效保存5個(gè)月以上。

表4 TRFICA試紙條的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 4 Stability of TRFICA strip

2.3.5 與其他檢測(cè)方法的比較

將本研究建立的TRFICA與GB 5009.96—2016《食品中赭曲霉毒素A的測(cè)定》和GB 5009.22—2016《食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》的高效液相色譜法和膠體金免疫層析法進(jìn)行比對(duì)，檢測(cè)樣品為不同水平真菌毒素污染的玉米樣品。如表5和圖10所示，本方法與高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性良好（R2＞0.9），結(jié)果一致，膠體金免疫層析法檢測(cè)出陰、陽(yáng)性結(jié)果相當(dāng)，定性結(jié)果符合率為100%。而TRFICA檢測(cè)過(guò)程只需20 min，且配合熒光讀數(shù)儀使用可提高定量檢測(cè)結(jié)果的速度與準(zhǔn)確度。因此本研究建立的TRFICA可有效完成大規(guī)模樣品的篩查，節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，具有較好的實(shí)用性。

圖10 本方法與高效液相色譜法對(duì)30 個(gè)玉米樣本的相關(guān)性分析Fig. 10 Correlation of TRFIA with HPLC results for 30 corn samples

表5 高效液相色譜法、膠體金免疫層析法與本方法檢測(cè)=3）Table 5 Results of determination of AFB1 and OTA in real samples by TRFICA, HPLC and GICA (n = 3)實(shí)際樣品中的AFB1和OTA（n

續(xù)表5

3 結(jié) 論

本研究建立一種可同時(shí)快速定量檢測(cè)AFB1和OTA的二聯(lián)TRFICA試紙條，并經(jīng)過(guò)樣品前處理的優(yōu)化，AFB1和OTA在玉米樣品中的vLOD分別為3.70、5.55 μg/kg，IC50分別為1.58、3.91 μg/kg，線性范圍分別為0.26～9.73，1.14～13.29 μg/kg，檢測(cè)時(shí)間只需20 min，操作簡(jiǎn)單快速。本研究方法對(duì)其他黃曲霉毒素和其他赭曲霉毒素存在一定交叉反應(yīng)，與黃曲霉毒素類(lèi)似物交叉率為12%～62%，與OTB交叉率為58%，適用于對(duì)樣品中的黃曲霉毒素和赭曲霉毒素含量進(jìn)行篩查。優(yōu)化樣品前處理后，添加回收率在92%～103%之間，變異系數(shù)小于15%，且與國(guó)標(biāo)規(guī)定的高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性良好（R2＞0.9）。在實(shí)際樣品的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，本方法比高效液相色譜檢測(cè)時(shí)間短且操作簡(jiǎn)便，和市售膠體金免疫層析試紙檢測(cè)相比，能夠定量檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)痕量分析，3種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果一致，表明本研究的TRFICA試紙結(jié)果精準(zhǔn)可靠。通過(guò)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，確定該試紙條有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，在4 ℃可穩(wěn)定保存5個(gè)月以上。

本研究制備的TRFICA快速、簡(jiǎn)便、成本低，適合用于大批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，結(jié)合便攜式的熒光免疫層析定量分析儀，既可定性又可定量，具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。但對(duì)于實(shí)際樣品的檢測(cè)應(yīng)用，目前只優(yōu)化出玉米樣品的前處理，對(duì)于其他谷物如小麥和燕麥等的樣品提取還需要進(jìn)一步研究。而對(duì)黃曲霉毒素類(lèi)似物存在較高交叉反應(yīng)，后續(xù)也可以考慮建立樣品中黃曲霉毒素總量和赭曲霉毒素總量的檢測(cè)方法。