母體肥胖對(duì)胚胎神經(jīng)管發(fā)育及線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響*

路志國(guó)， 吳曉婷， 霍 泉， 李 婷， 魯 瑤， 尹荷晴， 王 凱， 杜 勇△

（1寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院小兒外科，寧夏 銀川 750004）

肥胖是一種由遺傳、環(huán)境、飲食等因素引起的慢性代謝性疾病［1-2］，據(jù)估計(jì)到2025 年，全球男性肥胖率將達(dá)到18%，女性為21%［3］。妊娠期肥胖不僅有妊娠并發(fā)癥［4］、妊娠期糖尿?。?］、分娩并發(fā)癥［6］和感染［7］的風(fēng)險(xiǎn)，而且對(duì)后代的發(fā)育和健康也有影響［8-9］，包括神經(jīng)發(fā)育障礙（包括腦性癱瘓）、冠心病、中風(fēng)、2型糖尿病和哮喘等［10-11］。由于目前對(duì)神經(jīng)發(fā)育障礙的治療有限，妊娠期肥胖對(duì)胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響尤其令人擔(dān)憂。因此，有必要深入了解妊娠期肥胖對(duì)后代神經(jīng)發(fā)育的影響及其具體機(jī)制，從而實(shí)施有效的預(yù)防策略和早期干預(yù)。

神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育始于胚胎早期，發(fā)育過(guò)程中容易受到外部因素的影響，如孕期接觸農(nóng)藥、輻射、用藥、飲酒、感染和營(yíng)養(yǎng)不良等因素［12］，導(dǎo)致神經(jīng)管發(fā)育相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)改變或表達(dá)障礙，從而導(dǎo)致神經(jīng)管缺陷的發(fā)生［13］。研究發(fā)現(xiàn)，在調(diào)整年齡、職業(yè)、文化程度、家庭收入、葉酸使用等因素后，與正常體重相比，孕前肥胖孕婦的胚胎出現(xiàn)神經(jīng)管缺損的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加［14］。研究發(fā)現(xiàn)，母親肥胖可能與胎兒脊柱裂風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，母親體重不足可能與胎兒無(wú)腦風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)［15］。也有研究發(fā)現(xiàn)母體肥胖可通過(guò)改變表觀遺傳機(jī)制導(dǎo)致胚胎神經(jīng)發(fā)育障礙，如胚胎神經(jīng)管缺陷（neural tube defects，NTDs）、自閉癥、唐氏綜合征、Rett 綜合征以及隨后的神經(jīng)心理缺陷［16］。這些研究表明，母體肥胖可能會(huì)影響子代神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，導(dǎo)致神經(jīng)管畸形等出生缺陷，但具體機(jī)制尚不清楚。因此，本研究旨在探討高脂飲食誘導(dǎo)的母體肥胖對(duì)胚胎神經(jīng)管發(fā)育的影響及其可能機(jī)制，為研究神經(jīng)管畸形的發(fā)病機(jī)制提供線索。

材料和方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物16 只SPF 級(jí)雌性C57BL/6J 小鼠（6周齡，19～21 g），隨機(jī)分為正常飲食（normal diet，ND）組及高脂飲食（high-fat diet，HFD）組，每組8只。兩種飲食具體配方如表1 所示。所有動(dòng)物飼養(yǎng)在寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫（22±2）℃，晝夜各12 h 明暗交替。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為IACUC-NYL?AC-2020-066。

表1 飲食配方Table 1.Diet formula

1.2 主要試劑全蛋白提取試劑盒購(gòu)自凱基生物公司；枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液、DAB 顯色液、山羊血清購(gòu)自中杉金橋公司；HE 染色試劑盒、改良油紅O 染色試劑盒、線粒體提取試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、ATP 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司；抗nestin、Bax、Bcl-2、GAPDH 抗體購(gòu)自Abcam 公；高脂飼料購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組將16 只SPF 級(jí)雌性C57BL/6J 小鼠隨機(jī)分為ND 組及HFD 組，每組8只分別給予高脂飼料和正常飼料。每周在特定時(shí)間測(cè)量小鼠體重，連續(xù)喂食12周后，于晚上8點(diǎn)將雌鼠與雄鼠合籠，次日上午8 點(diǎn)觀察有陰栓的雌鼠記為妊娠第0.5 天。妊娠第14.5 天后腹腔注射1% 戊巴比妥鈉（0.05 mg/g）麻醉，分離血液、肝臟和胚胎，其中ND 組共獲得73只胚胎，HFD 組共獲得70 只胚胎。用顯微鑷在解剖顯微鏡下劃開(kāi)背部皮膚，小心剝離出胚胎神經(jīng)管用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 血脂測(cè)量采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)兩組血清中甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density liptein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density liptein cholesterol，LDL-C）的含量。

2.3 HE 染色將分離的肝臟和胚胎在4% 多聚甲醛溶液中固定24 h，然后用新鮮PBS 溶液沖洗。乙醇梯度（乙醇濃度70%、80%、90%、95%、100%、100%）脫水，二甲苯透明，然后在65 ℃下浸泡石蠟Ⅰ和Ⅱ融化2 h 后包埋。將切好的石蠟切片在65 ℃烘箱中干燥2 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蒸餾水浸泡1 min，蘇木精染色3 min，1% 鹽酸乙醇分化，伊紅染色3 min。經(jīng)梯度乙醇脫水后，用二甲苯透明和中性樹(shù)脂密封。最后，在光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照。

2.4 油紅O 染色將剩余完整的肝臟用4% 多聚甲醛固定，然后OCT 包埋劑滴入組織。組織被完全覆蓋并迅速冷凍，用冷凍切片機(jī)切片，厚度為4 μm。將切好的冰凍切片放入切片架回溫10 min。配制油紅O 染色工作液，用濾紙過(guò)濾備用。加入適量染色洗滌液，覆蓋樣品20 s 后吸出。加入適量染色洗滌液覆蓋樣品20 s 后吸除染色洗滌液，將配制好的油紅O 染色工作液滴加于切片上染色20 min，去除工作液，將適量染色洗滌液滴加于切片上，靜置30 s，浸入蒸餾水中置于搖床洗滌20 s。用蘇木精染色液對(duì)細(xì)胞核復(fù)染，封片，在顯微鏡下觀察拍照。

2.5 免疫組化染色將石蠟切片后烘烤2 h，乙醇梯度脫水（乙醇濃度100%、100%、95%、90%、80%、70%），枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液高壓修復(fù)10 min，使用3% H2O2去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后用山羊血清封閉30 min，滴加兔來(lái)源的nestin Ⅰ抗（1∶300）4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 清洗后滴加Ⅱ抗。DAB 顯色后蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片后顯微鏡下觀察、拍照。用ImageJ 軟件分析染色單位面積百分比。

2.6 Western blot使用全蛋白提取試劑盒將神經(jīng)管在4 ℃裂解緩沖液中勻漿，在12 000 ×g離心5 min后取上清液進(jìn)行Western blot。用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。用5% 脫脂奶粉封閉1 h 后，分別用 抗Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、nestin（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）抗體孵育過(guò)夜，PBS 清洗后用HRP標(biāo)記的Ⅱ抗孵育、化學(xué)發(fā)光，經(jīng)ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)分析每組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.7 透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)將分離的胚胎神經(jīng)管迅速置于戊二醛中2 h后用PBS清洗3次。用四氧化鋨固定，脫水，包埋，HITACHI-7650 透射電子顯微鏡觀察切片胚胎神經(jīng)管的發(fā)育和線粒體的超微結(jié)構(gòu)。

2.8 線粒體膜電位（mitochondrial membrane poten?tial，MMP）的檢測(cè)按照線粒體提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，首先稱取100 mg 的新鮮胚胎神經(jīng)管組織，PBS沖洗后用濾紙吸干，用剪刀剪碎，加入線粒體分離試劑A，在冰浴上進(jìn)行勻漿后收集勻漿液。在1 000 ×g，4 ℃離心5 min。收集上清在11 000 ×g，4 ℃再次離心10 min。小心去除上清，沉淀即為分離得到的線粒體，收集沉淀立即用于MMP的檢測(cè)。

MMP 的檢測(cè)參照線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，步驟如下：（1）配制JC-1 染色工作液，取50 μL 200×的JC-1 加入8 mL 超純水稀釋后充分混勻，然后再加入2 mL 5×的JC-1 染色緩沖液，混勻后即為JC-1染色工作液；（2）把配制好的JC-1染色工作液再用1×的JC-1 染色緩沖液稀釋5 倍。取0.9 mL 5 倍稀釋的JC-1 染色工作液加入到0.1 mL 之前純化的線粒體；（3）用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果以相對(duì)熒光單位（relative fluorescence unit，RFU）表示。同時(shí)將加了工作液的純化線粒體滴加在載玻片上，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，拍照。

2.9 ATP 含量檢測(cè)按照ATP 檢測(cè)試劑盒（碧云天）說(shuō)明書(shū)，步驟如下：（1）每20 mg 神經(jīng)管組織加入約200 μL 裂解液，充分勻漿確保組織被完全裂解。裂解后4 ℃、12 000×g離心5 min，取上清，用于后續(xù)的測(cè)定。（2）配制ATP 檢測(cè)工作液：取50 μL ATP 檢測(cè)試劑加入5 mL ATP 檢測(cè)試劑稀釋液配制成5 mL ATP 檢測(cè)工作液；（3）ATP 濃度的測(cè)定：加100 μL ATP 檢測(cè)工作液到檢測(cè)孔內(nèi)，室溫放置5 min，在檢測(cè)孔內(nèi)加上20 μL 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，迅速混勻，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定相對(duì)數(shù)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每組ATP的含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間均數(shù)比較首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，滿足正態(tài)性則進(jìn)行兩樣本t檢驗(yàn)，若不滿足則進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 成功構(gòu)建小鼠肥胖模型

ND 組及HFD 組小鼠的體重增量分別為（4.47±0.65）g和（7.02±0.51）g，HFD組較ND組增重明顯，見(jiàn)圖1A；ND 組及HFD 組小鼠血脂中的TC 分別為（2.9±0.32）mmol/L 和（4.74±0.17）mmol/L，TG 分別為（0.25±0.1）mmol/L 和（0.72±0.26）mmol/L，HDLC 分 別 為（1.51±0.35） mmol/L 和（2.76±0.27）mmol/L，LDL 分別為（0.31±0.1）mmol/L 和（1.16±0.18）mmol/L，見(jiàn)圖1B；肝臟HE 和油紅O 染色結(jié)果顯示，ND 組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)規(guī)則，肝細(xì)胞排列有序，大小均勻，以中心靜脈為中心呈放射狀排列；而HFD組小鼠肝細(xì)胞排列無(wú)序，細(xì)胞核轉(zhuǎn)移由于脂肪空泡的影響，肝細(xì)胞腫脹，顯示彌漫性脂肪變性，胞漿豐富大小不同的圓形的脂質(zhì)滴，見(jiàn)圖1C、D。

Figure 1.Identification of obesity mouse model induced by high-fat diet（NFD）.A：body weight；B：blood lipid level；C：liver HE staining of maternal mice in normal diet（ND）and HFD groups（×200）；D：liver oil red O staining of maternal mice in ND and HFD groups（×200）.Mean±SD. n=8.*P<0.05，**P<0.01 vs ND group.圖1 高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型的鑒定

2 高脂飲食引起的肥胖引起子代神經(jīng)管發(fā)育不良

胚胎神經(jīng)管HE 染色結(jié)果顯示，兩組神經(jīng)管細(xì)胞排列緊密，無(wú)核溶解、固縮現(xiàn)象，形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖2A。免疫組化檢測(cè)兩組nestin 蛋白表達(dá)水平分別為（16.17±1.28）%和（22.19±1.27）%，HFD組較ND 組顯著升高，見(jiàn)圖2B，Western blot 檢測(cè)ND組及HFD 組nestin 的相對(duì)蛋白表達(dá)水平分別為（0.26±0.03）和（0.62±0.08），見(jiàn)圖2C。透射電鏡顯示兩組胚胎神經(jīng)管的突觸前膜和后膜清晰可見(jiàn)，但HFD 組突觸間隙消失，有一定程度的融合，神經(jīng)管的發(fā)展有明顯的缺陷（紅色箭頭所示，見(jiàn)圖3A）。

Figure 2.High-fat diet（HFD）-induced obesity caused neural tube dysplasia in offspring.A：HE staining of embryonic neural tubes in normal diet（ND）and HFD groups（×400）；B：the protein expression levels of nestin in embryonic neural tubes were de?tected by immunohistochemistry staining（×400）；C：the protein expression levels of nestin in embryonic neural tubes were detected by Western blot.Mean±SD. n=8.**P<0.01 vs ND group.圖2 高脂飲食引起的肥胖導(dǎo)致子代神經(jīng)管發(fā)育不良

3 高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖導(dǎo)致后代線粒體結(jié)構(gòu)紊亂，神經(jīng)管細(xì)胞凋亡增多

透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)ND 組神經(jīng)管線粒體呈卵圓形，線粒體嵴正常。而HFD 組神經(jīng)管線粒體水腫，可見(jiàn)大量空泡，線粒體嵴破裂、模糊甚至消失，變形、增大，結(jié)構(gòu)明顯異常（紅色箭頭所示，見(jiàn)圖3B）。Western blot結(jié)果表明ND組與HFD組小鼠胚胎神經(jīng)管的Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)比值分別為（0.48±0.04）和（2.35±0.16），見(jiàn)圖3C，表明高脂飲食引起的母體肥胖可導(dǎo)致子代神經(jīng)管凋亡細(xì)胞增加。

4 高脂飲食引起的肥胖導(dǎo)致后代神經(jīng)管線粒體功能紊亂

激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，與ND 組相比，HFD 組線粒體膜電位降低，紅色熒光（JC-1 聚合物）減弱，綠色熒光（JC-1 單體）增強(qiáng)。熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)ND 組及HFD 組的紅色熒光值分別為（44575±1543）和（30450±1230），ATP含量分別為（0.13±0.02）μmol/L 和（0.05±0.02）μmol/L，HFD 組均較ND 組降低，見(jiàn)圖4。以上結(jié)果表明，高脂飲食引起的肥胖可引起子代神經(jīng)管線粒體功能紊亂。

Figure 3.High-fat diet（HFD）-induced obesity led to the disorder of mitochondrial structure and the increase of cell apoptosis in neu?ral tube of offspring.A：observation of embryonic neural tube development by electron microscopy（×8 000）；B：ultrami?croscopic observation of embryonic mitochondrial structure by electron microscopy（×8 000）；C：the protein levels of Bax and Bcl-2 in embryonic neural tube were detected by Western blot.Mean±SD. n=8.**P<0.01 vs normal diet（ND）group.圖3 高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖引起子代神經(jīng)管線粒體結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞凋亡增加

討 論

肥胖已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題［17］，孕婦超重和肥胖的發(fā)生率逐年增加［18］。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖母親與后代患NTDs 的風(fēng)險(xiǎn)之間存在劑量-反應(yīng)關(guān)系，后代患NTDs的OR 值隨BMI的增加而迅速增加，尤其是當(dāng)BMI≥30 kg/m2時(shí)［19］。此外，一項(xiàng)薈萃分析發(fā)現(xiàn)，母親肥胖與后代神經(jīng)管缺陷風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)［20］。也有研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)管閉合過(guò)程中ATP 含量顯著增加，說(shuō)明在神經(jīng)管發(fā)育過(guò)程中需要更多的能量來(lái)保證神經(jīng)細(xì)胞的正常分化和發(fā)育［21］。這些研究表明，神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育容易受到母體能量代謝的影響。然而，母體肥胖導(dǎo)致子代神經(jīng)管缺陷發(fā)生率增加的機(jī)制尚不清楚。

Figure 4.High-fat diet（HFD）-induced obesity led to the functional disorder of mitochondria in neural tubes of offspring.A：the mito?chondrial membrane potential of embryonic neural tubes was observed by confocal microscopy（×200），and the red-green fluorescence intensity of JC-1-stained embryonic neural tubes was detected by multifunctional microplate reader；B：the ATP content in embryonic neural tubes was determined by multifunctional microplate reader.Mean±SD. n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs normal diet（ND）group.圖4 高脂飲食引起的肥胖導(dǎo)致子代神經(jīng)管線粒體功能紊亂

本研究首先通過(guò)12 周的高脂肪飲食構(gòu)建肥胖小鼠模型，發(fā)現(xiàn)HFD 組體重、血脂明顯高于ND 組，肝臟HE 及油紅O 染色也顯示大量的脂肪堆積在肝細(xì)胞，表明高脂肪飲食成功誘導(dǎo)小鼠肥胖模型。接下來(lái)，將滿足上述條件的雌鼠與成年雄鼠合籠，使其妊娠。在妊娠8.5～10.5 d是小鼠胚胎神經(jīng)管發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，在妊娠14.5 d神經(jīng)管已充分發(fā)育，因此我們選擇E14.5 d神經(jīng)管為研究樣本［22］。nestin被廣泛認(rèn)為是神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物。它在神經(jīng)胚形成時(shí)開(kāi)始表達(dá)，隨著神經(jīng)干細(xì)胞的逐漸遷移和分化，nestin的表達(dá)逐漸減少，并在神經(jīng)干細(xì)胞分化后停止表達(dá)。因此我們?cè)贓14.5 d分離神經(jīng)管，進(jìn)行HE染色、免疫組織化學(xué)染色、Western blot 發(fā)現(xiàn)nestin 在HFD 組的表達(dá)高于ND 組，提示子代神經(jīng)管發(fā)育異常。同時(shí)，我們利用透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)兩組神經(jīng)管的突觸前膜和后膜清晰可見(jiàn)，但HFD 組突觸間隙消失，有一定程度的融合。我們還發(fā)現(xiàn)HFD 組神經(jīng)管線粒體結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)線粒體水腫，出現(xiàn)大量空泡，線粒體嵴斷裂、模糊甚至消失，這與課題組之前的研究結(jié)果一致［23］。

眾所周知，形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變往往伴隨著功能的改變，因此我們進(jìn)一步檢測(cè)了兩組神經(jīng)管的線粒體功能。線粒體膜電位的維持對(duì)線粒體功能至關(guān)重要，因此線粒體膜電位水平被認(rèn)為是線粒體的健康指標(biāo)［24］。JC-1 是一種理想的熒光探針，廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位［25］。當(dāng)線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1在線粒體基質(zhì)中聚集形成聚合物，可產(chǎn)生紅色熒光。相反，當(dāng)膜電位較低時(shí)，JC-1 以單體形式存在，可發(fā)出綠色熒光。因此，可以通過(guò)熒光的顏色變化來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位［26］。本研究中HFD組線粒體膜電位明顯低于ND 組。此外，我們還測(cè)量了神經(jīng)管中細(xì)胞的ATP 含量，因?yàn)槌渥愕腁TP 供應(yīng)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和分化至關(guān)重要。我們發(fā)現(xiàn)HFD組ATP含量明顯低于ND 組，這與我們觀察的線粒體膜電位結(jié)果一致，反映出肥胖小鼠胚胎神經(jīng)管線粒體功能受損。

一般來(lái)說(shuō)，線粒體膜電位的降低是凋亡的特異性早期指標(biāo)之一［27］。細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，在機(jī)體發(fā)育過(guò)程中普遍存在，在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞更新、維持細(xì)胞數(shù)量等方面發(fā)揮著重要作用［28］。細(xì)胞凋亡發(fā)生在神經(jīng)管形成到神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的過(guò)程中。在這一過(guò)程中，細(xì)胞增殖與凋亡之間存在著動(dòng)態(tài)平衡，保證了神經(jīng)管的正常分化和發(fā)育。當(dāng)這種不平衡被破壞時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)管缺陷［29-30］。因此，當(dāng)線粒體膜電位降低時(shí)，我們進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)。Bcl-2 家族在細(xì)胞凋亡線粒體通路中起重要作用，其中Bcl-2是主要的抗凋亡因子，Bcl-2 家族中的Bax 是促凋亡蛋白［31］，因此Bax/ Bcl-2 值是評(píng)價(jià)多種因素介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)［32］。Western blot 結(jié)果顯示，與ND 組相比，HFD 組Bax 升高，Bcl-2降低，Bax/Bcl-2比值升高，說(shuō)明HFD 組神經(jīng)管細(xì)胞凋亡增加。結(jié)合前期nestin檢測(cè)結(jié)果，我們可以得出母體肥胖時(shí)胚胎神經(jīng)管發(fā)育不良，細(xì)胞凋亡增多，打破了正常發(fā)育的平衡。

綜上所述，高脂飲食誘導(dǎo)的母體肥胖影響了子代神經(jīng)管線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而激活線粒體凋亡通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，最終影響子代神經(jīng)管的發(fā)育。然而，母體肥胖引起的胚胎神經(jīng)管發(fā)育不良是由母體胰島素還是瘦素引起，尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。本研究為神經(jīng)管缺損的發(fā)病機(jī)制研究提供了理論依據(jù)，同時(shí)也提示孕婦應(yīng)建立健康的生活和飲食習(xí)慣，保持能量平衡，改善母體肥胖對(duì)后代神經(jīng)發(fā)育的不良影響。