壯通飲對缺氧/復氧誘導的HUVEC/U251細胞屏障損傷的影響*

李 巖， 王凱華△， 朱 亮， 賴思嘉， 李曼菲， 何 青，麻小梅， 梁慧薈， 楊鑫勇， 王亞南

（1廣西中醫(yī)藥大學附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院腦病科，廣西 南寧 530201；2廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200）

血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是由腦毛細血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞、周細胞以及基膜組成的血液與腦組織之間的屏障，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用［1］。已有研究證明，腦卒中、阿爾茨海默病、帕金森病和腦外傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的BBB 通透性會增加，導致腦組織炎癥細胞浸潤、腦水腫而進一步加重腦損傷［2］。許多中藥通過改善血腦屏障通透性參與治療腦神經(jīng)相關(guān)性疾?。?］。 壯醫(yī)經(jīng)驗方壯通飲（Zhuangtongyin，ZTY）由扶芳藤、參三七和黃花倒水蓮3 味廣西特色壯藥配伍而成，具有抗血栓、抗凝血、抗炎及抗氧化等作用，有廣泛臨床用藥基礎(chǔ)，也常作為治療腦梗死的經(jīng)驗藥方［4］。前期研究發(fā)現(xiàn)ZTY 與西藥聯(lián)合使用降低了缺血性腦中風患者神經(jīng)受損程度、提高生活自理能力，并無明顯副反應(yīng)［5］，但機制尚不清楚。因此，本實驗觀察ZTY 對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（hu?man umbilical vein endothelial cells，HUVEC）和人星形細胞瘤U251 細胞共培養(yǎng)模型中緊密連接蛋白［tight junction proteins，TJPs；包括密封蛋白（clau?dins）、閉合蛋白（occludin）、連接黏附分子（junctional adhesion molecules，JAMs）和閉鎖小帶蛋白1（zonula occuldens-1，ZO-1）］、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metal?loproteinases，MMPs）和內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）的影響，研究ZTY 對缺氧/復氧誘導的BBB 損傷的作用及機制。

材料和方法

1 實驗動物

8只8周齡雄性SD大鼠（體重250～300 g）來源于三峽大學，于無特定病原體（specific pathogen free，SPF）條件下飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度22～26 ℃，相對濕度50%～60%，人工光照明暗各12 h。實驗動物使用許可證號為SYXK（鄂）2018-0104，實驗動物在武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司屏障環(huán)境動物實驗設(shè)施（No.00285918）飼養(yǎng)和實驗，合格證號為No.42010200004170。所有動物實驗均符合湖北省動物管理委員會《實驗動物倫理證》的相關(guān)規(guī)定。

2 細胞與試劑

HUVEC來源于iCell；U251細胞來源中國科學院上海細胞庫。戊巴比妥鈉購自Sigma；ZTY 藥材來自廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院民族藥房；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自Gibco；PBS、胰蛋白酶、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺、過硫酸銨、RIPA（強）組織細胞快速裂解液和BCA 蛋白濃度測定試劑盒均購自Solarbio；低糖DMEM 購自HyClone；PVDF 轉(zhuǎn)移膜和化學發(fā)光試劑均購自Millipore；蛋白Marker 購自Helix；兔抗clau?din 3 抗體、兔抗JAM 抗體、兔抗occludin 抗體、兔抗ZO-1 抗體、兔抗ET-1 抗體和羊抗兔IgG 均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司。

3 主要方法

3.1 ZTY 的制備［6］將扶芳藤30 g、黃花倒水蓮25 g 和參三七10 g 去除雜質(zhì)切制，加入生藥材10 倍量的水浸泡60 min 后，用TC-15 套式恒溫器250 V 電壓加熱煎煮，沸騰后將電壓調(diào)低至150 V，微沸狀態(tài)下煎煮1 h 后濾取煎液。藥渣再加入生藥材8 倍量的水，同法煎煮1 h 后濾取煎液。兩次煎液混合后，于恒溫水浴鍋（100 ℃）蒸發(fā)去水分至濃稠狀，轉(zhuǎn)入恒溫烘箱（60 ℃）干燥，獲干浸膏，稱重，收膏率為36.80%，4 ℃保存?zhèn)溆?。臨用前使用蒸餾水溶解浸膏至生藥材含量為200 g/L。

3.2 ZTY 含藥血清的制備將8 只SD 品系大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，分為4 組：空白組及低、中、高劑量ZTY 組，每組2 只?？瞻捉M大鼠等體積蒸餾水灌胃。低、中、高劑量ZTY 組分別采用濃度為0.374 g/mL、0.748 g/mL 和1.496 g/mL 的ZTY 灌胃，10 mL/kg，連續(xù)7 d。最后一次灌胃2 h 后，用3% 戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈取血，提取各組血清，于?70 ℃凍存。若發(fā)現(xiàn)動物未死亡，使用100 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉至無心跳無呼吸后確定動物死亡。

3.3 細胞復蘇及培養(yǎng)將凍存的細胞從液氮罐中取出后，37 ℃水浴融化后加入4 mL 完全培養(yǎng)基，500 r/min 離心3 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。HUVEC 完全培養(yǎng)基為原代內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基+原代內(nèi)皮細胞培養(yǎng)添加劑+5% FBS 和1% 雙抗；U251細胞完全培養(yǎng)基為DMEM+10% FBS，細胞均按照1∶2～1∶3進行傳代。

3.4 體外HUVEC/U251 細胞缺氧/復氧模型的建立［7-9］采用Transwell 系統(tǒng)共培養(yǎng)方法（圖1），將2 mL U251 細胞接種到Transwell 小室的下室，37 ℃下培養(yǎng)24 h，待細胞達到60% 融合后，在Transwell 小室內(nèi)側(cè)接種HUVEC，于37 ℃培養(yǎng)24 h，直到顯微鏡觀察2 種細胞達到高密度共培養(yǎng)。此時用跨內(nèi)皮細胞電阻（transendothelial electric resistance，TEER）檢測共培養(yǎng)細胞模型通透性的變化。TEER≥120 Ω 后把其中的培養(yǎng)基改為低糖DMEM 培養(yǎng)基，并在不含有氧氣的培養(yǎng)環(huán)境（95% N2、5% CO2）中培養(yǎng)2 h后換成完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行復氧培養(yǎng)2 h。

Figure 1.Co-culture of HUVEC and U251 cells with Transwell system.圖1 Transwell系統(tǒng)共培養(yǎng)HUVEC和U251細胞

3.5 細胞分組各組細胞中添加不同的血清培養(yǎng)基37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。實驗分組如下：（1）空白（control）組：共培養(yǎng)細胞模型+含10% 空白血清培養(yǎng)基；（2）模型（model）組：缺氧/復氧共培養(yǎng)細胞模型+含10% 空白血清培養(yǎng)基；（3）低劑量ZTY 組：缺氧/復氧共培養(yǎng)細胞模型+含10%低劑量ZTY血清培養(yǎng)基；（4）中劑量ZTY 組：缺氧/復氧共培養(yǎng)細胞模型+含10% 中劑量ZTY 血清培養(yǎng)基；（5）高劑量ZTY 組：缺氧/復氧共培養(yǎng)細胞模型+含10% 高劑量ZTY 血清培養(yǎng)基。

3.6 TEER 的檢測［10］將電阻儀及筷子電極紫外燈消毒30 min，連接筷子電極至電阻儀，打開電阻儀開關(guān)，靜置筷子電極，待筷子電極電阻值穩(wěn)定后，棄去上下室培養(yǎng)基，用D-Hanks 溶液分別沖洗上下小室后，加入適量的D-Hanks 溶液使上下室液面持平。穩(wěn)定后將筷子電極垂直插入Transwell 小室中，長的一側(cè)電極插入下室，短的一側(cè)電極插入上室，電極膜片置于液面下，不觸碰小室，分別測量各孔不同位置的電阻值，重復3次，并記錄顯示屏上的電阻值（Ω），取平均值記為每孔的測量值。根據(jù)公式計算出實際電阻值：實際電阻值（Ω·cm2）=（實驗孔測量值?空白孔測量值）×PET膜面積（cm2）。

3.7 Western blot 實驗收集HUVEC，用預冷的1×PBS 洗滌細胞后，將細胞密度稀釋為1×106/L，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液200 μL，充分裂解后，取上清進行蛋白質(zhì)定量。SDS-PAGE 分離后，90 V轉(zhuǎn)膜50 min，5% 脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，加Ⅰ抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，洗膜，加Ⅱ抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，洗膜。選用ECL 化學發(fā)光法顯色，通過TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

3.8 RT-qPCR 檢測mRNA 表達收集HUVEC，用Trizol 法提取各組細胞總RNA，將mRNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以逆轉(zhuǎn)錄后cDNA 為模板進行qPCR 擴增。PCR 條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，共40 個循環(huán)。β-actin 作為內(nèi)參照進行樣品間的校正，使用2?ΔΔCt法進行統(tǒng)計分析。引物序列見表1。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，單因素方差分析比較多組間差異，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 HUVEC/U251細胞的形態(tài)學觀察

培養(yǎng)24 h 后，HUVEC 生長情況良好，呈卵圓形、多角形或梭形；U251 細胞密集生長，外形不規(guī)則，有較多突起，形成分支將彼此連接，見圖2。

2 ZTY 減輕體外共培養(yǎng)HUVEC/U251 細胞屏障的損傷

Figure 2.The morphological observation of HUVEC and U251 cells（×200）.圖2 HUVEC和U251細胞的形態(tài)學觀察

檢測不同組共培養(yǎng)HUVEC/U251 細胞的TEER，結(jié)果見圖3。與空白組相比，模型組細胞的TEER 顯著降低［（177.78±10.64）Ω·cm2vs（70.71±12.62）Ω·cm2］，表明模型組細胞的致密性及完整性遭到破壞，通透性增加，共培養(yǎng)HUVEC/U251 細胞屏障損傷模型建立成功；與模型組相比，細胞血清中添加不同劑量的ZTY 共培養(yǎng)后，其TEER 呈現(xiàn)上升趨勢，低、中、高劑量ZTY組TEER與模型組相比差異均有統(tǒng)計學意義［（92.92±1.75）Ω·cm2vs（70.71±12.62）Ω·cm2；（115.15±9.09）Ω·cm2vs（70.71±12.62）Ω·cm2；（127.27±3.03）Ω·cm2vs（70.71±12.62）Ω·cm2］。

Figure 3.Effect of ZTY at different doses on transendothelial electric resistance （TEER） of co-cultured HUVEC/U251 cell barrier in vitro.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group；#P <0.05 vs model group.圖3 不同劑量ZTY 對體外共培養(yǎng)HUVEC/U251 細胞屏障跨內(nèi)皮細胞電阻的影響

3 ZTY 能夠降低共培養(yǎng)HUVEC 中MMPs 及ET-1的mRNA水平

通過RT-qPCR 檢測各組HUVEC 中MMPs 及ET-1 的mRNA 表達情況，結(jié)果如圖4 所示。與空白組相比，模型組MMP2、MMP3、MMP9 和ET-1 的mRNA 表達水平均顯著升高；細胞血清中添加不同劑量的ZTY 共培養(yǎng)后，MMP2、MMP3、MMP9 和ET-1 的mRNA 表達均呈劑量依賴性下降趨勢。與模型組相比，低劑量ZTY 組HUVEC 中MMP2 和ET-1 的mRNA表達差異無統(tǒng)計學顯著性（P>0.05），但MMP3 和MMP9 的mRNA 表達水平均顯著降低（P<0.05），而中、高劑量ZTY 組HUVEC 中MMP2、MMP3、MMP9和ET-1的mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05）。

4 ZTY 對共培養(yǎng)HUVEC 中claudin 3、JAM、occludin、ZO-1和ET-1蛋白水平的影響

與空白組相比，模型組HUVEC 中claudin 3、JAM、occludin和ZO-1蛋白的相對表達量均顯著降低（P<0.05），ET-1 蛋白的相對表達量顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，中、高劑量ZTY 組HUVEC 中claudin 3、JAM、occludin 和ZO-1 蛋白的相對表達量顯著升高（P<0.05），ET-1 蛋白的相對表達量顯著降低（P<0.05），見圖5和表2。

表2 Western blot檢測claudin 3、JAM、occludin、ZO-1和ET-1的蛋白表達水平Table 2.The protein expression levels of claudin 3，JAM，occludin，ZO-1 and ET-1（Mean±SD. n=3）

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷導致微血管結(jié)構(gòu)改變、BBB 結(jié)構(gòu)及功能受損、腦內(nèi)微環(huán)境失衡、腦水腫及缺血性腦損傷再發(fā)展［11-13］。由于BBB 結(jié)構(gòu)較復雜，對其通透性的研究通常是通過建立體外共培養(yǎng)細胞模型而開展的，腦血管內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞的共培養(yǎng)模型應(yīng)用較廣泛［14］。本研究利用Tran?swell系統(tǒng)共培養(yǎng)HUVEC 和U251細胞建立體外細胞屏障的缺氧/復氧模型，模擬體內(nèi)BBB 損傷。與空白組相比，模型組細胞TEER 明顯降低，表明模型建立成功。

Figure 4.Effect of ZTY on the mRNA expression of MMPs and ET-1 in co-cultured HUVEC.A：relative mRNA expression of MMP2；B：relative mRNA expression of MMP3；C：relative mRNA expression of MMP9；D：relative mRNA expression of ET-1.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs model group.圖4 ZTY對共培養(yǎng)HUVEC中MMPs及ET-1 mRNA表達水平的影響

Figure 5.The representitive images of Western blot for deter?mining the protein expression levels of claudin 3，JAM，occludin，ZO-1 and ET-1.圖5 Western blot 檢測claudin 3、JAM、occludin、ZO-1 和ET-1蛋白表達水平

TJPs是組成血腦屏障的結(jié)構(gòu)及基礎(chǔ)，由claudin、occludin 和JAM 三種跨膜蛋白及包漿附著蛋白（ZO-1、ZO-2 和ZO-3）等組成，以二聚體形式存在的跨膜蛋白與同型蛋白結(jié)合形成封閉鏈，將細胞間隙封閉起來，而附著蛋白則是跨膜蛋白和細胞骨架之間的連接蛋白，TJPs 的丟失是BBB 功能破壞的一個指標［15］。Li 等［16］構(gòu)建了缺氧/復氧誘導的BBB 損傷模型，其結(jié)果顯示，缺氧/復氧模型組TJPs（ZO-1和clau?din-5）的表達顯著減少，提示屏障完整性被破壞。MMPs 是多功能內(nèi)肽酶，在大腦中對組織形成、神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)重塑和BBB 完整性至關(guān)重要［17］。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，MMPs可以分解基底膜的細胞外基質(zhì)蛋白并降解TJPs，導致BBB 破壞［18］。王圓圓等［19］在研究瑞舒伐他汀對缺氧/復氧引起的腦微血管內(nèi)皮細胞損傷的作用時，發(fā)現(xiàn)缺氧/復氧引起的腦微血管內(nèi)皮細胞中MMPs（MMP-9 和MMP-2）表達均顯著增加。本研究與上述研究結(jié)果類似，相比于空白組，體外細胞屏障缺氧/復氧模型組細胞中的TJPs 表達下調(diào)，MMPs 表達上調(diào)，表明缺氧/復氧可顯著影響TJPs 和MMPs，導致BBB 通透性和功能發(fā)生改變。這再次證實TJPs 和MMPs 與細胞屏障功能緊密相關(guān)，模型組細胞屏障受損。

ET-1 是由21 個氨基酸組成的縮血管活性多肽，調(diào)節(jié)心血管收縮的重要因子［20］。ET-1可引發(fā)腦缺血性損傷［21］，并且高濃度ET-1 與急性缺血性卒中的不良預后和高死亡率也密切相關(guān)［22］。ET-1在腦損傷中作用的研究較多。Armstead 等［23］的研究表明，腦卒中后ET-1 和c-Jun 氨基末端激酶表達上調(diào)促使白細胞介素6 大量釋放，破壞腦血管自動調(diào)節(jié)功能，加劇組織病理進展。Ronaldson 等［24］發(fā)現(xiàn)，ET-1 與G 蛋白偶聯(lián)受體ETB結(jié)合，使酪氨酸激酶磷酸化，激活PI3K/Akt 及p42/p44 MAPK 通路，促使誘導型一氧化氮合成酶表達并合成NO，進一步硝化酪氨酸而激活MMP9，促使BBB 結(jié)構(gòu)受損并加劇腦水腫。ETA/ETB非選擇性拮抗劑能緩解創(chuàng)傷性腦損傷小鼠的BBB 破壞和腦水腫［25-26］。這均表明ET-1 可作為腦缺血損傷的標志物。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，缺氧/復氧損傷后ET-1蛋白表達顯著升高，給予中、高劑量ZTY 治療后，模型組BBB通透性降低，表現(xiàn)為細胞中TJPs表達上調(diào)，MMPs 表達下調(diào)；此外，中、高劑量ZTY 可降低ET-1蛋白表達。低劑量ZTY 未改變?nèi)毖?復氧后BBB 細胞通透性，但細胞中ET-1、MMP3 及MMP9 的表達降低。本研究結(jié)果表明，缺氧/復氧損傷發(fā)生后，TJPs表達下調(diào)，MMPs 表達上調(diào)，提示細胞屏障通透性增加；同時ET-1 表達上調(diào)；而ZTY 可上調(diào)TJPs、下調(diào)MMPs 并降低ET-1 蛋白水平，說明ZTY 通過調(diào)節(jié)TJPs、MMPs 和ET-1 表達，改善細胞屏障的通透性，減輕缺氧/復氧引起的細胞屏障損傷。

本研究初步確定ZTY 可通過抑制ET1 和MMPs表達、上調(diào)TJPs 表達而減輕缺氧/復氧體外共培養(yǎng)細胞屏障的損傷，但MMPs 和TJPs 的排列方式與細胞屏障功能的作用機制尚有待進一步研究。