circRNA_100395通過結(jié)合miR-31-5p抑制心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因的表達(dá)*

郭 晶， 陳麗文， 溫藝紅， 黃智琪， 陳澤潤， 劉彥俊，朱杰寧， 方咸宏， 徐金東， 單志新，△

（1華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2廣東省心血管病研究所，廣東 廣州 510080；3華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006；4南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510280；5廣東省臨床藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510080）

心肌肥厚是心臟通過增大心肌細(xì)胞體積，增強(qiáng)心肌收縮力，減輕心室壁壓力，以維持心臟正常功能的一種代償反應(yīng)［1］，主要分為生理性心肌肥厚和病理性心肌肥厚，生理性心肌肥厚可維持心臟的正常功能，而病理性心肌肥厚常伴隨心力衰竭（heart failure，HF）、心律失常甚至死亡［2］。HF 是由多種病因引起的心功能損害的一個(gè)共同慢性病理階段［3］，而心肌肥厚是HF 形成的重要病理機(jī)制，因此阻斷心肌肥厚過程對治療HF有重要意義。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是由外顯子或內(nèi)含子通過特殊剪切方式而形成的閉合環(huán)狀分子［4］。與線性mRNA 相比，circRNA 不具有5'-加帽結(jié)構(gòu)及3'-ploy尾，可免受核酸外切酶的消化，豐富表達(dá)于真核細(xì)胞中［5-7］。近年來circRNA 的多種生理功能被發(fā)現(xiàn)，例如，它們作為miRNA 海綿阻止mRNA 翻譯［8］，與RNA 相關(guān)蛋白結(jié)合［9］，通過調(diào)節(jié)剪接或轉(zhuǎn)錄影響基因表達(dá)［10］，從而在生物學(xué)過程和許多疾病的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究表明，circRNA 可影響動(dòng)脈粥樣硬化［11］、心肌梗死［12］以及心室重構(gòu)［13-14］等多種心血管疾病的進(jìn)程，但其具體分子機(jī)制尚不明確。

課題組前期工作顯示，來自于Kelch 蛋白樣家族成員20（Kelch-like family member 20，KLHL20）基因的circRNA_100395 可通過結(jié)合微小RNA-144-3p（microRNA-144-3p，miR-144-3p）發(fā)揮抑制人心房肌成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)基因表達(dá)的作用［15］，而circRNA_100395對于心肌肥厚是否有調(diào)控作用及其機(jī)制尚不清楚。本項(xiàng)工作利用HF 患者心肌組織及血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）誘導(dǎo)的人AC16心肌細(xì)胞肥大模型，檢測circRNA_100395 的表達(dá)特征，利用原代分離乳小鼠心肌細(xì)胞（neonatal mouse ventricular cardiomyocytes，NMVCs），通過重組腺病毒rAd-circRNA_100395介導(dǎo)過表達(dá)該circRNA，探究其對心肌肥大相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控及作用機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF 級(jí)出生1～3 d的C57BL/6乳小鼠，雌雄不限，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK（粵）2013-0034。

2 細(xì)胞株和主要試劑

本文所用細(xì)胞株均購自ATCC。細(xì)胞培養(yǎng)所需胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶（tryp?sin-EDTA）、培養(yǎng)液（DMEM/F-12）等均購自Gibco；Li?pofectamine 2000、Lipofectamine RNAi MAX Reagent、4× SDS Loading Buffer 和Trizol 均購自Invitrogen；2×SYBR Green Mix（TaKaRa）；RIPA 蛋白裂解液（Beyo?time）；PVDF 膜（Whatman）；BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（Millipore）；兔抗β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）抗體（Sigma）；兔抗骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白（skeletal muscle α-actin，ACTA1）抗體、鼠抗GAPDH抗體及抗兔和抗小鼠Ⅱ抗（Protein Technology）；兔抗心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）抗體（Bioworld）；質(zhì)粒提取試劑盒（Omega）；miR-31-5p mimic（廣州銳博生物科技有限公司）；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。本文所涉及的引物均來自Invitrogen，詳細(xì)信息見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)組織本項(xiàng)研究共收集了8份健康捐獻(xiàn)者心肌組織和14份HF患者心肌組織，獲取的人心肌組織樣品均獲得患者知情同意，并經(jīng)廣東省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)No.GDREC2014066A），手術(shù)樣品來源：廣東省心血管病研究所。

3.2 NMVCs 的原代分離與培養(yǎng)取出生1～3 d 的SPF 級(jí)C57BL/6 乳小鼠心臟置于潔凈的冷PBS 溶液中，去除非心肌組織的腺體以及殘留的血液之后轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，加入冷PBS 吹打2～3 次后，加入5 mL 0.25% EDTA-胰蛋白酶和7 mL PBS，4 ℃、70 r/min 于搖床上消化過夜（12～16 h）。過夜后，仍可見完整的心臟組織，終止消化后留取細(xì)胞沉淀，加入7 mL 無血清培養(yǎng)液和70 μL 膠原酶Ⅱ，37 ℃、70 r/min于搖床上孵育消化10 min，用巴式管反復(fù)吹打10～20次，可見組織完全消化。向懸液中加入25 mL 完全培養(yǎng)液終止消化，離心后棄上清，加入冷PBS 重懸后使用70 μm 濾網(wǎng)過濾，300×g常溫離心5 min 收集細(xì)胞。加入完全培養(yǎng)液獲取細(xì)胞懸液，置于75 cm2的培養(yǎng)瓶中，在恒定條件下（溫度為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%）的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5～2 h 后，根據(jù)差速貼壁原理分離NMVCs。將分離的心肌細(xì)胞懸液鋪到預(yù)先用1% 明膠包裹的12 孔板內(nèi)，待細(xì)胞穩(wěn)定生長24 h 后，用PBS 漂洗細(xì)胞后更換新的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后處理。

3.3 RT-qPCR 檢測利用Trizol 法從人心肌組織或NMVCs中提取總RNA。取1 μg總RNA 加入4 μL 5×逆轉(zhuǎn)錄試劑（含有dNTP Mixture、Oligo-dT Primer、Random Primers、PrimeScript RTase 和RNase Inhibi?tor）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后得到普通體cDNA，通過qPCR檢測circRNA_100395 表達(dá)水平及KLHL20 和心肌肥厚標(biāo)志物的mRNA 水平。另外取1 μg 總RNA，加入0.2 μL 特異性miRNA 逆轉(zhuǎn)錄引物、5 μL 5× Prime?Script RT Buffer、1.25 μL RT Enzyme Mix 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到成熟體cDNA，以其為模板進(jìn)行qPCR，以U6為內(nèi)參照檢測miRNAs 的表達(dá)水平。 在ViiA ?7 Quantitative PCR System（Applied Biosystems）中進(jìn)行PCR 和結(jié)果分析。 利用2?ΔΔCt法計(jì)算miRNAs、circRNA_100395、KLHL20和心肌肥厚生物標(biāo)志物的相對表達(dá)水平。

3.4 Western blot 檢測蛋白表達(dá)水平向NMVCs 中加入蛋白裂解液RIPA 冰上裂解15 min 后，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管內(nèi)，4 ℃、10 000×g離心15 min 吸取上清。配制BCA 工作液，37 ℃孵育30 min 后測定蛋白濃度，取20 μg 蛋白上清液，加入4×SDS Loading Buf?fer，混勻后99 ℃、10 min 變性，樣品于深低溫保存?zhèn)溆?。通過SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉，用所需檢測蛋白的相應(yīng)抗體［anti-GAPDH（1∶5 000），anti-β-MHC（1∶2 000），anti-ACTA1（1∶2 000），anti-ANP（1∶1 000）］，對PVDF 膜進(jìn)行4 ℃過夜孵育。用TBST 溶液洗膜3次后用相應(yīng)Ⅱ抗（1∶5 000）進(jìn)行室溫孵育1 h。再次用TBST溶液漂洗3次，ECL發(fā)光試劑盒顯影，內(nèi)參照為GAPDH，利用ImageJ進(jìn)行圖像灰度分析。

3.5 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測以pGL3-promoter為載體，根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測的circRNA_100395 與miR-31-5p 的結(jié)合序列，將該段序列及其突變序列分別插入pGL3-promoter 構(gòu)建雙螢光素酶報(bào)告基因載體。準(zhǔn)備工具細(xì)胞HEK-293 均勻鋪至24 孔板，穩(wěn)定生長后共轉(zhuǎn)染500 ng 上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒、0.2 ng pRL-TK 以及100 nmol/L miR-31-5p mimic，24 h 后收板。 分別測定螢火蟲螢光素酶（firefly luciferase，F(xiàn)L）和海腎螢光素酶（Renillaluciferase，RL）的發(fā)光強(qiáng)度，兩者的比值（FL/RL）變化即可反映circRNA_100395與miR-31-5p相互結(jié)合的能力。

3.6 鬼筆環(huán)肽（phallodin）染色準(zhǔn)備confocal皿，均勻鋪入NMVCs，經(jīng)病毒感染或miR-31-5p mimic 轉(zhuǎn)染處理后，棄原培養(yǎng)液后用PBS 漂洗2 次。吸干PBS，加入500 μL 4% 多聚甲醛固定液，常溫下靜置20～30 min。吸干多聚甲醛溶液，用PBS 清洗2～3 次，每次10 min，加入500 μL 0.1% Triton X-100 透化液，室溫下靜置3～5 min。吸干透化液，再次用PBS 清洗細(xì)胞2～3次。吸干PBS，加入500 μL新鮮配制的鬼筆環(huán)肽工作液（1 mL 1% BSA 溶液加入1 μL 1 000× iFluor 647），常溫下避光靜置60～90 min。染色結(jié)束后，用PBS 清洗3 次，每次5 min。吸干PBS，滴入DAPI 封片劑，于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存，待共聚焦顯微鏡拍攝圖片。

3.7 RNA pull-down 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備NMVCs 均勻鋪于6孔板中，穩(wěn)定生長后感染rAd-circRNA_100395過夜，轉(zhuǎn)染生物素探針標(biāo)記的circRNA_100395-probe，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后提取總RNA，同時(shí)準(zhǔn)備鏈霉素磁珠，將二者混合后室溫孵育30 min。利用磁力架收集磁珠，加入洗脫液反復(fù)洗脫3 次，獲得與磁珠結(jié)合的總RNA 混合物。利用RT-qPCR 檢測可能與circRNA_100395結(jié)合的幾種miRNAs的含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素方差分析（oneway ANOVA），并用Bonferroni 校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 circRNA_100395在HF患者心肌組織中表達(dá)上調(diào)

麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）染色結(jié)果顯示，與健康對照組相比，HF 患者的心肌細(xì)胞面積明顯增大，呈現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大現(xiàn)象（圖1A）。通過Western blot 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，相對于健康器官捐獻(xiàn)者，HF 患者心肌組織β-MHC 及ACTA1 蛋白水平顯著上調(diào)（P<0.01），見圖1B。RT-qPCR 結(jié)果提示circRNA_100395及其宿主基因KLHL20在HF患者心肌組織中表達(dá)上調(diào)（P<0.05），見圖1C。PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，circRNA_100395 可由人cDNA 擴(kuò)增出特異性條帶，而不能由人基因組DNA（genomic DNA，gDNA）擴(kuò)增，見圖1D。通過DNA 測序，證實(shí)PCR 產(chǎn)物中包含正確的circRNA_100395 接頭序列（圖1E）。RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)表明在Ang II 處理的AC16心肌細(xì)胞肥大模型中，circRNA_100395 及其宿主基因KLHL20表達(dá)下調(diào)（P<0.05），見圖1F。

2 circRNA_100395 抑制心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因的表達(dá)

Figure 1.Up-regulation of circRNA_100395 in the myocardium of patients with heart failure（HF）.A：the cross-sectional area of car?diomyocytes was increased in the myocardium of HF patients（WGA staining，scale bar=100 μm）；B：the protein expres?sion of β-MHC and ACTA1 in the myocardium of HF patients and healthy controls detected by Western blot；C：the expres?sion of circRNA_100395 and KLHL20 mRNA in the myocardium of HF patients and healthy controls detected by RTqPCR；D：identification of circRNA_100395 and KLHL20 gene by PCR assay；E：DNA sequencing results confirmed the correct sequence of the junction site of circRNA_100395；F：the expression of circRNA_100395 and KLHL20 mRNA in Ang-II-treated human cardiomyocyte AC16 cells detected by RT-qPCR. n=3.Mean±SD.*P<0.05，**P<0.01 vs healthy controls；#P<0.05 vs vehicle.圖1 circRNA_100395在心衰患者心肌組織中表達(dá)上調(diào)

利用定向克隆構(gòu)建重組circRNA_100395 腺病毒感染NMVCs，24 h后收板，倒置熒光顯微鏡下可見rAd-circRNA_100395 表達(dá)的綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP），顯示腺病毒感染NMVCs充分（圖2A）。RT-qPCR 結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)circRNA_100395 在rAd-circRNA_100395 感染 的NMVCs 中 表達(dá)含量顯著增加（P<0.01），見圖2B，同時(shí)隨cir?cRNA_100395 表達(dá)含量增加，心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因Myh7（蛋白β-MHC）、Acat1以及Anp的mRNA 和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），見圖2C、D。鬼筆環(huán)肽染色可見Ang II 處理后的NMVCs 細(xì)胞表面積明顯增大，而感染rAd-circRNA_100395可有效逆轉(zhuǎn)由Ang II引起的的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)，見圖2E。

3 circRNA_100395與miR-31-5p相互作用的鑒定

通過生物信息學(xué)預(yù)測，circRNA_100395 與miR-31-5p 存在結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。通過雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，分別構(gòu)建pGL3-circRNA_100395 和pGL3-circRNA_100395-mut，將兩種質(zhì)粒分別與miR-31-5p mimic 共轉(zhuǎn)染至HEK293 細(xì)胞中，結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染circRNA_100395 與miR-31-5p mimic，螢光素酶活性相對于對照組顯著降低（P<0.05），而將該位點(diǎn)突變后，其螢光素酶活性無明顯改變（圖3B）。RT-qPCR結(jié)果提示，miR-31-5p 在HF 病人心肌組織中表達(dá)下調(diào)（P<0.05），見圖3C。同時(shí)，在NMVCs 中感染rAdcircRNA_100395 可 引 起miR-31-5p 降 低（P<0.05）（圖3D）。通過RNA-RNA pull-down 實(shí)驗(yàn)，利用生物素標(biāo)記的circRNA_100395 探針可明顯富集NMVCs中miR-31-5p（P<0.01）（圖3E）。

Figure 2.circRNA_100395 attenuates the expression of hypertrophy-related genes in NMVCs.A：adenovirus-mediated efficient overexpression of circRNA_100395 in NMVCs（the infection of recombinant circRNA_100395 adenovirus（rAd-circRNA_100395）was monitored by the co-expressed marker of GFP；scale bar=100 μm）；B：the expression of circRNA_100395 determined by RT-qPCR；C：the mRNA expression of β-MHC，ACTA1 and ANP in NMVCs detected by RT-qPCR；D：the protein expression of β-MHC，ACTA1 and ANP in NMVCs determined by Western blot；E：morphological changes of NMVCs observed by Phalloidin-iFluor 647 staining（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs rAd-GFP group；#P<0.05 vs rAd-GFP+Ang II group.圖2 circRNA_100395抑制乳小鼠心肌細(xì)胞中肥大相關(guān)基因的表達(dá)

4 miR-31-5p 可減弱circRNA_100395 對心肌細(xì)胞肥大的抑制作用

Figure 3.Identification of interaction between circRNA_100395 and miR-31-5p.A：bioinformatics prediction showed the potential binding sites of miR-31-5p in circRNA_100395（the mutant nucleotides were labled in red）；B：verification of miR-31-5p as a target gene of circRNA_100395 by the dual-luciferase reporter assay；C：the expression of miR-31-5p in the myocar?dium of HF patients and healthy controls；D：the expression of miR-31-5p in NMVCs with overexpression of circRNA_100395；E：the levels of miRNAs which were pulled down by circRNA_100395 in NMVCs.Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs pRL-TK+PGL3_circRNA_100395-wt+scramble group；#P<0.05 vs healthy control group；△P<0.05 vs rAd-GFP group；▲▲P<0.01 vs miR_200a-3p group.圖3 CircRNA_100395與miR-31-5p相互結(jié)合作用的鑒定

利用Lipofectamine 試劑，將miR-31-5p mimic 轉(zhuǎn)染至NMVCs 中低血清培養(yǎng)30 h，RT-qPCR 結(jié)果顯示，NMVCs 中miR-31-5p 含量顯著增加（P<0.01），同時(shí)促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因Myh7、Acta1以及Anp的mRNA 表達(dá)（P<0.01）見圖4A、B。另外Western blot 實(shí)驗(yàn)得到與mRNA 水平一致的結(jié)果，在轉(zhuǎn)染了miR-31-5p mimic 后，β-MHC、ACTA1 以及ANP 表達(dá)水平顯著增加，見圖4C。鬼筆環(huán)肽染色可見miR-31-5p 可明顯增加NMVCs 的肥大反應(yīng)（P<0.05），見圖4D）。利用NMVCs，先行感染rAd-circRNA_100395過夜后再轉(zhuǎn)染100 nmol/L miR-31-5p mimic，24 h 后檢測心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因的表達(dá)情況。Western blot 結(jié)果顯示，感染circRNA_100395 的NMVCs 的β-MHC、ACTA1 以及ANP 表達(dá)顯著下調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-31-5p 可減弱circRNA_100395 對β-MHC、ACTA1 以及ANP表達(dá)的抑制作用（圖4E）。

討 論

前期研究［15］已證實(shí)，circRNA_100395 可通過結(jié)合miR-144-3p 發(fā)揮抑制心肌纖維化相關(guān)基因表達(dá)，但其對心肌肥厚的調(diào)控作用及機(jī)制尚不清楚。本研究表明circRNA_100395 通過結(jié)合miR-31-5p 抑制乳小鼠心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因的表達(dá)，提示該circRNA對于心肌纖維化和心肌肥厚具有雙重抑制作用，可能成為心肌重構(gòu)治療研究的重要靶點(diǎn)。

本項(xiàng)研究結(jié)果顯示circRNA_100395 及其宿主基因KLHL20在HF 患者心肌組織中表達(dá)升高，而在Ang II 誘導(dǎo)的AC16 心肌肥大模型中表達(dá)降低，這種整體和細(xì)胞水平表達(dá)特征不一致提示人心肌組織和心肌重構(gòu)病理機(jī)制的復(fù)雜性。心肌組織包括心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫相關(guān)細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞構(gòu)成。HF 是多種心血管疾病的終末階段，往往由心肌肥厚發(fā)展而來［16］；HF 發(fā)生時(shí)，多種信號(hào)通路被激活［17］，炎癥因子或者細(xì)胞因子釋放，進(jìn)而可引起體內(nèi)多種circRNA以及mRNA的表達(dá)改變，進(jìn)而出現(xiàn)與細(xì)胞水平不一致的情況。

Figure 4.miR-31-5p reversed the inhibitory effect of circRNA_100395 on the expression of hypertrophy-related genes in NMVCs.A：miR-31-5p level in NMVCs transfected with miR-31-5p mimic；B：the mRNA expression of β-MHC，ACTA1 and ANP in NMVCs transfected with miR-31-5p mimic；C：the protein expression of β-MHC，ACTA1 and ANP in NMVCs transfected with miR-31-5p mimic；D：morphological changes of NMVCs observed by Phalloidin-iFluor 647 staining（scale bar=50 μm）；E：the protein expression of β-MHC，ACTA1 and ANP in NMVCs determined by Western blot.Mean±SD. n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs scramble；△P<0.05，△△P<0.01 vs scramble+rAd-GFP；#P<0.05 vs miR-31-5p+rAd-GFP.圖4 miR-31-5p過表達(dá)可以減弱circRNA_100395對心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因的抑制作用

已有研究證實(shí)來自于胞質(zhì)的circRNA 可通過海綿吸附microRNA 以解除對下游靶基因的控制而發(fā)揮生物學(xué)作用［18］，課題組前期的研究證實(shí)circRNA_000203 通過競爭性結(jié)合miR-26b-5p 和miR-140-3p，阻斷二者與下游靶基因gata4結(jié)合，從而發(fā)揮促進(jìn)心肌肥厚的作用［19］。在本項(xiàng)研究中，通過生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)合雙螢光素酶報(bào)告基因以及RNA-RNA pulldown 實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了circRNA_100395 與miR-31-5p 的結(jié)合作用。在HF 病人心肌中circRNA_100395 與miR-31-5p 呈現(xiàn)相反的表達(dá)特征，而在NMVCs 中過表達(dá)circRNA_100395 可顯著降低miR-31-5p 水平，也提示兩者間存在表達(dá)調(diào)控關(guān)系。功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過表達(dá)miR-31-5p 可以特異地增加NMVCs 的肥大反應(yīng)，減弱circRNA_100395 對心肌細(xì)胞肥大的抑制作用，證實(shí)circRNA_100395 可通過結(jié)合miR-31-5p 發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞肥大的作用。我們既往研究證實(shí)circRNA_100395可通過結(jié)合miR-144-3p抑制心肌纖維化相關(guān)基因的表達(dá)［15］，本文研究明確circRNA_100395 通過結(jié)合miR-31-5 抑制心肌細(xì)胞的肥大作用，因此說明circRNA_100395 是通過結(jié)合不同的miRNAs 分別發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞肥大和纖維化表型的，具有細(xì)胞類型的特異性。

以往研究證實(shí)miR-31-5p 可參與多種心血管疾病的調(diào)控，如miR-31-5p 可抑制心肌素表達(dá)，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換以及主動(dòng)脈瘤和夾層的發(fā)生［20］。miR-31-5p 可參與lncRNA Tincr 調(diào)控PKC? 的表達(dá)，抑制miR-31-5p 的表達(dá)可以顯著逆轉(zhuǎn)由ln?cRNA Tincr 引起的心肌細(xì)胞的增大［21］。而在本研究再次證實(shí)miR-31-5p 可以增加心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因表達(dá)和肥大反應(yīng)，與既往的報(bào)道一致［21］，也提示抑制miR-31-5p 功能可能發(fā)揮減弱心肌細(xì)胞肥大的作用。

綜上，本項(xiàng)研究提示circRNA_100395 在HF 組織中表達(dá)上調(diào)，circRNA_100395 可抑制心肌細(xì)胞肥大相關(guān)基因的表達(dá)，而該作用可被與其特異結(jié)合的miR-31-5p 逆轉(zhuǎn)。后續(xù)我們將繼續(xù)明確miR-31-5p 的下游靶點(diǎn)，探究其具體的分子機(jī)制以及涉及的信號(hào)通路，并在整體上驗(yàn)證circRNA_100395 通過結(jié)合miR-31-5p 發(fā)揮抑制心肌肥厚的機(jī)制，為開展基于circRNA的心肌肥厚治療研究提供科學(xué)資料。