硫化氫通過NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬調(diào)控鐵死亡而減輕CSE誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷*

王 瑩， 廖 莎， 潘子涵， 蔣思敏， 樊 靜， 陳亞紅， 張 靜

（北京大學(xué)第三醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科，北京 100191）

慢性阻塞性肺疾?。ê喎Q慢阻肺），是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一，吸煙被認(rèn)為是慢阻肺發(fā)生發(fā)展的主要因素。煙草煙霧含有顆粒、自由基和活性物質(zhì)等約4 500種化學(xué)成分，提示可能有多種損傷及細(xì)胞死亡機(jī)制參與CSE 介導(dǎo)的細(xì)胞損傷［1］。氣道上皮細(xì)胞是肺臟與外界進(jìn)行氣體交換的第一道屏障，近期研究表明，CSE 誘發(fā)的氣道上皮細(xì)胞鐵死亡參與了慢阻肺的進(jìn)程［2］。鐵死亡（ferropto?sis）是Dixon等［3］在2012年發(fā)現(xiàn)的一種新型細(xì)胞死亡形式，其特征是鐵介導(dǎo)的Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生活性氧（re?active oxygen species，ROS）引起的脂質(zhì)過氧化，活性鐵是其基礎(chǔ)。而細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定的鐵可通過鐵自噬（ferritinophagy）途徑產(chǎn)生。鐵自噬是一種新型的自噬類型，此過程的發(fā)生依賴于特異性受體核受體輔激活因子4（nuclear receptor coactivator 4，NCOA4），它能將鐵蛋白運(yùn)輸?shù)阶允尚◇w，而后與溶酶體融合，使鐵蛋白降解為活性鐵［4］。因此，抑制鐵自噬-鐵死亡可能會(huì)對(duì)保護(hù)氣道上皮細(xì)胞進(jìn)而阻斷慢阻肺進(jìn)展提供新的思路。

硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是繼一氧化氮和一氧化碳之后發(fā)現(xiàn)的第3 種新型內(nèi)源性氣體信號(hào)分子。本課題組長期圍繞H2S 在呼吸系統(tǒng)的作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等多種功能［5］。然而，H2S 是否具有抗肺泡上皮細(xì)胞鐵死亡的作用，尚屬未知。因此，本項(xiàng)工作通過使用CSE 作為刺激物建立肺泡上皮損傷細(xì)胞模型，圍繞鐵自噬-鐵死亡信號(hào)通路，探討H2S 在肺泡上皮細(xì)胞中的作用，以期為慢阻肺的防治提供參考資料。

材料和方法

1 細(xì)胞株和主要試劑

人源肺泡上皮細(xì)胞BEAS-2B 購自ATCC 上海細(xì)胞庫；RPMI-1640 培養(yǎng)液購自HyClone；澳洲胎牛血清購自Gibco；香煙（白沙牌，含焦油11 mg、煙堿0.9 mg 及煙氣一氧化碳12 mg）；硫氫化鈉（sodium hydro?sulfide，NaHS）購自Sigma-Aldrich；CCK-8 試劑盒購自日本同仁公司；ROS 檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；BODIPY 581/591 C11 脂質(zhì)ROS（lipid ROS，Lip ROS）檢測試劑盒購自Invitrogen；丙二醛（malondial?dehyde，MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；鐵離子檢測試劑盒、抗NCOA4 抗體（1∶1 000）、抗鐵蛋白重鏈1（ferritin heavy chain 1，F(xiàn)TH1）抗體（1∶1 000）、抗環(huán)加氧酶2（cyclooxygenase 2，COX2）抗體（1∶1 000）、抗谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）抗體（1∶1 000）和抗GAPDH 抗體（1∶5 000）均購自Abcam；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶10 000）購自北京中杉金橋公司。

2 主要方法

2.1 藥物準(zhǔn)備NaHS 作為H2S 供體用PBS 溶解配成10 mmol/L儲(chǔ)存液，?80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?，在CSE加入前30 min 預(yù)處理。CSE 需現(xiàn)用現(xiàn)配，1 支香煙對(duì)應(yīng)10 mL 無胎牛血清培養(yǎng)液，點(diǎn)燃香煙，包式吸收管內(nèi)緩慢勻速抽吸，再經(jīng)0.22 μm 濾器除菌，而后使用分光光度計(jì)在320 nm 處測定液體吸光度（absorbance，A），范圍在4.00±0.05內(nèi)可用，即為100%的CSE。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)BEAS-2B 細(xì)胞用含有10% 胎牛血清、1×105U/L 青霉 素和100 mg/L 鏈 霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。除特殊說明外，其他實(shí)驗(yàn)均將4×105個(gè)BEAS-2B 細(xì)胞接種于6 孔板中，細(xì)胞完全貼壁后，按照分組給予藥物刺激處理24 h。

2.3 CCK-8 法檢測BEAS-2B 細(xì)胞活力取對(duì)數(shù)期的BEAS-2B 細(xì)胞以每孔5×103個(gè)的密度接種于含100 μL 完全培養(yǎng)液的96 孔板中，細(xì)胞完全貼壁后用不同濃度的CSE或NaHS處理24 h。棄培養(yǎng)液后PBS洗3 次，每孔加入含10% CCK-8 檢測液的培養(yǎng)液100 μL，37 ℃孵育2 h后490 nm處使用酶標(biāo)儀測量A值。

2.4 Fe2+含量檢測藥物處理完成后收集細(xì)胞沉淀，加入100 μL裂解液，使用杜恩斯勻漿器冰上勻漿10 次，離心取上清。按照鐵離子檢測試劑盒說明書加入探針，于593 nm 處測得A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算鐵離子濃度。

2.5 脂質(zhì)過氧化分析取對(duì)數(shù)期的BEAS-2B 細(xì)胞以每孔5×104個(gè)的密度接種于共聚焦皿中，細(xì)胞完全貼壁后用CSE 或NaHS 處理24 h。棄上清，加入含BODIPY?581/591 C11（7 μmol/L）的無血清培養(yǎng)液，37 ℃孵育30 min，PBS 洗3 次，最后活細(xì)胞狀態(tài)下使用共聚焦顯微鏡采集熒光圖片。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS和Lip ROS含量藥物處理完成后收集細(xì)胞沉淀，用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA 熒光探針（終濃度為2μmol/L）或BODIPY?581/591 C11 熒光探針（終濃度為7 μmol/L），每孔0.5 mL/孔重懸細(xì)胞，37 ℃孵育30 min。吸棄含探針的培養(yǎng)液后用無血清培養(yǎng)液潤洗細(xì)胞2次，每個(gè)樣品加入無血清培養(yǎng)液150 μL重懸，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

2.7 ELISA 法檢測細(xì)胞內(nèi)MDA 及GSH-Px含量藥物處理完成后收集細(xì)胞沉淀，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，BCA 蛋白定量試劑盒測定裂解液上清中的蛋白濃度。按照廠家說明書測定檢測裂解液上清中MDA和GSH-Px 的含量。最后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各自濃度。

2.8 Western blot 法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)藥物處理完成后收集細(xì)胞沉淀，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，使用BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，蛋白變性后存于?20℃。按照40 μg 上樣量上樣，經(jīng)SDS-PAGE 后電轉(zhuǎn)，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入目的蛋白Ⅰ抗4℃搖床孵育過夜。回收Ⅰ抗，1× TBST 洗3 次每次5 min，再加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST 洗3 次后ECL 顯影，應(yīng)用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度CSE 刺激對(duì)鐵死亡標(biāo)志物GPX4 及COX2表達(dá)的影響

Western blot 檢測結(jié)果顯示，隨著CSE 濃度的增加，BEAS-2B 細(xì)胞內(nèi)COX2 表達(dá)水平呈上升趨勢，且濃度大于3% 時(shí)，表達(dá)量加劇，增加至1.5 倍以上（P<0.01）；而GPX4蛋白表達(dá)水平與CSE濃度呈反比，在5%濃度時(shí)開始顯著降低（P<0.01），見圖1。

Figure 1.Effects of treatment with different concentrations of CSE for 24 h on the protein expression of COX2 and GPX4 in BEAS-2B cells.The expression of target pro?teins was measured by Western blot.Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs control（0% CSE）group.圖1 不同濃度CSE 處理24 h 對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞中COX2 和GPX4蛋白表達(dá)的影響

2 NaHS及CSE處理對(duì)BEAS-2B細(xì)胞活力的影響

不同濃度的CSE 處理24 h 后BEAS-2B 細(xì)胞活力的變化如圖2A 所示，CSE 對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞活力的影響具有濃度依賴性，且當(dāng)濃度在5% 時(shí)細(xì)胞活力顯著下降至60% 左右（P<0.01）。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［2］，選擇5%作為后續(xù)的CSE刺激濃度。

進(jìn)一步檢測NaHS對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果如圖2B 所示。與CSE 刺激組相比，NaHS（200和400 μmol/L）預(yù)處理可明顯增強(qiáng)CSE刺激后BEAS-2B 細(xì)胞的活力（P<0.01），并呈劑量依賴性。值得注意的是，單純NaHS處理細(xì)胞也可增強(qiáng)BEAS-2B細(xì)胞活力（P<0.05）。

3 NaHS 及CSE 處理對(duì)BEAS-2B 細(xì)胞Fe2+含量的影響

接下來提取細(xì)胞內(nèi)Fe2+評(píng)估CSE及NaHS預(yù)處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性鐵的影響，結(jié)果如圖3 所示。與空白對(duì)照組相比，CSE 處理可以使細(xì)胞內(nèi)Fe2+含量呈現(xiàn)約2 倍的升高（P<0.01）；而相比于CSE 單純刺激組，NaHS 預(yù)處理組Fe2+含量有所下降，且高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

4 NaHS 及CSE 處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS 及Lip ROS 的產(chǎn)生和氧化-抗氧化系統(tǒng)的影響

通過對(duì)Lip ROS、ROS、MDA 及GSH-Px 含量進(jìn)行檢測評(píng)估氧化還原系統(tǒng)，結(jié)果如圖4所示。單純CSE處理能刺激綠光的大量產(chǎn)生，使細(xì)胞處于氧化狀態(tài)，而NaHS預(yù)處理可減輕CSE介導(dǎo)的細(xì)胞氧化程度。

Figure 2.Effects of CSE and NaHS on the viability of BEAS-2B cells.A：effects of treatment with different concentrations of CSE for 24 h on BEAS-2B cell viability；B：effects of 30 min of NaHS pretreatment on the viability of BEAS-2B cells treated with 5% CSE for 24 h.Mean±SD. n=4.*P<0.01 vs control（0% CSE or 0% CSE+0 μmol/L NaHS）group；##P<0.01 vs 5%CSE group.圖2 CSE和NaHS對(duì)BEAS-2B細(xì)胞活力的影響

Figure 3.Cellular iron content in BEAS-2B cells of each group.The cells were treated with 5% CSE for 24 h with or without 30 min of NaHS pretreatment.Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs control（0% CSE+0 μmol/L NaHS）group；#P<0.05 vs 5% CSE group.圖3 各組BEAS-2B細(xì)胞鐵含量

除此之外我們還對(duì)細(xì)胞內(nèi)的ROS 及Lip ROS 進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果如圖5A、B 所示。與空白對(duì)照組相比，CSE 處理使細(xì)胞內(nèi)Lip ROS及總ROS的水平增加2 倍以上；而給予NaHS 預(yù)處理后Lip ROS及ROS 顯著減少（P<0.05），且與NaHS 濃度呈正相關(guān)。此外，MDA 結(jié)果也與ROS 趨勢相符，見圖5C。GSH-Px是體內(nèi)重要的抗氧化系統(tǒng)組分之一，如圖5D所示，CSE 引起的GSH-Px 水平降低可被NaHS 拮抗，且在高濃度時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

5 NaHS 及CSE 處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)鐵自噬-鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響

為了探究NaHS 抵抗CSE 引起的細(xì)胞損傷的機(jī)制，我們對(duì)細(xì)胞內(nèi)鐵自噬-鐵死亡相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖6 所示。與對(duì)照組相比，單純CSE 可導(dǎo)致鐵自噬-鐵死亡相關(guān)蛋白NCOA4、FTH1和COX2的水平顯著升高（P<0.01），同時(shí)GPX4 表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；而不同濃度NaHS可顯著逆轉(zhuǎn)CSE單純刺激的結(jié)果，使鐵自噬-鐵死亡相關(guān)蛋白NCOA4、FTH1 及COX2 的表達(dá)水平呈現(xiàn)不同程度的下降，GPX4蛋白有所上升（P<0.05），且這些蛋白的變化具有濃度依賴性。

討 論

慢阻肺是危害我國民眾健康的常見病，隨著疾病的進(jìn)展，可能會(huì)導(dǎo)致呼吸衰竭，并且造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響生命安全和生活質(zhì)量［6］。慢阻肺的發(fā)病以活性氧為基礎(chǔ)，活性氧通過激活促炎轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡、細(xì)胞衰老和DNA 損傷，損害抗蛋白酶防御能力等途徑，促進(jìn)和增強(qiáng)氧化應(yīng)激級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致氣道炎癥及肺氣腫［7］。香煙煙霧、空氣污染和生物學(xué)煙霧是肺部氧化應(yīng)激的主要外源性來源，并且多種細(xì)胞損傷方式參與這些危險(xiǎn)因素的致病過程［8］，鐵死亡是其中一種細(xì)胞死亡形式。鐵死亡是一種由脂質(zhì)過氧化以鐵依賴的方式引發(fā)的細(xì)胞死亡形式。已有文獻(xiàn)顯示CSE 具有激活鐵死亡的作用。例如，給予CSE 刺激后，血管平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)鐵死亡特異性標(biāo)志物PTGS2 上調(diào)、脂質(zhì)過氧化增加和谷胱甘肽消耗增加等鐵死亡特征性變化［9］。而在肺部，Park 等［10］對(duì)支氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行CSE 暴露研究，結(jié)果表明CSE 可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和誘導(dǎo)缺氧引起線粒體動(dòng)態(tài)穩(wěn)態(tài)紊亂進(jìn)而誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞鐵死亡。此外，目前最有說服力的一項(xiàng)研究來源于Yoshida 等［2］，他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CSE 可通過NCOA4 介導(dǎo)的鐵自噬促進(jìn)不穩(wěn)定的鐵積累，導(dǎo)致人肺上皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化和鐵死亡，參與了慢阻肺的發(fā)病。而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著CSE 濃度的增加，鐵死亡標(biāo)志蛋白COX2表達(dá)水平逐漸升高，GPX4逐漸降低，且單純CSE 刺激可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)總ROS、Lip ROS、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 及活性鐵離子顯著增加，抗氧化酶GSH-Px 的水平顯著降低，以及鐵自噬相關(guān)蛋白NCOA4 和FTH1 的大量增加，證實(shí)CSE介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷機(jī)制中確實(shí)有鐵死亡參與。

Figure 4.Effects of NaHS and CSE on membrane lipid peroxidation in BEAS-2B cells measured by confocal fluorescence microscopy，using C11-BODIPY as a probe（scale bar=50 μm）.The cells were treated with 5% CSE for 24 h with or without 30 min of NaHS（400 μmol/L）pretreatment.BODIPY?581/591 C11 reagent is a sensitive fluorescent reporter for lipid peroxida?tion，and the fluorescence shifts from red to green upon oxidation in live cells.Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs control group；##P<0.05 vs CSE group.圖4 共聚焦熒光顯微鏡檢測NaHS及CSE處理對(duì)BEAS-2B細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的影響

Figure 5.Effects of NaHS and CSE on the levels of lipid ROS（A），ROS（B），MDA（C）and GSH-Px（D）in BEAS-2B cells.The cells were treated with 5% CSE for 24 h with or without 30 min of NaHS pretreatment.Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs control（0% CSE+0 μmol/L NaHS）group；#P<0.05，##P<0.01 vs 5% CSE group.圖5 NaHS和CSE對(duì)BEAS-2B細(xì)胞中脂質(zhì)ROS、ROS、MDA和GSH-Px水平的影響

Figure 6.Effects of NaHS and CSE on the expression levels of ferritinophagy-ferroptosis-related proteins in BEAS-2B cells detected by Western blot.The cells were treated with 5% CSE for 24 h with or without 30 min of NaHS pretreatment.A：the expres?sion of GPX4 and COX2；B：the expression of NCOA4 and FTH1.Mean±SD. n=4.*P<0.05，**P<0.01 vs control（0%CSE+0 μmol/L NaHS）group；#P<0.05，##P<0.01 vs 5% CSE group.圖6 Western blot檢測NaHS和CSE對(duì)BEAS-2B細(xì)胞中鐵自噬-鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

自噬是在應(yīng)激、饑餓或缺氧期間維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的生理過程［11］。2014 年Mancias 等［12］通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定NCOA4 為介導(dǎo)鐵自噬的特異性受體，提出鐵自噬的概念，由此將自噬與鐵死亡聯(lián)系在一起。越來越多的研究也證實(shí)鐵自噬具有調(diào)控鐵死亡的作用。例如，Masaldan 等［13］的研究顯示，衰老細(xì)胞中的鐵積累與鐵自噬能力受損和鐵死亡受抑制有關(guān)。Latunde-Dada等［14］的研究顯示，半胱氨酸缺失介導(dǎo)的鐵蛋白降解通過NCOA4 介導(dǎo)的自噬途徑釋放鐵。Gao 等［15］報(bào)道，通過抑制自噬或抑制NCOA4 的表達(dá)可抑制鐵自噬的發(fā)生，從而導(dǎo)致鐵蛋白酶相關(guān)的細(xì)胞不穩(wěn)定鐵和Lip ROS的積聚。基于此，在慢阻肺中抑制鐵自噬進(jìn)而抑制鐵死亡的策略有待研究。

H2S 是一種有臭雞蛋氣味的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子。在本研究中，H2S處理能明顯提高CSE 暴露下肺泡上皮細(xì)胞的活力，對(duì)細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，這與先前對(duì)不同細(xì)胞進(jìn)行H2S 預(yù)處理的研究結(jié)果一致［16-18］。且目前已有文獻(xiàn)報(bào)道H2S 可通過抑制鐵死亡發(fā)揮抗損傷作用，例如H2S 能通過調(diào)節(jié)Sirt6 而抑制炎癥，降低PFC 和BV2 細(xì)胞的鐵死亡，緩解1 型糖尿病小鼠焦慮樣和抑郁樣行為［19］。胱硫醚γ-裂解酶/H2S 系統(tǒng)可作為預(yù)防骨骼肌鐵死亡的靶點(diǎn)［20］。氧化還原失衡是鐵死亡的核心機(jī)制，脂質(zhì)過氧化是鐵死亡發(fā)生過程中最關(guān)鍵的一步，而抗氧化是H2S重要的防護(hù)機(jī)制［21］。基于這些理論，我們推測H2S抗CSE介導(dǎo)的細(xì)胞損傷的機(jī)制可能與調(diào)控鐵自噬-鐵死亡途徑、抑制細(xì)胞內(nèi)活性鐵的產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化過程有關(guān)。

為驗(yàn)證這一假設(shè)，接下來我們對(duì)H2S處理后的細(xì)胞內(nèi)氧化還原標(biāo)志物如Lip ROS、ROS、MDA 和GSHPx 水平，細(xì)胞內(nèi)活性鐵水平，鐵自噬標(biāo)志蛋白NCOA4 和FTH1，以及鐵死亡標(biāo)志蛋白COX2 和GPX4 進(jìn)行了檢測。與預(yù)期結(jié)果一致，H2S 處理能夠顯著增加抗氧化酶GSH-Px 及GPX4 的水平，同時(shí)抑制NCOA4、FTH1 和COX2 的表達(dá)及活性鐵的釋放，減少ROS、Lip ROS 和MDA 的產(chǎn)生，且NaHS 濃度越高效果越顯著，證實(shí)H2S抗CSE誘導(dǎo)的損傷作用至少部分是通過抑制鐵自噬、抵抗鐵死亡信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究說明H2S能通過減輕細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化失衡和鐵超載而減輕CSE 誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞鐵死亡，這可能是通過抑制NCOA4 介導(dǎo)的鐵自噬調(diào)控途徑來實(shí)現(xiàn)的。