趨化因子受體2抑制劑在急性痛風(fēng)小鼠模型中的作用研究

宣丹旦 趙力 薛愉 趙天儀 曹靈 萬偉國

痛風(fēng)是一類尿酸沉積性炎癥性疾病。近年來,痛風(fēng)和高尿酸血癥繼高血壓、糖尿病、冠心病之后成為威脅人類健康的又一重大疾病,其患病率呈逐年上升趨勢[1]。一項(xiàng)納入2000～2014年發(fā)表研究的Meta分析結(jié)果顯示,我國大陸痛風(fēng)患病率為1.1%,高尿酸血癥為13.3%[2]。我國2004年山東沿海地區(qū)痛風(fēng)患病率為1.14%(近10年內(nèi)增加了3倍)[3]。目前痛風(fēng)急性發(fā)作控制手段主要為非甾體抗炎藥(NSAIDs)、秋水仙堿、糖皮質(zhì)激素,對(duì)于部分腎功能不全合并胃腸道出血或存在其他藥物禁忌的患者治療手段有限。因此,探索新的藥物治療靶點(diǎn)很有必要。中性粒細(xì)胞的入侵和活化是痛風(fēng)急性炎癥的重要環(huán)節(jié),可在巨噬細(xì)胞啟動(dòng)炎癥之后使炎癥進(jìn)一步擴(kuò)大,而這一過程依賴于趨化因子。根據(jù)N端半胱氨酸的位置,趨化因子可分為4種亞型:CXC、CC、C或CX3C。CXC受體2(CXCR2)屬于CXCR家族,是CXC趨化因子的主要受體,在中性粒細(xì)胞上的表達(dá)量最高[4]。由于對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化作用,CXCR2與炎癥性疾病密切相關(guān)。通過抑制CXCR2可以減輕小鼠急性胰腺炎[5]、環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠出血性膀胱炎[6]、小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎[7]等。同樣的,在關(guān)節(jié)炎小鼠模型中,也發(fā)現(xiàn)CXCR2-/-小鼠關(guān)節(jié)炎癥、滑膜厚度及關(guān)節(jié)破壞程度均較WT小鼠減輕。提示CXCR2是BLT1(LTB4受體)對(duì)中性粒細(xì)胞招募的關(guān)鍵下游受體之一[8]。因此,我們推測CXCR2是痛風(fēng)急性炎癥過程中趨化中性粒細(xì)胞的關(guān)鍵受體之一，通過抑制CXCR2有望可以迅速減少中性粒細(xì)胞浸潤,控制關(guān)節(jié)炎癥,起到治療作用。通過此研究我們希望探索痛風(fēng)急性炎癥治療的新靶點(diǎn),為今后藥物研究提供新思路。

材料與方法

1.材料：21只C57BL/6雄性小鼠購自杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司,鼠齡均為6～8周,體質(zhì)量約18～22 g,SPF級(jí)。

2.方法

(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理：21只小鼠飼養(yǎng)于我院中心試驗(yàn)室,隨機(jī)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及單鈉尿酸鹽(MSU)+SB225002干預(yù)組。小鼠急性痛風(fēng)足掌模型分組：小鼠編號(hào)、稱重,按隨機(jī)數(shù)字表將12只6～8周齡的C57BL/6雄性小鼠分為上述3組(每組4只),對(duì)照組雙側(cè)足掌部注射生理鹽水,實(shí)驗(yàn)組制作小鼠急性痛風(fēng)足掌模型,干預(yù)組在制作小鼠痛風(fēng)足掌模型同時(shí)腹腔注射CXCR2抑制劑SB225002 50 μg。小鼠急性痛風(fēng)腹腔模型分組：小鼠編號(hào)、稱重,按隨機(jī)數(shù)字表將9只雄性C57BL/6小鼠,隨機(jī)分為上述3組(每組3只),對(duì)照組腹腔注射生理鹽水,實(shí)驗(yàn)組制作小鼠急性痛風(fēng)腹腔模型,干預(yù)組在制作小鼠急性痛風(fēng)腹腔模型同時(shí)注射CXCR2抑制劑SB225002 50 μg。

(2)小鼠足掌痛風(fēng)炎癥模型的建立：每只小鼠左側(cè)后足掌部注射生理鹽水,右側(cè)后足掌部注射MSU晶體混懸液50 μl(20 mg/ml),于炎癥高峰期8 h處死小鼠。游標(biāo)卡尺測小鼠雙側(cè)足掌腫脹度(右后足掌厚度/左后足掌厚度)；小鼠足掌采用10%福爾馬林固定,石蠟包埋切片行蘇木素-伊紅(HE)染色以評(píng)估小鼠關(guān)節(jié)炎癥程度。

(3)小鼠急性痛風(fēng)腹腔模型的建立：采用MSU 3 mg/0.5 ml腹腔注射進(jìn)行造模,均于MSU注射4 h后(炎癥最高峰)處死小鼠,行腹腔灌洗,取腹腔液并離心收集腹腔細(xì)胞和腹腔上清液。

(4)CXCR2抑制劑干預(yù)：按照說明書,依次將2%二甲基亞砜(DMSO)+30%聚乙二醇300(PEG300)+5%吐溫80(Tween 80)+雙蒸水(ddH2O)加入產(chǎn)品SB225002中,得到可以對(duì)小鼠腹腔注射的復(fù)合物,以50 μg：200 μl濃度腹腔注射。

(5)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測足掌組織白細(xì)胞介素(IL)-1β水平：取小鼠右后足掌,加裂解液,組織勻漿,提取總蛋白,使用BCA系統(tǒng)進(jìn)行蛋白初定量,利用BCA蛋白定量結(jié)果,均一化所有樣本總蛋白濃度至3 mg/ml,常規(guī)方法轉(zhuǎn)模,分別加入抗鼠IL-1β抗體、抗鼠GAPDH抗體,孵育后漂洗,加入抗兔IgG-HRP,孵育后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色,用Image J圖像軟件讀取條帶灰度值,并計(jì)算相關(guān)數(shù)據(jù)。

(6)流式細(xì)胞術(shù)檢測腹腔液中性粒細(xì)胞數(shù)量及密度：收集腹腔灌洗液離心沉淀,采用F4/80-PerCP CY5.5和Ly6G-PE抗體標(biāo)記中性粒細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,Ly6GhighF4/80-細(xì)胞群即為中性粒細(xì)胞,收集樣品體積,根據(jù)Ly6G+F4/80-細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞流式儀上樣檢測的液體體積計(jì)算密度。

(7)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測腹腔液中IL-1β及趨化因子水平變化：將前述留取的腹腔灌洗液,按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測腹腔液中細(xì)胞因子水平。

結(jié) 果

1.急性痛風(fēng)足掌模型3組小鼠右/左后足掌厚度比值、關(guān)節(jié)炎癥程度及足掌組織IL-1β水平比較：0 h時(shí),3組小鼠右/左后足掌厚度比值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。8 h時(shí),實(shí)驗(yàn)組小鼠右/左后足掌厚度比值高于對(duì)照組,干預(yù)組低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。見表1。與對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組小鼠足掌關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤程度明顯增加；與實(shí)驗(yàn)組比較,干預(yù)組小鼠足掌關(guān)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤程度明顯下降,見圖1。實(shí)驗(yàn)組(0.773)足掌組織IL-1β水平高于對(duì)照組(0.042),干預(yù)組(0.595)低于實(shí)驗(yàn)組。

圖1 急性痛風(fēng)足掌模型3組小鼠足掌病理檢查結(jié)果(HE染色,×1)

表1 急性痛風(fēng)足掌模型3組小鼠右/左后足掌厚度比值比較

2.急性痛風(fēng)腹腔模型3組小鼠腹腔灌洗液中中性粒細(xì)胞密度和比例比較：實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔灌洗液中中性粒細(xì)胞密度和比例均高于對(duì)照組,干預(yù)組上述指標(biāo)均低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.001或P<0.05),見表2。

表2 急性痛風(fēng)腹腔模型3組小鼠腹腔灌洗液中中性粒細(xì)胞密度和比例比較

3.急性痛風(fēng)腹腔模型3組小鼠腹腔灌洗液中IL-1β及趨化因子水平比較：實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔灌洗液中IL-1β、CXCL1、CXCL2、CXCL8水平均高于對(duì)照組,干預(yù)組小鼠腹腔灌洗液中CXCL1、CXCL2、CXCL8水平均低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05),而干預(yù)組和實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔灌洗液中IL-1β水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 急性痛風(fēng)腹腔模型3組小鼠腹腔灌洗液中IL-1β及趨化因子水平比較

討 論

早在1991年就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)患者關(guān)節(jié)滑液中CXCL8(即IL-8)明顯升高[9]。CXCL8是一種趨化因子,屬于CXC家族。在IL-1、TNF等作用下可誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞等合成分泌CXCL8,可特異性趨化中性粒細(xì)胞進(jìn)入炎癥組織,發(fā)揮炎癥作用。目前研究表明,急性痛風(fēng)患者血清中可檢測到炎癥因子如IL-1β、IL-6及CXCL8水平升高[10]。提純后的中性粒細(xì)胞經(jīng)過MSU刺激與單核細(xì)胞共培養(yǎng)后同樣也會(huì)出現(xiàn)IL-1β、CXCL8、IL-6和TNF-α水平升高[11]。而正如前文所述,作為CXCL8對(duì)應(yīng)的受體CXCR2,已經(jīng)在多種涉及中性粒細(xì)胞的研究中被發(fā)現(xiàn)可減輕中性粒細(xì)胞引起的急性炎癥反應(yīng)。

SB2250002是一種強(qiáng)效的選擇性CXCR2拮抗劑,可以抑制IL-8與CXCR2的結(jié)合。為了探討CXCR2拮抗劑對(duì)痛風(fēng)急性炎癥的影響,我們采用小鼠痛風(fēng)足掌模型進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),應(yīng)用CXCR2拮抗劑SB225002干預(yù)后可以減輕痛風(fēng)小鼠模型足掌的腫脹程度,減少炎癥細(xì)胞的浸潤,下調(diào)IL-1β在足掌組織中的表達(dá)。為了更好地研究局部炎癥因子及趨化因子水平,我們采用小鼠痛風(fēng)腹腔模型再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí),應(yīng)用CXCR2拮抗劑SB225002干預(yù)后可以減少腹腔灌洗液中中性粒細(xì)胞的比例及密度。CXCR2作為治療急性痛風(fēng)的靶點(diǎn)具有較大的潛力，目前CXCR2的已知配體有CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7和CXCL8[12]。為了研究CXCR2抑制劑干預(yù)對(duì)局部炎癥水平及趨化因子的影響,我們?nèi)「骨还嘞匆哼M(jìn)行了IL-1β、CXCL1、CXCL2、CXCL8檢測。MSU刺激單核巨噬細(xì)胞分泌CXCL8,與CXCR2結(jié)合,刺激趨化因子CXCL1、CXCL2、CXCL8分泌,進(jìn)一步召集中性粒細(xì)胞趨化至炎癥部位,擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用CXCR2抑制劑拮抗CXCR2后,減少了CXCL1、CXCL2、CXCL8的分泌,從而減少了中性粒細(xì)胞趨化。這些數(shù)據(jù)表明,抑制CXCR2可以減輕MSU導(dǎo)致的局部炎癥。此外,在小鼠急性痛風(fēng)足掌模型干預(yù)實(shí)驗(yàn)中,抑制CXCR2下調(diào)了IL-1β表達(dá),但腹腔模型干預(yù)實(shí)驗(yàn)中腹腔灌洗液中IL-1β水平雖有下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,考慮可能與干預(yù)時(shí)間較短有關(guān),擬在下一步試驗(yàn)中增加不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)的探索,以期判斷更好的干預(yù)點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用兩種動(dòng)物模型對(duì)CXCR2抑制劑在痛風(fēng)急性炎癥中的抑制作用進(jìn)行驗(yàn)證,探討了干預(yù)CXCR2靶點(diǎn)在小鼠急性痛風(fēng)模型中的抑炎作用,并創(chuàng)新通過流式細(xì)胞儀檢測中性粒細(xì)胞密度及比例來闡述中性粒細(xì)胞的局部浸潤效果。CXCR2除了在急性炎癥性疾病扮演重要角色外,可能在慢性疾病中也有作用。既往研究動(dòng)脈粥樣硬化的報(bào)道表明,部分CXCR2在慢性炎癥的環(huán)境中可能由巨噬細(xì)胞表達(dá)[13]。我們不能排除中性粒細(xì)胞浸潤時(shí),少數(shù)組織駐留的巨噬細(xì)胞在介導(dǎo)慢性效應(yīng)中發(fā)揮作用的可能性。另外CXCR2信號(hào)通路在外周炎癥和神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的病理性疼痛狀態(tài)中均可發(fā)揮作用[14]。CXCR2阻斷可顯著減少機(jī)械性痛覺過敏和減輕炎癥性痛覺過度[15]，可能對(duì)于慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的控制有所幫助。因此,在下一步試驗(yàn)中,我們還將探索CXCR2在慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用,以期待未來CXCR2靶點(diǎn)在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療作用。