基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的大果木姜子油治療心力衰竭作用機(jī)制研究

陳向云，湯小芳，李 軍，黃朝霞，楊桃梅，楊長(zhǎng)福，李堯鋒*

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥民族藥資源研究院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

心力衰竭(Heart failure，HF)是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率較高的主要臨床問題，其特征是心室收縮和/或舒張功能受損，其臨床癥狀表現(xiàn)為呼吸困難、乏力、水腫、心悸心慌等，是多種心血管疾病的終末期表現(xiàn)[1]。HF常反復(fù)發(fā)作，病死率高，治療難度大。近年來(lái)，HF在全球范圍內(nèi)日益普遍，且發(fā)病率逐年升高，是人類極為關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一。HF發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)過(guò)度激活、心肌能量供應(yīng)不足或能量代謝障礙等與之有關(guān)[1-2]。

中醫(yī)藥在防治心力衰竭上積累了豐富經(jīng)驗(yàn)，現(xiàn)代中醫(yī)家根據(jù)HF臨床表現(xiàn)將其歸屬于“喘證”“心悸”“心痹”“胸痹”等范疇，認(rèn)為心氣不足、氣滯血瘀是心力衰竭的主要病理基礎(chǔ)[3-6]。大果木姜子(CinnamomummigaoH.W.Li)，又稱苗藥米槁，是貴州苗族民間的常用藥材，其性溫，味辛，無(wú)毒，具有溫中散寒、理氣止痛、祛濕、行氣的功能。大果木姜子及其水蒸汽法蒸餾得到的大果木姜子油收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大果木姜子油可減少心肌耗氧量，增加心肌供氧，抗心律失常，改善急性心肌缺血和心房顫動(dòng)癥狀[8-10]。近年來(lái)，以大果木姜子油為主要成分開發(fā)的新藥，如理氣活血滴丸、心腦寧膠囊、心胃止痛膠囊，為貴州省民族藥重要產(chǎn)品，其在防治心血管疾病領(lǐng)域中的應(yīng)用尤為突出，大果木姜子油應(yīng)用前景廣闊。因此，深入研究大果木姜子油在心血管疾病防治中的作用機(jī)制，將為其推廣應(yīng)用提供有力支撐。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可系統(tǒng)分析中藥療效成分及作用機(jī)制，可為中藥防治疾病提供潛在靶點(diǎn)分析[11]，利用該方法可清晰呈現(xiàn)大果木姜子油藥效作用機(jī)制。因此，本研究首先利用異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)復(fù)制HF大鼠模型，通過(guò)動(dòng)物藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)明確大果木姜子油的療效；然后利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)大果木姜子油治療心力衰竭的有效成分及作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步揭示其作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用和藥物開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2014-0010)。大鼠飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房(溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～65%，明暗相間各12 h)。

1.1.2 藥物 大果木姜子油(由貴州益佰制藥股份有限公司提供，批號(hào)：180428，按照中國(guó)發(fā)明專利(專利號(hào)：2013105216915)，采用水蒸氣蒸餾法獲得大果木姜子油，1 mL大果木姜子油含生藥材32.2 g)。鹽酸異丙基腎上腺素(ISO，美國(guó)SIGMA公司，5 g in poly btl，批號(hào)：I5627)；馬來(lái)酸依那普利片(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇制藥股份有限公司，規(guī)格：10 mg/片，批號(hào)：20180111)。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠腦鈉肽(Brain natriuretic peptide，BNP)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)：EL-R0126c)；蘇木素伊紅(Hematoxylin-Eosin staining，HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20180312)。

BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和HX-101E動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)；Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；EG1150H石蠟包埋機(jī)、RM2235病理切片機(jī)、HI1210攤片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；BX53正置顯微鏡(奧林巴斯(中國(guó))有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 先將SD大鼠隨機(jī)分為兩組：正常組10只，模型組70只；正常組注射等量的0.9%生理鹽水，模型組皮下注射ISO(5 mg/kg，每天1次，連續(xù)給藥7 d)建立心力衰竭大鼠模型，28 d后，模型組大鼠血清BNP 水平與正常組相比顯著升高，說(shuō)明造模成功[12]。然后將造模成功大鼠分為7組，分別是HF組、Tween-80組、Migao-25組(25 μL/kg)、Migao-50組(50 μL/kg)、Migao-100組(100 μL/kg)、Migao-120組(120 μL/kg)、依那普利組(20 mg/kg)。

1.2.2 給藥方法 用5% Tween-80水溶液作為助溶劑，加入大果木姜子油，超聲破碎儀處理10 min，配制成分別含2.5、5、10、12 μL/mL的大果木姜子油溶液，存儲(chǔ)于4 ℃待用。正常組、HF組大鼠灌胃等容積蒸餾水，Tween-80組大鼠灌胃5% Tween-80的水溶液，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)給藥治療28 d。

1.2.3 血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè) 稱量大鼠體質(zhì)量，采用25%烏拉坦腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，頭頸部自然伸直，消毒備皮后，沿頸正中線切開皮膚，做氣管插管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)。然后采用鈍性分離的方法分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈。靜脈留置針預(yù)充含肝素的生理鹽水(含肝素500 U/mL)，將靜脈留置針一端沿大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈向心方向插管進(jìn)入左心室，靜脈留置針另一端接入壓力換能器。待大鼠呼吸正常后，壓力換能器與BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)相連，記錄大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)：左心室收縮壓(LVSP)、左心室終末舒張壓(LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dp/dtmax)。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)血清BNP含量 大鼠頸總動(dòng)脈取血，血液室溫靜置15 min后，于4 ℃離心20 min(2 500 r/min)。收集上清，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定大鼠血清BNP水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書步驟操作。

1.2.5 HE染色法觀察心肌組織形態(tài)學(xué)情況 取左心室，固定于4%多聚甲醛溶液中，24 h后流水緩慢沖洗去除留在組織上的固定液，經(jīng)梯度酒精脫水和二甲苯透明后，將標(biāo)本進(jìn)行浸蠟、包埋、切片、貼片、烘片，制成石蠟切片。石蠟切片放入蘇木精染色液中20 min，分化液分化5 s，自來(lái)水浸泡15 min，置于伊紅染色液中2 min，自來(lái)水沖洗，然后常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片后，正置顯微鏡下觀察。

1.2.6 大果木姜子油活性成分及作用靶點(diǎn)收集與篩選 根據(jù)趙立春等[13]報(bào)道的大果木姜子油鑒定出的化學(xué)成分，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TSMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中查找這些化學(xué)成分，按照Lipinski類藥五規(guī)則[14](MW<500Da，Hacc≤10，Hdon≤5，-230%對(duì)這些化學(xué)成分進(jìn)行篩選，獲得符合條件的大果木姜子油活性成分，并記錄其TCMSP ID。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中查找這些活性成分的作用靶點(diǎn)，經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。然后利用Cytoscape 3.7.1軟件(https：//cytoscape.org/)繪制大果木姜子油活性成分與作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.2.7 大果木姜子油治療心力衰竭候選靶點(diǎn)篩選 以“Heart failure”為關(guān)鍵詞，在比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(CTD，http：//ctdbase.org/)和Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//go.drugbank.com/)中獲取疾病的關(guān)鍵基因或靶標(biāo)，在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇標(biāo)記為M(Marker/Mechanism)或 T (Therapeutic)的基因，這些基因與疾病有明確的關(guān)聯(lián)，為疾病治療靶標(biāo)或標(biāo)志物。將疾病治療靶點(diǎn)與大果木姜子油活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行Venn分析(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，找出共有基因，作為大果木姜子油治療心力衰竭候選靶點(diǎn)。

1.2.8 分子對(duì)接 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中下載大果木姜子油活性成分的mol2結(jié)構(gòu)，建立小分子配體結(jié)構(gòu)庫(kù)。在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載大果木姜子油治療心力衰竭候選靶點(diǎn)蛋白的三維結(jié)構(gòu)，保存為pdb格式，作為受體庫(kù)。采用SYBYL?-X 2.1.1軟件(Tripos Inc.，USA)對(duì)小分子進(jìn)行分子力學(xué)優(yōu)化，配體優(yōu)化過(guò)程基于Tripos力場(chǎng)Minimize 程序，加氫，加電荷，參數(shù)設(shè)置為：優(yōu)化次數(shù)設(shè)置為10 000、能量收斂標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為 0.005 kcal/mol·A、賦予Gasteiger-Hückel電荷，基于 Powell能量梯度法優(yōu)化得到最低能量構(gòu)象，以mol2格式文件保存，作為配體小分子用于對(duì)接。通過(guò)該軟件Surflex-Dock模塊進(jìn)行分子對(duì)接研究，以打分函數(shù)Total-Score為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)中藥成分與靶標(biāo)間相互作用，Total-Score>5表明小分子配體與蛋白有較好的結(jié)合活性，Total-Score值越大兩者結(jié)合活性越強(qiáng)[15]。

1.2.9 蛋白互作分析 為了分析作用靶點(diǎn)之間的關(guān)系，將靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//string-db.org/)中，分析蛋白互作關(guān)系，分析結(jié)果導(dǎo)出Excel格式，再導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.10 蛋白富集分析 使用在線工具DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)對(duì)大果木姜子油治療心力衰竭候選靶點(diǎn)進(jìn)行GO分子功能(GO-MF)和KEGG通路富集分析，以P<0.05作為顯著分析的臨界值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大果木姜子油對(duì)HF模型大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響

與正常組比較，HF組大鼠LVSP、±dp/dtmax均顯著降低，LVEDP顯著升高，表明HF組大鼠心肌舒縮功能下降，心衰大鼠模型建立已成功。與HF組大鼠比較，Tween-80組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)無(wú)變化；Migao-25組大鼠LVSP、±dp/dtmax升高，LVEDP降低，但差異不顯著；Migao-50、Migao-100、Migao-120組和依那普利組大鼠LVSP、±dp/dtmax顯著升高，LVEDP顯著降低，表明大果木姜子油可明顯改善HF模型大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，且呈劑量依賴性。見表1。

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)情況

2.2 大果木姜子油對(duì)HF模型大鼠血清BNP水平的影響

與正常組比較，HF組大鼠血清BNP水平顯著升高。與HF組大鼠比較，Tween-80組大鼠血清BNP水平基本無(wú)差異；Migao-25組大鼠血清BNP水平有所降低，但差異不顯著；Migao-50、Migao-100、Migao-120組和依那普利組大鼠血清BNP水平顯著降低，且呈劑量依賴性。結(jié)果見表1。

2.3 大果木姜子油對(duì)HF模型大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化的影響

由以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大果木姜子油100 μL/kg具有較好療效，將該藥物組大鼠與正常組、疾病模型組比較，進(jìn)行心肌組織形態(tài)學(xué)觀察。HE染色結(jié)果如圖1所示：正常組大鼠心臟被膜完整，心室肌輪廓清晰，心肌細(xì)胞排列整齊，心肌纖維連接緊密，胞核清晰，胞漿染色均勻，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；HF組和Tween-80組大鼠心肌細(xì)胞失去正常結(jié)構(gòu)形態(tài)，部分出現(xiàn)不同程度壞死，肌纖維斷裂、排列紊亂，部分肌纖維結(jié)構(gòu)疏松且腫大，周圍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及成纖維細(xì)胞增生。Migao-100組和依那普利組大鼠心臟被膜完整，心室肌輪廓較清晰，心肌纖維排列較整齊，未出現(xiàn)明顯壞死現(xiàn)象，炎細(xì)胞浸潤(rùn)及成纖維細(xì)胞增生明顯減輕。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果(bar=40 μm)

2.4 大果木姜子油活性成分篩選及作用靶點(diǎn)收集

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查找大果木姜子油的化學(xué)成分，同時(shí)符合OB>30%和Lipinski類藥五規(guī)則條件的作為活性成分，得到20個(gè)(見表2)。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中查找這20個(gè)活性成分的作用靶點(diǎn)，獲54個(gè)作用靶點(diǎn)，構(gòu)建大果木姜子油活性成分與作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)互作圖，其中共有74個(gè)節(jié)點(diǎn)，265個(gè)邊，節(jié)點(diǎn)代表活性成分或作用靶點(diǎn)，邊代表活性成分與作用靶點(diǎn)的互作關(guān)系(見圖2)。

表2 大果木姜子油活性成分基本信息

圖2 大果木姜子油活性成分與作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)互作

2.5 大果木姜子油治療HF作用靶點(diǎn)篩選

在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)和Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選獲得疾病治療靶點(diǎn)107個(gè)。大果木姜子油活性成分的54個(gè)作用靶點(diǎn)與這107個(gè)疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)經(jīng)Venn分析得到6個(gè)共同靶點(diǎn)(見圖3)，此共同靶點(diǎn)作為大果木姜子油治療HF的關(guān)鍵候選作用靶點(diǎn)。靶點(diǎn)具體信息見表3。

圖3 大果木姜子油活性成分作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)Venn圖

表3 大果木姜子油治療心力衰竭候選作用靶點(diǎn)信息

2.6 大果木姜子油治療心力衰竭候選作用靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

為了更好地闡釋和驗(yàn)證大果木姜子油活性成分與關(guān)鍵候選作用靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性，利用SYBYL-X 2.1.1軟件對(duì)活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接分析，發(fā)現(xiàn)除ADRA2C外其余候選靶點(diǎn)與活性成分(愈創(chuàng)醇、萜品烯-4-醇、沉香螺旋醇、芳樟醇、石竹烯氧化物、龍腦、檜烯)有較好結(jié)合活性，見表4。將有較好結(jié)合活性的活性成分和作用靶點(diǎn)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，見圖4A。

表4 大果木姜子油活性成分與作用靶點(diǎn)的分子對(duì)接分析結(jié)果

圖4 大果木姜子油活性成分-作用靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)(A)及作用靶點(diǎn)蛋白互作關(guān)系(B)

2.7 大果木姜子油治療心力衰竭作用靶點(diǎn)蛋白互作分析

為了進(jìn)一步探討大果木姜子油活性成分治療作用靶點(diǎn)間的互作關(guān)系，將這5個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白互作分析(見圖4B)，發(fā)現(xiàn)它們之間存在互作關(guān)系，其中PTGS2與4個(gè)蛋白存在互作關(guān)系，PTGS1、NOS2和NOS3各與3個(gè)蛋白存在互作關(guān)系，GSK3B與1個(gè)蛋白存在互作關(guān)系，表明大果木姜子油在治療心力衰竭上作用于一個(gè)特定的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中。

2.8 大果木姜子油治療心力衰竭作用靶點(diǎn)GO分子功能和KEGG通路分析

使用DAVID在線工具進(jìn)行GO-MF和KEGG通路富集分析(P<0.05)，GO分子功能條目有血紅素結(jié)合、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶活性、一氧化氮合酶活性等(見表5)，KEGG通路分析得到這些靶點(diǎn)與精氨酸生物合成、代謝通路、精氨酸和脯氨酸代謝等有關(guān)(見表6)。

表5 GO分子功能注釋

表6 KEGG通路富集分析

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合了計(jì)算機(jī)科學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、蛋白組學(xué)及藥理學(xué)等多個(gè)學(xué)科成果，從整體觀認(rèn)識(shí)藥物與機(jī)體的作用關(guān)系，與中醫(yī)整體觀、辨證論治原則一致，為中醫(yī)藥防治疾病的現(xiàn)代化研究提供了新思路。大果木姜子油在防治心肌缺血和心房顫動(dòng)方面療效顯著，但對(duì)其治療心力衰竭鮮有報(bào)道。本研究首先從動(dòng)物藥理學(xué)證實(shí)了大果木姜子油對(duì)心力衰竭的治療效果，后利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示了大果木姜子油治療心力衰竭的作用機(jī)制。

BNP是心臟神經(jīng)內(nèi)分泌激素，是評(píng)價(jià)心室功能障礙的重要標(biāo)記物，為臨床診斷、判斷心力衰竭嚴(yán)重程度的敏感指標(biāo)；血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)也可反映左心室功能不全情況。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大果木姜子油(50、100和120 μL/kg)可顯著升高ISO致心力衰竭模型大鼠的LVSP和±dp/dtmax、降低LVEDP，改善血流動(dòng)力學(xué)紊亂，并降低模型大鼠血清BNP水平；大果木姜子油治療模型大鼠的最適給藥濃度為100 μL/kg，若按生藥材量為3.22 g/kg，為后期研究奠定了基礎(chǔ)；大果木姜子油(100 μL/kg)可顯著改善模型大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化，這些結(jié)果表明，大果木姜子油可改善ISO所致心力衰竭大鼠的心臟功能障礙。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究發(fā)現(xiàn)，大果木姜子油治療心力衰竭共有7個(gè)活性成分，分別是愈創(chuàng)醇、萜品烯-4-醇、沉香螺旋醇、芳樟醇、石竹烯氧化物、龍腦、檜烯。這些大果木姜子油活性成分作用于一個(gè)特定的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)蛋白與調(diào)節(jié)前列腺素和一氧化氮代謝有關(guān)，進(jìn)而也與心力衰竭疾病調(diào)控機(jī)制有關(guān)。PTGS1和PTGS2是兩種不同的同工酶，介導(dǎo)花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素(Prostaglandin，PG)，是PG合成的重要一步。PTGS1是組成性表達(dá)的，主要參與體內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡；PTGS2是可誘導(dǎo)的，通常產(chǎn)生前列腺素類物質(zhì)，介導(dǎo)對(duì)諸如感染和炎癥等生理應(yīng)激的反應(yīng)[16-17]。哺乳動(dòng)物基因Ptgs1、Ptgs2分別編碼COX-1(Cyclooxygenase-1)、COX-2(Cyclooxygenase-2)，COX-1和COX-2分別是PTGS1和PTGS2的別稱[18]。在剪切應(yīng)力、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和凝血酶的作用下，內(nèi)皮細(xì)胞中COX-1表達(dá)增加。COX-1參與血小板中血栓素A2的合成，血栓素A2介導(dǎo)血小板聚集和血管收縮[19]。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2在心力衰竭患者心肌的纖維瘢痕部位有豐富表達(dá)，提示其與心衰過(guò)程中炎癥反應(yīng)及瘢痕形成有關(guān)[20]。COX-2誘導(dǎo)的前列腺素可抑制心肌損傷，PGI2是心臟缺血預(yù)處理后COX-2的主要產(chǎn)物，PGI2對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用[21-23]。藥物研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)COX-2表達(dá)，可改善左心功能，減輕心肌纖維化[24]；抑制COX-2可增加有心血管疾病或左心室損傷病史患者的心力衰竭癥狀發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[25-26]。一氧化氮合酶在NO信號(hào)中尤為重要，心力衰竭時(shí)NO生物利用度降低，這是NOS功能障礙的結(jié)果，其后果是收縮功能障礙、肥厚和不利的重構(gòu)，因此一氧化氮合酶功能的改變是心力衰竭綜合征的一個(gè)主要因素。NOS的功能障礙存在于心力衰竭等多種心臟疾病中，可導(dǎo)致心肌收縮功能障礙、不良重塑和肥大，在心力衰竭疾病中，已發(fā)現(xiàn)NOS2的表達(dá)與心肌收縮功能障礙和病理性肥大有關(guān)[27-29]。因此，在HF防治中，特異性抑制NOS2是一種值得關(guān)注的治療方法。但在HF中，NOS3的表達(dá)水平減少，NOS3活性的降低減少了NO產(chǎn)生，這對(duì)衰竭的心臟有著極大危害。研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后，NOS3基因敲除小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的心室重構(gòu)、肥厚和收縮功能障礙[30]；心肌細(xì)胞靶向的NOS3表達(dá)挽救了壓力超負(fù)荷后的左室重構(gòu)[31]。此外，在患有心力衰竭肺動(dòng)脈高壓的患者中發(fā)現(xiàn)，NOS3多態(tài)性與跨肺壓力梯度相關(guān)，且可能與平均肺動(dòng)脈壓和舒張期肺動(dòng)脈壓差相關(guān)[32]。GSK-3是心肌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡調(diào)節(jié)的重要因子，參與心臟的多個(gè)病理過(guò)程，它的去調(diào)節(jié)可導(dǎo)致嚴(yán)重的收縮與舒張功能障礙及進(jìn)展性心力衰竭[33]。研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭期間GSK-3的下調(diào)可能是補(bǔ)償性的，對(duì)GSK-3的持續(xù)抑制可引起代償性肥大，抑制細(xì)胞凋亡和纖維化，并增加心臟收縮力，且GSK-3抑制的抗凋亡作用是由髓細(xì)胞白血病因子1介導(dǎo)的[34]。研究還發(fā)現(xiàn)，COX-2可調(diào)控GSK-3的磷酸化[35-37]。由以上文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，這些治療靶點(diǎn)與前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶活性和一氧化氮合酶活性有關(guān)，與GO分子功能注釋和KEGG通路分析一致。

綜上，本課題從動(dòng)物藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大果木姜子油可改善心力衰竭大鼠的血流動(dòng)力學(xué)紊亂、降低BNP水平、改善心肌組織形態(tài)學(xué)變化；利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析了大果木姜子油治療心力衰竭的作用及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了大果木姜子油治療心力衰竭的靶點(diǎn)集中于一個(gè)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，其與前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶活性和一氧化氮合酶活性有關(guān)，這些結(jié)果為今后深入研究大果木姜子油治療心力衰竭的作用機(jī)制提供了依據(jù)。