基于細(xì)胞焦亡NF-κB信號(hào)通路探討黃連解毒湯干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用機(jī)制

劉永瑞，唐 娜，王 林，葉伯鑫，劉 南

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生的主要因素，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊主要分布于由內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和其他血管細(xì)胞組成的大、中型血管[1]。炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而促炎因子水平被認(rèn)為是重要的預(yù)后因素，與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程明顯相關(guān)[2-3]。研究表明，細(xì)胞焦亡(Caspase-1依賴型細(xì)胞死亡)參與了多種疾病的病理生理過(guò)程，其本質(zhì)為慢性炎癥[4]。炎性小體為炎癥通路的重要組成部分，其可通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路激活Caspase-1導(dǎo)致細(xì)胞焦亡[5]，并刺激促炎細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子-α等)的成熟和分泌，有望成為動(dòng)脈粥樣硬化的有效治療靶點(diǎn)。黃連解毒湯為清熱解毒的代表方，以黃連為君，清熱瀉火解毒，清心火及中焦之火；以黃芩為臣，清上焦之火及肺熱；以黃柏為佐，清下焦火熱；梔子為使，清瀉上中下三焦之火，四藥配伍，共奏清熱瀉火解毒之功。研究表明，黃連解毒湯具有抗菌抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗動(dòng)脈粥樣硬化[6-8]等多方面作用，但治療機(jī)制仍未完全明確。

本研究采用蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察新西蘭兔主動(dòng)脈斑塊情況，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)新西蘭兔血清炎性因子水平，免疫組化(IHC)法、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)法、蛋白免疫印跡(Western Blot)法評(píng)估細(xì)胞焦亡水平，從細(xì)胞焦亡角度評(píng)估黃連解毒湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性新西蘭兔60只，體質(zhì)量2.0～3.0 kg，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(粵)2019-0035。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)為：SCXK(粵)2018-0092。

1.1.2 試驗(yàn)藥物 黃連解毒湯由黃連9 g、黃芩6 g、黃柏6 g、梔子9 g組成，購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房，代煎后分裝，于冰箱中冷藏。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 細(xì)胞焦亡抑制劑VX-765(購(gòu)于MedChemExpress公司，No.HY-13205)，脂多糖(LPS)(購(gòu)于Sigma公司，No.L2880)，維生素D3注射液(購(gòu)于上海通用藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31021259)，C反應(yīng)蛋白(CRP)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(購(gòu)于Abcam公司，ab157726)，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(購(gòu)于Abcam公司，Ab273237)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(購(gòu)于武漢菲恩生物科技有限公司，ERB0126)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)ELISA試劑盒(購(gòu)于武漢菲恩生物科技有限公司，ERB0119)，白細(xì)胞介素-18(IL-18)ELISA試劑盒(購(gòu)于武漢菲恩生物科技有限公司，ERB0059)，RNA提取試劑盒(購(gòu)于Takara公司，9676)，預(yù)混SYBR?Green 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒(購(gòu)于Takara公司，RR820A)，IL-1β抗體(購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0812R)，IL-18抗體(購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-20159R)，Caspase-1抗體(購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，22915-1-AP)，NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)抗體(購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，19771-1-AP)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(購(gòu)于Abcam公司，ab6721)，二喹啉甲醇(BCA)試劑盒(購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0010)，p50抗體(購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-1194R)，p65抗體(購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0465R)，核因子kB抑制蛋白α(IkBα)抗體(購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-1287R)，β-actin抗體(購(gòu)于Abcam公司，ab8224)。

1.2 動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立與藥物干預(yù) 將雄性新西蘭兔隨機(jī)分為6組，即空白組、模型組、黃連解毒湯低劑量組、黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組、VX-765組，每組10只。采用高脂飼料[購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2019-05073]喂養(yǎng)聯(lián)合肌肉注射LPS(第4周、第8周、第12周，于新西蘭兔右側(cè)耳動(dòng)脈、頸動(dòng)脈和股淺動(dòng)脈旁注射LPS，每個(gè)部位肌內(nèi)注射1 μg)及腹腔注射維生素D3(喂養(yǎng)前一次性給藥2×105U/kg)的復(fù)合方法進(jìn)行造模。除空白組外，其余5組均給予復(fù)合方法進(jìn)行造模。從第8周開(kāi)始黃連解毒湯低劑量組、黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組分別給予黃連解毒湯每天0.75 g/kg、1.50 g/kg和3.00 g/kg灌胃，VX-765組給予氯喹[VX-765溶于二甲基亞砜(DMSO)溶液中]50 mg/kg腹腔注射，空白組與模型組每天給予等容生理鹽水灌胃，以上操作連續(xù)干預(yù)至16周末后，用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，采用腹主動(dòng)脈取血休克法處死新西蘭兔，分離主動(dòng)脈組織。

1.3 ELISA法檢測(cè)血清炎性因子水平 ELISA法檢測(cè)血清炎性因子CRP、IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-18水平，將所有試劑平衡至室溫18～25 ℃，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔、空白孔，并按說(shuō)明書(shū)要求分別加入相應(yīng)試劑，加上覆膜，37 ℃孵育1 h，按說(shuō)明書(shū)要求加相應(yīng)試劑并用酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.4 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察主動(dòng)脈組織斑塊情況 將從新西蘭兔分離的主動(dòng)脈組織置于石蠟包埋盒中，并于流水中沖洗3 h充分洗去組織表面甲醛。沖洗后將組織放入脫水機(jī)行梯度乙醇脫水與浸蠟。包埋后進(jìn)行組織切片脫蠟至水，蘇木素與伊紅染色，隨后行脫水透明，封片晾干。在顯微鏡下對(duì)主動(dòng)脈病變情況進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估。

1.5 細(xì)胞焦亡水平測(cè)評(píng)

1.5.1 RT-qPCR法檢測(cè)Caspase-1、NLRP3基因表達(dá) 采用RNA提取試劑盒(Takara，Ostu，Japan)按照說(shuō)明書(shū)步驟操作從新西蘭兔主動(dòng)脈組織中提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用預(yù)混SYBR?Green PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。特異性引物(見(jiàn)表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴(kuò)增條件為95 ℃作用30 s，95 ℃作用5 s(40個(gè)循環(huán))，60 ℃作用30 s，用相對(duì)定量的2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列(5′→3′)

1.5.2 IHC法檢測(cè)IL-1β、IL-18、Caspase-1、NLRP3表達(dá)水平 石蠟切片脫蠟至水，步驟同HE染色。將切片放入抗原修復(fù)盒中，置微波爐中92～99 ℃加熱1 min后冷卻至室溫，3%過(guò)氧化氫處理祛除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，5%山羊血清封閉30 min后滴加相應(yīng)一抗IL-1β(1∶500)、IL-18(1∶500)、Caspase-1(1∶200)，NLRP3(1∶200)，4 ℃過(guò)夜。復(fù)溫至室溫，滴加HRP山羊抗兔IgG(1∶1 000)孵育30 min。滴加3，3-N-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸(DAB)顯色液，顯色完成后放入水中終止，蘇木素染核，脫水透明，封片、晾干，顯微鏡下觀察拍照，采用Image-Pro Plus軟件分析。

1.5.3 Western Blot法檢測(cè)Caspase-1、NLRP3蛋白表達(dá)及 NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá) 從新西蘭兔主動(dòng)脈組織中提取的蛋白質(zhì)樣品，使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量后，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h后，用稀釋的Caspase-1(1∶1 000)、NLRP3(1∶1 000)、p50(1∶1 000)、p65(1∶1 000)、IkBα(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)一抗孵育4 ℃過(guò)夜。第2天取出并用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌后，在室溫下滴加HRP山羊抗兔IgG(1∶5 000)二抗孵育1 h。隨后，滴加顯影液在化學(xué)發(fā)光成像儀顯影，用Image J軟件分析條帶灰度值，確定各蛋白的相對(duì)比例。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清炎性因子水平比較 與空白組比較，模型組CRP、IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-18水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組、VX-765組CRP、IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-18水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與黃連解毒湯低、中劑量組比較，黃連解毒湯高劑量組、VX-765組CRP、IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-18水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且VX-765組較黃連解毒湯高劑量組IL-1β、IL-18下降更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組新西蘭兔血清炎性因子水平比較 (±s)

2.2 HE染色主動(dòng)脈斑塊情況 新西蘭兔主動(dòng)脈HE染色中模型組斑塊形成明顯，提示通過(guò)聯(lián)合喂養(yǎng)高脂飼料、肌肉注射LPS及腹腔注射維生素D3方法建立新西蘭兔動(dòng)脈粥樣硬化模型造模成功。HE染色結(jié)果顯示，黃連解毒湯各劑量組主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊較模型組減少，提示黃連解毒湯可以拮抗高脂等復(fù)合因素導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，發(fā)揮穩(wěn)定斑塊及延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的作用，且以黃連解毒湯高劑量組最為明顯，其效果與VX-765大致相當(dāng)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組新西蘭兔主動(dòng)脈HE染色(×2)

2.3 細(xì)胞焦亡水平

2.3.1 各組IL-1β、IL-18、Caspase-1、NLRP3表達(dá)水平比較 與空白組比較，模型組IL-1β表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組、VX-765組IL-1β表達(dá)水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與空白組比較，模型組IL-18表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯高劑量組、VX-765組IL-18表達(dá)水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與空白組比較，模型組Caspase-1表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯高劑量組、VX-765組Caspase-1表達(dá)水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與空白組比較，模型組NLRP3表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯低劑量組、黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組、VX-765組NLRP3表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 各組新西蘭兔主動(dòng)脈斑塊IHC染色后表達(dá)情況(×20)

模型組與空白組比較，＊ P<0.01；與模型組比較，# P<0.05，△ P<0.01。

2.3.2 各組Caspase-1、NLRP3基因表達(dá)水平比較 RT-qPCR結(jié)果提示，與空白組比較，模型組Caspase-1、NLRP3基因相對(duì)表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯低劑量組、黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組、VX-765組Caspase-1基因相對(duì)表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯高劑量組、VX-765組NLRP3基因相對(duì)表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)圖4。

模型組與空白組比較，＊ P<0.01；與模型組比較，# P<0.01。

2.3.3 各組Caspase-1、NLRP3蛋白表達(dá)水平比較 Western Blot結(jié)果提示，與空白組比較，模型組Caspase-1、NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯高劑量組、VX-765組Caspase-1、NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見(jiàn)圖5、圖6。

圖5 各組新西蘭兔主動(dòng)脈Caspase-1、NLRP3蛋白表達(dá)電泳圖

模型組與空白組比較，＊ P<0.01；與模型組比較，# P<0.01，△ P<0.01。

2.4 各組NF-κB通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 Western Blot結(jié)果提示，與空白組比較，模型組p50、p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯升高，IkBα蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯高劑量組、VX-765組p50蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯中劑量組、黃連解毒湯高劑量組、VX-765組p65蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，黃連解毒湯高劑量組、VX-765組IkBα蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖7、圖8。

圖7 各組NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)電泳圖

模型組與空白組比較，＊ P<0.01；與模型組比較，# P<0.05，△ P<0.01。

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生始于血管內(nèi)皮功能障礙，影響諸多病理生理過(guò)程如血管炎癥、血管張力、線粒體功能、氧化應(yīng)激等。其中，炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[9]，炎性細(xì)胞作為早期效應(yīng)分子，分泌促炎因子(IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β等)進(jìn)一步加速病變進(jìn)展，導(dǎo)致斑塊破裂、血栓形成，甚至發(fā)生急性冠脈綜合征[2]。研究表明，急性心肌梗死早期伴有血清TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β水平明顯增加，促炎因子的分泌直接影響梗死區(qū)心肌細(xì)胞的存活及凋亡[10]。IL-6與腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的相互作用被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的重要發(fā)病機(jī)制，可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能障礙[11]。在心肌梗死后期，炎性因子的持續(xù)增加促進(jìn)間質(zhì)纖維化和非梗死區(qū)膠原沉積，導(dǎo)致心室功能障礙[12]。炎性因子累積可誘導(dǎo)梗死區(qū)局部基質(zhì)金屬蛋白酶和利鈉肽表達(dá)，促進(jìn)心臟重構(gòu)[13]。促炎因子水平被認(rèn)為是重要的預(yù)后因素，與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程明顯相關(guān)。研究證明，IL-1β可通過(guò)調(diào)控單核細(xì)胞功能誘導(dǎo)IL-10水平升高，并減小動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積[14]。黃連解毒湯可通過(guò)降低動(dòng)脈粥樣硬化病人機(jī)體炎性因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α的表達(dá)水平，縮小動(dòng)脈血管內(nèi)中膜厚度和斑塊面積[8]。本研究通過(guò)構(gòu)建新西蘭兔動(dòng)脈粥樣硬化模型，評(píng)估黃連解毒湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化炎癥水平的影響。結(jié)果表明，黃連解毒湯具有明顯的抗炎作用，黃連解毒湯中、高劑量可降低兔血清炎性因子CRP、IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-18水平。

動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)多步驟過(guò)程，包括4個(gè)主要階段：內(nèi)皮損傷、泡沫細(xì)胞形成、血管平滑肌細(xì)胞增殖、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和破裂。同時(shí)，斑塊易損特征被證明與炎癥程度密切相關(guān)，抑制關(guān)鍵炎癥通路可減輕動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與進(jìn)展，并提高斑塊穩(wěn)定性，可能成為靶向性治療策略。研究表明，組蛋白去乙酰化酶9(histone deacetylase 9，HDAC9)可促進(jìn)血管系統(tǒng)的炎癥水平，并增強(qiáng)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的易損性，其促炎效應(yīng)可被選擇性炎癥通路抑制TMP195逆轉(zhuǎn)[15]。維生素E可通過(guò)炎癥信號(hào)通路調(diào)節(jié)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性[16]。帕瑞昔布通過(guò)抑制炎癥和基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性[17]。黃連解毒湯可調(diào)控腸道菌群抑制高脂飲食導(dǎo)致的小鼠非酒精性脂肪性肝病和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[7]。臨床數(shù)據(jù)表明，氧化應(yīng)激和炎癥是年齡相關(guān)心血管功能障礙的驅(qū)動(dòng)因素，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定和破裂中發(fā)揮重要作用[18]。本研究中，兔主動(dòng)脈HE染色結(jié)果顯示，黃連解毒湯各干預(yù)組主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊較模型組明顯減少，提示黃連解毒湯可以拮抗高脂等復(fù)合因素導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，發(fā)揮穩(wěn)定斑塊及延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的作用。

現(xiàn)階段，NLRP3為研究最廣泛的一類(lèi)炎性小體。動(dòng)脈粥樣硬化模型中NLRP3的主要成分(REF61)表達(dá)增加，抑制NLRP3炎性小體可降低載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變程度[19-20]。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)通過(guò)結(jié)合巨噬細(xì)胞表面的CD36/TLR4/TLR6信號(hào)復(fù)合物，隨后誘導(dǎo)膽固醇結(jié)晶致巨噬細(xì)胞溶酶體損傷導(dǎo)致NLRP3炎性小體的激活[21]。來(lái)源于巨噬細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞中的脂質(zhì)積累可在多個(gè)環(huán)節(jié)誘導(dǎo)多蛋白復(fù)合物炎性小體，通過(guò)效應(yīng)Caspase-1介導(dǎo)IL-1β和IL-18前體蛋白水解成為具有生物活性的IL-1β和IL-18釋放，激活下游炎癥通路并觸發(fā)細(xì)胞焦亡。外源性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)治療可明顯減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積并改善血脂，在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中均可降低焦亡蛋白表達(dá)[22]。溶血磷脂酰膽堿誘導(dǎo)NLRP3炎性小體介導(dǎo)的IL-1β分泌觸發(fā)焦亡，促使人單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞泡沫細(xì)胞形成[23]。黃連解毒湯可通過(guò)調(diào)控NLRP3炎性小體，降低小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型主動(dòng)脈組織中IL-1β、Caspase-1、NLRP3、TNF-α mRNA表達(dá)，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[24]。本研究使用細(xì)胞焦亡抑制劑VX-765進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果提示，抑制細(xì)胞焦亡可拮抗動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，并降低兔血清炎性因子CRP、IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-18水平，且與高劑量黃連解毒湯比較，VX-765組在降低炎性因子IL-18及IL-1β水平上具有更好的治療效應(yīng)。同時(shí)，高劑量黃連解毒湯與VX-765均可下調(diào)基因NLRP3、Caspase-1水平，并明顯降低焦亡蛋白IL-1β、IL-18、NLRP3、Caspase-1表達(dá)，二者無(wú)明顯差異，即黃連解毒湯可降低動(dòng)脈粥樣硬化細(xì)胞焦亡水平，并起到抗炎作用，其效應(yīng)與抑制劑VX-765相當(dāng)。

為明確黃連解毒湯抑制焦亡的分子機(jī)制，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了代表性NF-κB炎癥通路下游蛋白表達(dá)水平。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB具有調(diào)控活性氧(ROS)產(chǎn)生、心肌細(xì)胞的存活與凋亡和心肌收縮性等功能[25-27]。亞基p65/p50磷酸化對(duì)NF-κB信號(hào)通路具有雙向調(diào)節(jié)的作用，取決于所涉及的激酶及特定殘基類(lèi)型[28]。在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎的心肌梗死模型中，選擇性過(guò)表達(dá)IkBα抑制因子的轉(zhuǎn)基因小鼠生存率提高，心室重構(gòu)、心肌收縮功能及肺功能改善，并與NF-κB p65活化、細(xì)胞因子水平和凋亡水平降低密切相關(guān)[29]。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，黃連解毒湯可能通過(guò)NF-κB、MAPK、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、VEGF信號(hào)通路治療動(dòng)脈粥樣硬化[30]。結(jié)合本研究結(jié)果，高劑量黃連解毒湯可降低通路中p50、p65蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)IkBα蛋白降低趨勢(shì)，且與VX-765組無(wú)明顯差異，提示黃連解毒湯可調(diào)節(jié)NF-κB通路，該通路可能為黃連解毒湯發(fā)揮抗炎及抗焦亡作用的關(guān)鍵途徑。

本研究通過(guò)構(gòu)建新西蘭兔動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用HE染色觀察主動(dòng)脈斑塊情況，ELISA檢測(cè)炎性因子水平，IHC法、RT-qPCR法、Western Blot法從基因和蛋白水平評(píng)估細(xì)胞焦亡水平，較為全面地評(píng)估黃連解毒湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，黃連解毒湯可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞焦亡水平發(fā)揮穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及抗炎作用，可能通過(guò)介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，具體潛在分子機(jī)制需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。