超聲輔助酶法制備雞皮膠原蛋白的工藝優(yōu)化

魏沈芳，張順棠，劉昆侖*，段曉杰，高立棟

1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001 2.蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，河南 周口 466200

我國是肉雞生產(chǎn)和消費(fèi)大國，每年雞肉消費(fèi)量均在1 000萬t以上[1]，其中雞皮是主要副產(chǎn)物之一。大部分雞皮被用于飼料或低廉的肉糜制品中，產(chǎn)品附加值低。研究表明，畜禽皮中富含不飽和脂肪酸[2]，蛋白質(zhì)含量約為11%，其中85%為膠原蛋白(collagen)[3]，因此可將雞皮作為蛋白質(zhì)的優(yōu)質(zhì)來源。膠原蛋白是由3條α鏈通過肽鏈間的氫鍵相互右旋形成的三螺旋結(jié)構(gòu)[4-5]，穩(wěn)定性較高，分子量較大，占動(dòng)物體內(nèi)總蛋白的30%～35%[6-7]，這種特殊的三螺旋結(jié)構(gòu)能使骨、皮、肌腱、血管等組織器官具備較高的機(jī)械強(qiáng)度，以支撐器官、維護(hù)機(jī)體正常生理功能[5]，對細(xì)胞、組織乃至器官行使正常功能以及損傷部位修復(fù)有著重大的影響[8]。

目前提取膠原蛋白的方法有熱水浸提法、堿提法、酸提法、酶提法和復(fù)合提取法[6]。熱水浸提法主要應(yīng)用于魚皮中膠原蛋白的提取[9]，堿提法通常用于明膠的提取[10]，且這2種方法由于溫度、堿濃度等難以控制，易引起膠原蛋白的變性，從而失去生物活性[11]，因此很少應(yīng)用。酸提法是用乙酸、檸檬酸等將膠原蛋白溶出，維持膠原蛋白的三級結(jié)構(gòu)[12]，應(yīng)用廣泛，但是提取率較低[13]。酶提法是用胃蛋白酶限制性酶解膠原蛋白的端肽，使其更易溶出，且不破壞其特殊的三螺旋結(jié)構(gòu)[14-15]，該方法能顯著提高膠原蛋白的得率[14]。復(fù)合法是在前4種方法的基礎(chǔ)上，加以超聲波、脈沖等物理方法輔助提取。研究發(fā)現(xiàn)，超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械剪切力使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的基團(tuán)暴露出來[16-17]，促進(jìn)底物與酶的結(jié)合，故超聲波輔助法可以顯著提高膠原蛋白提取率，而且能改善其流變和功能特性[18]。如李根等[19]以鯢皮為原料，采用超聲輔助酶法提取膠原蛋白，發(fā)現(xiàn)超聲波輔助后提取率從17.56%提升至37.36%，且不會(huì)影響膠原蛋白特有的三螺旋結(jié)構(gòu)；Ali等[20]以鯉魚皮為原料，比較了酸提、酶提以及加入超聲輔助對膠原蛋白的提取率與理化性質(zhì)的影響，研究發(fā)現(xiàn)，在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行超聲波處理，可以有效提高酸提和酶提的效率，且不影響膠原蛋白的理化性質(zhì)；Petcharat等[21]以小丑魚皮為原料提取膠原蛋白，發(fā)現(xiàn)超聲輔助法能顯著提高蛋白得率，且超聲對分子結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生不利影響。目前，超聲波輔助法多用于提取水產(chǎn)動(dòng)物副產(chǎn)物中的膠原蛋白，對畜禽類動(dòng)物提取膠原蛋白的研究較少，且超聲對其物化性質(zhì)影響的研究不足。

作者以雞皮為原材料，在低強(qiáng)度超聲波的輔助作用下，采用酶法提取雞皮中的膠原蛋白，并考察提取過程中各因素對膠原蛋白得率的影響，采用JMP軟件定制試驗(yàn)，建立預(yù)測模型，優(yōu)化提取工藝，以期為雞皮膠原蛋白生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雞皮購于當(dāng)?shù)厥袌?，洗凈，除去表面水分后，粉碎成約2 cm×2 cm的小塊，-20 ℃凍藏備用。

羥脯氨酸含量檢測試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；胃蛋白酶：上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鈉(粒)、正己烷、硼酸、硫酸鉀、硫酸銅、氯化鈉、溴甲酚綠、甲基紅、冰乙酸：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WBL-2501A攪拌機(jī)：美的集團(tuán)股份有限公司；JY92-ⅡN超聲波細(xì)胞粉碎儀：新芝生物科技有限公司；YA1072透析袋(分子量8 000～14 000)：北京索萊寶科技有限公司；Kjeltec 8400全自動(dòng)定氮儀：福斯分析儀器公司；GL-10000C冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

采用超聲輔助酶法從雞皮中提取膠原蛋白，具體工藝流程如下。

雞皮→預(yù)處理(剪切、脫脂、去除雜蛋白)→清洗→酸溶脹→打漿→超聲波處理→酶解→鹽析→純化→凍干→膠原蛋白。

1.3.1.1 預(yù)處理

將新鮮的雞皮洗凈，并用粉碎機(jī)粉碎成約2 cm×2 cm的小塊，按質(zhì)量比1∶ 2加入正己烷浸泡脫脂(振蕩攪拌3 h，隔1 h換1次液)；按質(zhì)量比1∶ 10加入0.05 g/100 mL NaCl溶液混合攪拌6 h以去除雜蛋白(每3 h換1次液)，并用蒸餾水洗滌3次。以上操作均在低溫下進(jìn)行，并在-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 酸浸泡、打漿

取一定量預(yù)處理后的雞皮，按1∶ 20 g/mL加入0.5 mol/L乙酸，4 ℃浸泡過夜，待原料溶脹均勻后打碎成糊狀，使其充分混勻攪碎。

1.3.1.3 超聲波輔助酶法提取

向打碎的雞皮中繼續(xù)添加20倍體積的乙酸(即最終加入的乙酸總體積為雞皮質(zhì)量的40倍)，攪拌成均勻的漿液后進(jìn)行超聲波處理(冰浴)。向超聲處理后的雞皮漿液中加入胃蛋白酶(15 000 U/g)，調(diào)節(jié)pH值至2.0左右，在4 ℃下攪拌6 h后，以10 000 r/min離心30 min分離上清液和沉淀，上清液即雞皮膠原蛋白提取液。以上操作均在低溫下進(jìn)行。

1.3.1.4 中和、鹽析

用濃NaOH溶液調(diào)節(jié)雞皮膠原蛋白提取液pH值至7.0～8.0，攪拌并緩慢加入NaCl至濃度為1 mol/L，靜置鹽析直至出現(xiàn)白色絮狀物沉淀后離心(5 000 r/min，20 min)，取沉淀，即得膠原蛋白粗提物。以上操作均在低溫下進(jìn)行。

1.3.1.5 純化、凍干

將上述沉淀充分溶解于0.5 mol/L乙酸中，完全溶解后灌入透析袋(分子截留量8 000～14 000 Da)，0.1 mol/L乙酸為透析液透析24 h(每8 h換1次液)，再用蒸餾水透析24 h(每8 h換1次液)，經(jīng)凍干得到膠原蛋白。以上操作均在低溫下進(jìn)行。

1.3.2 指標(biāo)測定

1.3.2.1 雞皮基本成分的測定

水分的測定：參照GB/T 5009.3—2016 直接干燥法；灰分的測定：參照GB/T 5009.4—2016 食品中總灰分的測定；粗脂肪的測定：參照GB/T 5009.6—2016 索氏抽提法；總蛋白的測定：參照GB/T 5009.5—2016 凱氏定氮法。

膠原蛋白含量的測定：用羥脯氨酸試劑盒(可見分光光度法)測定。膠原蛋白的含量可由L-羥脯氨酸(膠原蛋白的特征氨基酸)含量乘以換算系數(shù)得到[19]。以吸光值為縱坐標(biāo)，羥脯氨酸含量為橫坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.005x+0.017 2，R2=0.995。通常，羥脯氨酸的含量占14%左右，陸生動(dòng)物常用7.1為換算系數(shù)[22]。膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)=羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)×7.1。

1.3.2.2 膠原蛋白提取率

1.3.3 提取工藝優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)條件為料液比1∶ 40 g/mL、酶用量1.0%、超聲波輸出功率130 W、超聲時(shí)間(持續(xù)2 s，間歇2 s)2 min、酶解時(shí)間6 h?？疾炝弦罕?1∶ 40、1∶ 60、1∶ 80、1∶ 100、1∶ 120 g/mL)、胃蛋白酶添加量(0.5%、1%、1.5%、2.0%、2.5%)、超聲功率(65、130、195、260、325 W)、超聲時(shí)間(2、10、18、26、34 min)4個(gè)因素對膠原蛋白提取率的影響。

1.3.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在以上單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以料液比(X1)、加酶量(X2)、超聲功率(X3)、超聲時(shí)間(X4)為自變量，-1、0、1為3個(gè)水平，提取率(Y)為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，應(yīng)用JMP 14.0 設(shè)計(jì)試驗(yàn)及分析結(jié)果，利用Origin 2018 繪制響應(yīng)面3D曲面圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞皮基本成分

雞皮的基本成分含量見表1。

表1 雞皮基本成分Table 1 Basic composition of chicken skin

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 料液比的影響

雞皮在乙酸溶液中會(huì)發(fā)生溶脹現(xiàn)象，導(dǎo)致溶液黏度較高，不利于空化作用的傳導(dǎo)[23]，且會(huì)影響底物與胃蛋白酶的結(jié)合。隨著料液比減小，體系的黏度降低，超聲波的空化效應(yīng)得到充分發(fā)揮，有利于膠原蛋白的溶出，提取率升高(圖1)。當(dāng)料液比為1∶ 80 g/mL時(shí)，提取率達(dá)最佳，為(24.33±0.54)%。但是料液比過小時(shí)，溶劑過多，降低了超聲波在溶液中的能量分布，導(dǎo)致提取率下降[24]。因此，確定1∶ 80 g/mL為最佳料液比。

注：不同小寫字母表示有顯著性差異(P<0.05)。圖2—圖4同。圖1 料液比對雞皮膠原蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on collagen extraction rate

2.2.2 加酶量的影響

當(dāng)酶用量增多，提取率呈先增加后降低的趨勢(圖2)。在加酶量小于1.5%時(shí)，底物與酶充分結(jié)合，胃蛋白酶的添加會(huì)提高膠原蛋白的提取率。當(dāng)酶添加量為1.5%時(shí)，提取率達(dá)最佳，為(29.68±0.27)%。當(dāng)加酶量大于1.5%時(shí)，蛋白與酶的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和，此時(shí)酶的增加不再提高蛋白提取效率，反而產(chǎn)物濃度的增高會(huì)抑制酶促反應(yīng)[25-26]，從而使提取率降低。因此，選擇加酶量為1.5%。

圖2 加酶量對雞皮膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of pepsin content on collagen extraction rate

2.2.3 超聲功率的影響

隨著超聲功率的增加，超聲波的微聲流會(huì)加速傳質(zhì)擴(kuò)散，產(chǎn)生空化、震蕩效應(yīng)，活化酶分子構(gòu)象及催化部位[27]，提取率呈先上升趨勢(圖3)。當(dāng)功率為195 W時(shí)，膠原蛋白提取率最高，為(34.90±0.16)%。但當(dāng)功率繼續(xù)增大時(shí)，提取率顯著下降(P<0.05)。研究表明，當(dāng)超聲密度過大，產(chǎn)生散射衰減，形成聲屏障，影響提取效果[28]。因此，選定超聲功率為195 W。

圖3 超聲功率對雞皮膠原蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on collagen extraction rate

2.2.4 超聲時(shí)間的影響

超聲持續(xù)時(shí)間的增加，膠原蛋白提取率先增加后降低(圖4)。超聲2～26 min，提取率逐漸上升，說明超聲波輔助能顯著增加膠原蛋白的提取率，在26 min時(shí)提取率達(dá)到最大，原料中膠原基本溶解。超聲時(shí)間繼續(xù)增大，超聲的空化效應(yīng)引起溶液局部遭受高溫、高剪切力及過高的壓強(qiáng)[29]，破壞多肽鏈上的氫鍵和范德華力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生變性[30]，蛋白質(zhì)卷曲、再折疊，使暴露的酶位點(diǎn)包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部[31]，從而提取率下降。而18 min和26 min無顯著性變化，考慮到時(shí)間過長增加能耗，因此，確定最佳超聲時(shí)間為18 min。

圖4 超聲時(shí)間對雞皮膠原蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on collagen extraction rate

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 回歸模型分析

通過對上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果分析，編制因素與水平編碼(表2)。進(jìn)行定制試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析(表3)，利用JMP軟件得到超聲輔助提取過程的回歸方程，回歸模型及系數(shù)方差分析結(jié)果如表4、表5所示。

對回歸方程進(jìn)行方差分析見表4，模型的F值為8.51，顯著性檢驗(yàn)P<0.05，說明該模型存在顯著性差異，失擬項(xiàng)P=0.104 1>0.05 不顯著，無失擬因素存在，表明該模型對數(shù)據(jù)的擬合程度高。膠原蛋白提取率與各因素間的線性關(guān)系顯著(R2=0.894 9)，表明該模型可以很好預(yù)測響應(yīng)值。

表2 因素與水平編碼Table 2 Factor and level coding

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and results

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

表5反映了4個(gè)因素與提取率(Y)的關(guān)系，回歸模型系數(shù)中一次項(xiàng)X3、X4對Y的影響極顯著，X1影響顯著，X2的影響不顯著，且二次項(xiàng)X22對Y的影響顯著，說明因素X1—X4對Y的影響不是單一的線性關(guān)系。根據(jù)P值可以得到對Y影響程度的順序?yàn)閄4>X3>X1>X2。

表5 回歸系數(shù)方差分析Table 5 Variance analysis of regression coefficient

2.3.2 雙因子交互作用分析

用Origin 8.5繪制兩個(gè)因素間交互作用的曲面圖，見圖5、圖6。響應(yīng)面曲面坡度可說明各因素對蛋白提取率影響的敏感度。圖5為料液比(X1)和加酶量(X2)的交互作用，其中X1曲面相對陡峭，說明其對提取率的影響更大，這是由于乙酸溶液增多導(dǎo)致體系中胃蛋白酶濃度降低，酶無法充分與底物結(jié)合，從而降低提取率。從加酶量(X2)和超聲功率(X3)的交互作用響應(yīng)面圖(圖6)可以看出，加酶量(X2)曲面變化相對平滑，表明X3的變化對提取率(Y)的影響更大，這可能是由于超聲的空化效應(yīng)使底物分散并增加酶的催化效果，從而促進(jìn)提取效率。

圖5 料液比和加酶量交互作用對雞皮膠原蛋白提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of effect of interaction between solid-liquid ratio and pepsin content on collagen extraction rate

圖6 加酶量和超聲功率交互作用對雞皮膠原蛋白提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of effect of interaction between pepsin content and ultrasonic power on collagen extraction rate

2.4 最佳工藝確定

該試驗(yàn)的最大化意愿因素水平見圖7。預(yù)測分析得出：料液比為1∶ 73 g/mL，加酶量為1.58%，超聲功率為260 W，超聲時(shí)間為26 min。此條件下雞皮膠原蛋白提取率最大，為83.58%，預(yù)測最佳提取率為75.75%～91.40%。通過以上分析，以最佳提取條件進(jìn)行膠原蛋白的提取，獲得實(shí)際平均提取率為(83.42±0.65)%，試驗(yàn)值與預(yù)測值接近。

圖7 試驗(yàn)預(yù)測刻畫圖Fig.7 Test prediction profile

3 結(jié)論

為了進(jìn)一步提高雞皮膠原蛋白的提取效率，采取超聲技術(shù)輔助胃蛋白酶提取雞皮中的膠原蛋白，并系統(tǒng)分析了提取過程中料液比、加酶量、超聲功率、超聲時(shí)間4個(gè)因素對提取率的影響，并采用JMP軟件定制設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對提取方法進(jìn)行優(yōu)化，得到各個(gè)因素對提取率的影響順序?yàn)槌晻r(shí)間>超聲功率>料液比>加酶量；最佳工藝為料液比1∶ 73 g/mL、加酶量1.58%、超聲功率260 W、超聲時(shí)間26 min，此條件下進(jìn)行試驗(yàn)獲得最佳提取率為(83.42±0.65)%，與模型預(yù)測值接近，證實(shí)該模型能用于雞皮膠原蛋白提取率的理論預(yù)測，說明超聲輔助酶法可以顯著提高膠原蛋白得率，為雞皮膠原蛋白工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。