彩色馬鈴薯新品系細(xì)胞遺傳學(xué)觀(guān)測(cè)及SSR分析

岳 東，于 卓，于肖夏，李佳奇，李景偉，楊東升，張海龍，李志聰

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

彩色馬鈴薯是指塊莖薯肉為紫、紅、藍(lán)等顏色的一類(lèi)特色型馬鈴薯，其不僅具有普通馬鈴薯(塊莖薯肉為白肉或黃肉)的營(yíng)養(yǎng)成分，還富含花青素，是一種很好的抗氧化劑，其抗氧化活性是白肉和黃肉馬鈴薯的3倍[1]?；ㄇ嗨厥且环N安全、無(wú)毒的可食用色素，同時(shí)還是一種很強(qiáng)的自由基清除劑[2]，它能夠有效地防止誘導(dǎo)有機(jī)體突變物質(zhì)的活性，具有抗氧化、抗衰老、抗突變和降血糖血脂等多種生理功能[3]，在保健、藥用、鮮食、食品和化妝品添加劑等方面具有重要利用價(jià)值[4]。近年來(lái)，隨著人們生活質(zhì)量的提高，對(duì)彩色馬鈴薯的年需求量日益增大，但目前國(guó)內(nèi)尚缺乏花青素含量高、產(chǎn)量、抗性等綜合性狀優(yōu)良的彩色馬鈴薯新品種，急需開(kāi)展新品種選育研究工作。國(guó)外關(guān)于彩色馬鈴薯遺傳育種研究工作開(kāi)展較早，并已育成一些綜合性狀較好的品種應(yīng)用于生產(chǎn)，如英國(guó)育成的紫黑肉新品種(Congo和Negresse)和紅肉突變體品種(King Edward)，美國(guó)育成的品種(Dark Red Norland和Red Norland)，日本育成的品種(Northern Ruby)等[5]。而我國(guó)對(duì)彩色馬鈴薯新品種的選育研究起步較晚，育成并大面積推廣應(yīng)用的品種較少[6-8]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需求。

為培育出適應(yīng)內(nèi)蒙古地區(qū)種植的彩色馬鈴薯優(yōu)良新品種，近年來(lái)內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯遺傳育種課題組在廣泛收集評(píng)價(jià)國(guó)內(nèi)外彩色馬鈴薯種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上，依據(jù)雙親生態(tài)適應(yīng)性廣、遺傳差異大和優(yōu)缺點(diǎn)互補(bǔ)的親本組配原則，選用國(guó)外引進(jìn)的馬鈴薯材料MIN-021、YSP-4、Red-P1與國(guó)內(nèi)育成品種紅美、紫彩1號(hào)作親本，配制了4個(gè)雜交組合紅美×YSP-4、MIN-021×紅美、紅美×紫彩1號(hào)和紫彩1號(hào)×Red-P1，從中選育出綜合性狀表現(xiàn)突出的6個(gè)優(yōu)良彩色馬鈴薯新品系NNCS-6、NNCS-7、NNCS-5、NNCS-1、NNCS-33和NNCS-37。本試驗(yàn)以MIN-021為對(duì)照，對(duì)這6個(gè)新品系的細(xì)胞學(xué)特性(花粉育性和染色體配對(duì)行為)進(jìn)行觀(guān)測(cè)，并在DNA水平上進(jìn)行了SSR遺傳差異分析，以期為下一步彩色馬鈴薯新品種的育成登記和利用提供分子細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試彩色馬鈴薯雜種新品系為NNCS-6(紅美×YSP-4)、NNCS-7(紅美×YSP-4)、NNCS-5(MIN-021×紅美)、NNCS-1(紅美×紫彩1號(hào))、NNCS-33(紫彩1號(hào)×Red-P1)和NNCS-37(紫彩1號(hào)×Red-P1)，對(duì)照(CK)為彩色馬鈴薯MIN-021。各材料均由本課題組提供，塊莖表型特征見(jiàn)圖1。本試驗(yàn)在呼和浩特市托克托縣古城鎮(zhèn)南的力圖馬鈴薯育種試驗(yàn)基地進(jìn)行。土壤質(zhì)地為沙質(zhì)壤土，pH值7.8左右，肥力中等，具有滴灌條件。種植方式為單壟穴播，株距30 cm，行距75 cm，播深約11 cm，各材料均種植200株。在植株生長(zhǎng)發(fā)育期間適時(shí)灌水、施肥、清除雜草。

A.NNCS-6；B.NNCS-7；C.NNCS-5；D.NNCS-1；E.NNCS-33；F.NNCS-37；G.MIN-021(CK)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉可育率測(cè)定 在彩色馬鈴薯開(kāi)花期，隨機(jī)取各供試材料的花朵裝入塑封袋帶回實(shí)驗(yàn)室，將花藥中的花粉用鑷子輕輕撒到載玻片上，滴1滴1%醋酸洋紅染色液，染色12 s，在20倍顯微鏡下觀(guān)察統(tǒng)計(jì)各材料的可育和不育的花粉粒數(shù)，約120個(gè)視野。觀(guān)察的標(biāo)準(zhǔn)：染色深厚均勻、有飽滿(mǎn)內(nèi)容物的花粉粒視為可育花粉；染色淺、空癟、畸形、瘦小的花粉粒視為不育花粉。

花粉可育率=可育花粉?？倲?shù)/觀(guān)察的花粉粒總數(shù)×100%[9]。

1.2.2 染色體配對(duì)構(gòu)型觀(guān)測(cè) 在現(xiàn)蕾期，于9：00—11：00在田間取各材料的幼小花蕾，放入裝有卡諾試液的試管中，帶回實(shí)驗(yàn)室在4 ℃冰箱中固定24 h，后取出用蒸餾水沖洗3次，轉(zhuǎn)到70%酒精的試管中，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。制片時(shí)，取花蕾置載玻片上，取出花藥擠碎，去除雜質(zhì)后在花粉母細(xì)胞上滴加卡寶品紅染色15 s，放蓋玻片用鑷子輕敲、壓片。在Olym-pusBX51顯微鏡40倍下觀(guān)察統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目，于100倍的油鏡下拍照，每個(gè)材料觀(guān)察細(xì)胞數(shù)130個(gè)以上。

1.2.3 DNA提取及質(zhì)量檢測(cè) 在田間取各供試材料的幼嫩葉片裝入冰盒帶回室內(nèi)，各稱(chēng)取0.3 g嫩葉放在研缽中，加適量液氮快速研磨成粉末，用北京天根有限公司生產(chǎn)的植物基因組DNA試劑盒提取其DNA。DNA上樣液為5 μL，在1.6%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)其質(zhì)量。將符合要求的DNA稀釋至50 ng/μL，置于-20 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.4 SSR引物來(lái)源及合成 從NCBI網(wǎng)站上發(fā)布的馬鈴薯引物序列中選取SSR特異性引物60對(duì)，委托上海生工生物有限公司合成。用6個(gè)彩色馬鈴薯新品系和對(duì)照MIN-021的基因組DNA為模板，進(jìn)行SSR適宜引物篩選，從中選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的SSR引物10對(duì)(表1)。

表 1 10對(duì)SSR適宜引物名稱(chēng)和堿基序列Tab.1 10 pairs of SSR suitable primer names and base sequences

1.2.5 PCR擴(kuò)增體系與程序 SSR-PCR反應(yīng)體系的總體積為20 μL，含dNTPs(0.225 mmol/L)1.3 μL，10×Buffer(Mg2+)2.1 μL，正反向引物各0.6 μL，DNA模板(50 ng/μL)2.0 μL，EasyTaqDNA聚合酶(5 U)0.1 μL，ddH2O 13.3 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。每個(gè)反應(yīng)體系中加入變性緩沖液(10 mmol/L EDTA、98%甲酰胺、0.25 %二甲苯氰FF、0.25%溴酚藍(lán))5.0 μL，94 ℃變性5 min，取出放入4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 電泳與銀染 聚丙烯酰胺凝膠濃度為6%，上樣量5.0 μL，額定功率70 W，預(yù)電泳30 min，對(duì)照為2.6 μL 的100 bp DNA Ladder。電泳85 min后將膠板取下于固定液(蒸餾水1 800 mL、冰乙酸20 mL、酒精200 mL)中固定20 min，蒸餾水速漂3 min，放入2%的AgNO3溶液染色15 min。蒸餾水清洗后置顯影液(蒸餾水2 000 mL、NaOH 30 g、甲醛8 mL)中。待清晰穩(wěn)定的DNA條帶出現(xiàn)，將其取出進(jìn)行固定、漂洗、風(fēng)干，掃描拍照。

1.2.7 SSR多態(tài)性位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)與聚類(lèi)分析

統(tǒng)計(jì)SSR多態(tài)性條帶依據(jù)0/1賦值法，出現(xiàn)條帶的記“1”，無(wú)條帶的記“0”。根據(jù)基因組DNA片段大小依次記錄，并生成“0、1”二元數(shù)據(jù)矩陣。多態(tài)性條帶位點(diǎn)百分率P=K/N×100%，K為擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶位點(diǎn)數(shù)，N為擴(kuò)增出的條帶總數(shù)[10]。

利用NTSYS軟件計(jì)算其遺傳距離(GD)，以非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)對(duì)6個(gè)彩色馬鈴薯及對(duì)照材料進(jìn)行聚類(lèi)分析[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料花粉可育率的比較

由表2可知，對(duì)照材料的花粉可育率為75.21%，高于60%，表明其育性較高，可作母本或父本進(jìn)行雜交利用。6個(gè)新品系中只有NNCS-1的花粉可育率低于50%，僅為44.00%，說(shuō)明其育性較低，適合作母本材料進(jìn)一步雜交利用；其余5個(gè)新品系的花粉可育率為60.70%～80.22%，均高于60%，表明它們適合作父本或母本材料用于雜交改良。

表2 6個(gè)彩色馬鈴薯新品系及其對(duì)照的花粉可育率Tab.2 Pollen fertility of 6 new-colored potato strains and controls

2.2 供試材料PMCM Ⅰ染色體配對(duì)構(gòu)型的比較

由表3可知，6個(gè)彩色馬鈴薯新品系及對(duì)照材料的單價(jià)體變幅為2.80～8.45、二價(jià)體變幅為6.09～10.42、三價(jià)體變幅為2.99～7.35、四價(jià)體變幅為1.33～3.72，表明各材料間的PMCM Ⅰ染色體配對(duì)行為有一定差別。NNCS-33、NNCS-37、NNCS-6、NNCS-7、NNCS-5、NNCS-1和MIN-021材料(CK)的染色體配對(duì)構(gòu)型分別為2n=4x=48=4.02Ⅰ+10.15Ⅱ+3.40Ⅲ+3.37Ⅳ、2n=4x=48=3.31Ⅰ+10.42Ⅱ+2.99Ⅲ+3.72Ⅳ、2n=4x=48=5.19Ⅰ+9.16Ⅱ+4.51Ⅲ+2.74Ⅳ、2n=4x=48=6.55Ⅰ+8.35Ⅱ+4.97Ⅲ+2.46Ⅳ、2n=4x=48=6.91Ⅰ+7.13Ⅱ+5.73Ⅲ+2.41Ⅳ、2n=4x=48=8.45Ⅰ+6.09Ⅱ+7.35Ⅲ+1.33Ⅳ、2n=4x= 48=2.80Ⅰ+9.38Ⅱ+4.51Ⅲ+3.23Ⅳ。各材料在PMCM Ⅰ(花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期Ⅰ)染色體配對(duì)構(gòu)型見(jiàn)圖2。

表3 6個(gè)彩色馬鈴薯新品系及其對(duì)照的PMCMⅠ染色體配對(duì)構(gòu)型比較Tab.3 Comparison of PMCMⅠchromosome pairing configurations of six new-colored potato strains and control

A.NNCS-33；B.NNCS-37；C.NNCS-06；D.NNCS-07；E.NNCS-05；F.NNCS-01；G.MIN-021(CK)。

2.3 供試材料遺傳差異的SSR分析

2.3.1 基因組DNA的質(zhì)量檢測(cè) 對(duì)6個(gè)彩色馬鈴薯新品系及對(duì)照材料的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)量檢測(cè)，通過(guò)觀(guān)察結(jié)果，供試材料基因組DNA電泳條帶清晰、穩(wěn)定，無(wú)任何彌散和拖尾現(xiàn)象，表明各材料所提取的DNA質(zhì)量高、符合SSR分析的要求(圖3)。

M.DNA Marker DL2000；1.NNCS-33；2.NNCS-37；3.NNCS-6；4.NNCS-7；5.NNCS-5；6.NNCS-1；7.MIN-021(CK)。

2.3.2 彩色馬鈴薯新品系多態(tài)性分析 用篩選出的10對(duì)SSR特異性引物，對(duì)新品系NNCS-6、NNCS-7、NNCS-5、NNCS-1、NNCS-33、NNCS-37和MIN-021(CK)的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共得到174個(gè)擴(kuò)增條帶位點(diǎn)，其中多態(tài)性條帶位點(diǎn)151個(gè)，每對(duì)引物平均擴(kuò)增出多態(tài)性條帶位點(diǎn)15.1個(gè)，多態(tài)性比率占86.78%，說(shuō)明這6個(gè)新品系及對(duì)照材料間存在著明顯的遺傳差異。其中引物C60擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)與總條帶數(shù)分別為13，17條，多態(tài)性比率最低為76.47%；C42的多態(tài)性條帶數(shù)與擴(kuò)增條帶總數(shù)最多，分別為23，24，其多態(tài)性比率最高為95.83%；S7擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)與總條帶數(shù)最少，分別為12，14條，多態(tài)性比率分別為85.71%(表4)。

表4 各新品系及其對(duì)照的SSR擴(kuò)增結(jié)果Tab.4 SSR amplification results of each new strain and control

另外，從10對(duì)SSR引物中利用篩選出的1對(duì)特異性引物C42，建立了一張能清晰地識(shí)別6個(gè)彩色馬鈴薯新品系及MIN-021(CK)的SSR指紋圖(圖4)，這為下一步彩色馬鈴薯新品種的育成登記和利用提供了分子依據(jù)。由于不同引物在各株系間擴(kuò)增出的SSR指紋圖不完全相同，因此，能在彩色馬鈴薯雜種株系鑒定及DNA指紋圖建立時(shí)最好選用1對(duì)能夠清晰區(qū)別的SSR特異性引物。

M.100 bp DNA Ladder；1.NNCS-33；2.NNCS-37；3.NNCS-6；4.NNCS-7；5.NNCS-5；6.NNCS-1；7.MIN-021(CK)。

2.3.3 供試材料間的遺傳距離及聚類(lèi)分析 由表5可知，6個(gè)彩色馬鈴薯新品系及對(duì)照材料的遺傳距離(GD)變幅為0.505 9～0.725 5，平均遺傳距離為0.624 8。新品系NNCS-37與NNCS-1的遺傳距離最大(0.725 5)，說(shuō)明其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；NNCS-37與NNCS-6的遺傳距離最小(0.505 9)，表明其親緣關(guān)系較近。

由圖5可知，以GD值0.62為基準(zhǔn)，將7個(gè)彩色馬鈴薯材料分成3類(lèi)：新品系NNCS-37、NNCS-6、NNCS-7、NNCS-5和MIN-021(CK)為一類(lèi)，說(shuō)明它們之間親緣關(guān)系相對(duì)較近；新品系NNCS-33和NNCS-1各單獨(dú)為一類(lèi)，表明這2個(gè)新品系與其他材料間的遺傳差異較大。

圖5 6個(gè)彩色馬鈴薯新品系及對(duì)照材料的聚類(lèi)Fig.5 Clustering of 6 new-colored potato strains and control material

表5 各供試材料的遺傳距離矩陣Tab.5 Genetic distance matrix of each tested material

3 結(jié)論與討論

同源四倍體植物具有4條同源染色體，在減數(shù)分裂時(shí)，特定同源片段內(nèi)僅允許2條染色體進(jìn)行聯(lián)會(huì)，其聯(lián)會(huì)片段大小與聯(lián)會(huì)解離程度和染色體交叉結(jié)點(diǎn)的形成有密切關(guān)系，因此，減數(shù)分裂中期Ⅰ的染色體存在1個(gè)單價(jià)體和1個(gè)三價(jià)體(Ⅲ+Ⅰ)、2個(gè)二價(jià)體(2Ⅱ)、1個(gè)二價(jià)體和2個(gè)單價(jià)體(Ⅱ+2Ⅰ)及1個(gè)四價(jià)體(Ⅳ)等多種構(gòu)型，而且三價(jià)體和四價(jià)體可能以鏈狀或環(huán)狀形態(tài)存在，在減數(shù)第1次分裂后期Ⅰ，僅2Ⅱ構(gòu)型通過(guò)聯(lián)會(huì)產(chǎn)生均衡分離，其他構(gòu)型均引起部分配子內(nèi)染色體分配不均衡，最終引起花粉敗育或花粉可育性降低[12-17]。郭鮮蒲[18]研究發(fā)現(xiàn)，同源四倍體馬鈴薯體細(xì)胞雜種8C20-1中出現(xiàn)的多分體比例高達(dá)92.31%，這與減數(shù)分裂過(guò)程中高頻率多價(jià)體和落后染色體等異象有關(guān)，致使花粉粒不能正常發(fā)育。本試驗(yàn)對(duì)6個(gè)彩色馬鈴薯雜種新品系的花粉母細(xì)胞PMCM Ⅰ的染色體配對(duì)行為和花粉可育率觀(guān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，二價(jià)體出現(xiàn)頻率高的新品系其花粉可育率亦相對(duì)較高，如新品系NNCS-37和NNCS-33的二價(jià)體頻率均較高，分別為10.42和10.15，其花粉可育率亦較高，分別為80.22%和78.10%。而二價(jià)體頻率低的新品系其花粉可育率亦較低，如新品系NNCS-1二價(jià)體頻率最低(6.09)，其花粉可育率亦最低(44.00%)。這進(jìn)一步說(shuō)明同源四倍體彩色馬鈴薯雜種新品系的PMCM Ⅰ染色體配對(duì)構(gòu)型中，二價(jià)體配對(duì)頻率越高，其花粉育性亦越高，即二者呈正相關(guān)關(guān)系。

SSR(Simple Sequence Repeat)分子標(biāo)記，又稱(chēng)微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)，因其具有共顯性、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于作物遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、重要數(shù)量性狀QTL精細(xì)定位及標(biāo)記輔助育種研究等方面[19-22]。評(píng)價(jià)不同馬鈴薯材料間的遺傳差異程度是開(kāi)展雜交改良的基礎(chǔ)，通常親本間遺傳差異大，其后代性狀變異的概率就大。在利用SSR標(biāo)記分析馬鈴薯種質(zhì)材料遺傳多樣性時(shí)，選擇多態(tài)性豐富的引物至關(guān)重要。Duan等[23]用11對(duì)SSR引物對(duì)217個(gè)馬鈴薯種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，獲得多態(tài)性條帶位點(diǎn)129個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)比率高達(dá)97.73%。這表明SSR引物多態(tài)性與馬鈴薯遺傳背景有關(guān)，當(dāng)引物表現(xiàn)為高度多態(tài)性時(shí)有利于準(zhǔn)確有效地區(qū)分試驗(yàn)材料。而高玉坤等[24]以65個(gè)馬鈴薯品種(系)為材料，利用29對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得100個(gè)多態(tài)性條帶位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)比率占65.77%，表明65個(gè)馬鈴薯品種(系)的遺傳多樣性處于中等水平，說(shuō)明供試材料遺傳背景相對(duì)狹隘。宋潔等[25]用14對(duì)SSR引物對(duì)國(guó)際馬鈴薯中心引進(jìn)的32份馬鈴薯品系和35份國(guó)內(nèi)馬鈴薯品種材料擴(kuò)增得到多態(tài)性位點(diǎn)60個(gè)，其多態(tài)性比率為66.38%，證明這67份馬鈴薯材料遺傳背景亦較窄。本試驗(yàn)以7個(gè)彩色馬鈴薯材料的基因組DNA為模板，利用篩選出的10對(duì)SSR適宜引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，平均每對(duì)引物產(chǎn)生15.1個(gè)多態(tài)性條帶位點(diǎn)，多態(tài)性比率較高(86.78%)，并用1對(duì)特異性引物C42進(jìn)行PCR擴(kuò)增建立了一張能清晰區(qū)分7個(gè)材料的SSR指紋圖，進(jìn)一步表明這7個(gè)彩色馬鈴薯雜種材料間的遺傳差異性較大，且所選的SSR特異性引物能準(zhǔn)確識(shí)別出各彩色馬鈴薯新品系。

本研究明確了6個(gè)彩色馬鈴薯新品系NNCS-33、NNCS-37、NNCS-6、NNCS-7、NNCS-5、NNCS-1和MIN-021(CK)的花粉育性程度、PMCM Ⅰ染色體配對(duì)構(gòu)型及其二者的關(guān)系。利用篩選出的10對(duì)SSR適宜引物，對(duì)7個(gè)彩色馬鈴薯材料基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增共獲得多態(tài)性條帶位點(diǎn)151個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)比率為86.78%。用特異性SSR引物C42建立了能清晰地識(shí)別出6個(gè)彩色馬鈴薯新品系和對(duì)照材料的SSR指紋圖。通過(guò)聚類(lèi)分析查明了7個(gè)彩色馬鈴薯材料間的親緣關(guān)系。該研究為進(jìn)一步開(kāi)展彩色馬鈴薯雜交改良、新品種育成、登記和利用奠定了基礎(chǔ)。