陸地棉一個低毒Bt基因的分子鑒定與染色體定位

陳旭升，趙 亮，狄佳春

(江蘇省農業(yè)科學院 經濟作物研究所，農業(yè)農村部長江下游棉花與油菜重點實驗室，江蘇 南京 210014)

轉Bt基因的研究最先為Schnepf等[1]的報道。1989年Monsanto公司基于不改變殺蟲晶體蛋白氨基酸序列的前提下，采用人工合成與點突變的方法，對來自蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)的Bt基因進行改造，然后將改造的Bt基因導入棉花，使轉基因抗蟲棉的抗蟲能力得以極大提升[2]。1996年Monsanto公司與棉花育種公司合作，育成商用轉Bt基因抗蟲棉即保鈴棉33B，并開始在生產上大面積推廣應用。我國緊跟國際轉基因抗蟲棉研究的前沿，郭三堆等[3-4]設計并自主合成了具有高活性表達的GFM Cry1A殺蟲晶體蛋白結構基因，并將人工合成的Bt基因導入受體棉花，成功獲得轉基因植株；經與國內育種單位合作，選育出一系列國產轉Bt基因抗蟲棉。

隨著分子標記技術[5-6]的發(fā)展，有關抗蟲棉不同類型Bt基因的鑒定及其染色體定位的研究也取得很大進展[7-10]。業(yè)已研究表明：轉基因抗蟲棉的抗性維系，既取決于棉花群體的抗蟲性純度，也與棉花受體中毒蛋白表達劑量密切相關[11]。陳旭升等[12]報道，在陸地棉資源中篩選到一個Bt基因低毒蛋白表達的種質系WG-20，其葉樣品的Bt毒蛋白含量為88.8 ng/g，對棉鈴蟲的生物學平均抗性值PK為1.67，表現(xiàn)為低抗；對雜交F1的抗性鑒定顯示，該低毒Bt基因對高毒Bt基因呈顯性表達。

本研究擬在分子水平上對該Bt基因類型進行鑒定，并構建定位遺傳圖譜，分析該遺傳轉化事件與高毒表達Bt基因轉化事件的關系，旨在為轉Bt基因抗蟲棉育種提供多樣化視角。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

采用的試驗材料為：轉Bt基因低毒蛋白表達種質系WG-20、國產抗蟲棉GK-19，非轉基因棉花海島棉勝利1號與陸地棉泗棉3號。配置海陸雜交F1組合：WG-20×勝利1號，在江蘇省農科院南京試驗田種植雜交F1，開花期進行自交，獲得F2分離群體作為Bt基因的定位群體。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子DNA的提取 取親本WG-20與勝利1號以及(WG-20×勝利1號)F1、(WG-20×勝利1號)F2的種子。將每粒種子作為1個個體，剝離種殼得種仁。采用單粒棉花種子DNA 快速提取方法提取DNA[13]。

1.2.2 Bt基因類型鑒定 通過設計特異性引物做PCR檢測，可以鑒定國產Bt基因與美國Bt基因。特異性引物序列如下[7]：F-1： 5′-CATCTTCACTCGG

TAACATCG-3′(456 bp)；F-2： 5′-AGGGAACCTTCAT

CGTGG-3′(310 bp)；R： 5′-ATACGTGCCAAGTGCCA

ACC-3′。利用以上引物進行混合PCR擴增，國產Bt基因可獲得456 bp大小的特征片段，美國Bt基因將獲得310 bp大小的特征片段。對WG-20、GK-19的DNA進行PCR擴增，以清水、非轉基因棉花泗棉3號為對照。在恒壓90 V條件下，使用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，擴增產物的片段大小通過凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄。

1.2.3 群體Bt基因檢測與統(tǒng)計 取雙親、F1、F2分離群體的種子DNA進行PCR擴增。其反應程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。采用8.0%的非變性聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠，電泳緩沖液為1×TBE，在200 V恒壓條件下，對擴增產物進行電泳。電泳結束后，利用銀染法進行染色，觀察統(tǒng)計各群體具有Bt基因的個體、無Bt基因的個體數量；而后對分離群體進行χ2適合性測驗。

1.2.4 Bt基因染色體定位 農業(yè)部長江下游棉花與油菜重點實驗室前期利用來自Cotton Marker Database(https：//www.cottongen.org)提供的SSR引物序列，獲得分布于棉花26對染色體上的234對SSR核心引物[14]。在F2群體選取有Bt、無Bt個體各10個，將等量DNA混合。利用234對核心引物，先篩選F2近等基因混池的多態(tài)性標記，而后檢測F2群體中各個體的基因型。以數字標注多態(tài)性條帶：與無Bt基因親本帶型相同的標注為1，與有Bt基因親本帶型相同的標注為2，共顯性雜合帶型標注為3，缺失標注為0。而后采用Join Map 4.0軟件進行連鎖分析，以確定低毒Bt基因在染色體上的位置。

2 結果與分析

2.1 WG-20的Bt基因來源的分子鑒定

采用檢測Bt基因的特異引物，對轉Bt基因材料進行分子鑒定，以清水、泗棉3號為空白對照，PCR檢測結果見圖1。由圖1可知，國產抗蟲棉GK-19的PCR擴增條帶，擬合國產Bt基因的特征引物設計長度456 bp，顯示其為轉國產Bt基因抗蟲棉。種質系WG-20的Bt基因片段大小擬合美國 Bt 基因設計引物的特征片段長度 310 bp，顯示WG-20所含的為美國Bt基因。泳道3，4均未見特征擴增條帶。

M.DNA Marker；1.GK-19；2.WG-20；3.清水；4.泗棉3號。M.DNA Marker；1.GK-19；2.WG-20；3.Distilled water；4.Simian No.3.

2.2 低毒Bt基因的分離規(guī)律

利用PAGE凝膠電泳，對低毒Bt基因親本WG-20、海島棉親本勝利1號以及雜交F1、F2進行Bt基因特征條帶鑒定。圖2為F2群體部分單株鑒定結果，從圖2可以看出，有Bt基因的P1、F1以及F2的大部分個體在310 bp處均出現(xiàn)明顯的特征條帶；無Bt基因的P2以及編號5，6，20，27，28，35泳道的F2個體則沒有出現(xiàn)特征條帶。

M.Marker；P1.WG-20；P2.勝利1號；F1.WG-20×勝利1號；1—36.F2群體部分單株。M.Marker；P1.WG-20；P2.Shengli No.1；F1.WG-20×Shengli No.1；1—36.Partial plants of F2 population.

依據電泳的特征條帶，統(tǒng)計各群體Bt基因的分離情況見表1。由表1可見，種質系WG-20的43個個體均含有Bt基因，而勝利1號的45個個體都沒有Bt基因；雜交F1中均檢測到Bt基因特征條帶，顯示該Bt基因呈顯性表達。分離F2群體中有Bt基因的個體數為143、無Bt基因個體數為35，采用χ2檢測符合3∶1的孟德爾理論分離比例，顯示該Bt基因是受1對顯性基因控制的質量性狀，即該外源基因是以單個位點的方式插入陸地棉受體。因此，可采用SSR分子標記對其進行基因定位。

表1 WG-20與勝利1號雜交后代的Bt基因分離情況Tab.1 Isolation of Bt gene from the offspring of WG-20 crossing Shengli No.1

2.3 低毒Bt基因染色體定位

利用本實驗室前期篩選獲得的234對核心引物，通過對定位群體F2的有Bt和無Bt兩近等基因混池進行差異標記篩選，有40對引物具有多態(tài)性。而后采用這40對多態(tài)性引物對F2作圖群體中的每個個體的基因型進行檢測，并采用Join Map 4.0軟件進行關聯(lián)分析，結果發(fā)現(xiàn)，其中的1對引物BNL1665與Bt基因緊密連鎖，二者的初始遺傳距離為7.8 cM。查閱Guo等[15]2007年發(fā)表的棉花分子標記遺傳圖譜，顯示引物BNL1665位于棉花第10號染色體上。據此查找并合成在第10號染色體上距離該標記上下50 cM區(qū)間的所有SSR引物。利用親本WG-20與勝利1號的DNA再篩選其中的多態(tài)性引物，并以多態(tài)性引物檢測F2作圖群體中的每個個體的基因型。試驗結果采用Join Map 4.0軟件進行連鎖遺傳分析，顯示共有14對引物與目的基因Bt相連鎖，分別是NAU5166、NAU3574、NAU456、BNL256、cgr6745、cgr5406、cgr6546、NAU7110、HAU3201、BNL1665、dPL0468、NAU5316、BNL2960、NAU3122?；駼t位于SSR標記NAU7110和HAU3201之間，其遺傳距離分別為0.9，4.4 cM(圖3)。由此將該Bt基因定位在棉花第10號染色體上。

3 結論與討論

20世紀80年代在美國出現(xiàn)植物轉基因工程技術。然而，將外源基因導入植物受體只是遺傳轉化的第一步，只有外源基因在受體中穩(wěn)定整合和有效表達，才能培育出具有新遺傳性狀的轉基因品種，最終才可能在生產上推廣應用。然而許多外源基因轉化體，其目的基因在受體中的表達活性弱、產量低。產生這種現(xiàn)象的原因可能是由轉基因沉默或位置效應所致。

圖3 低毒Bt基因位于Chr.10的連鎖遺傳圖譜Fig.3 Genetic linkage map of low-toxic Bt gene in Chr.10

已有許多途徑與方法可以誘導基因沉默[16-18]；但關于基因表達的位置效應研究報道則較少[19]。所謂位置效應(Position effect)是指外源基因在受體中插入的位置不同所引起的基因表達程度的差異。外源基因整合到宿主染色體后會受到宿主染色質結構和表達調控元件的影響[20]。在不同染色體區(qū)域，轉基因表達效率不同，有的強烈表達，有的則表現(xiàn)為基因沉默。一般來說，外源基因整合到甲基化程度高、轉錄活性低的異染色質區(qū)時，則趨向沉默；而外源基因整合到富含轉錄活性的常染色質區(qū)時，則趨向活躍表達[21]。

已知國產抗蟲棉GK-19的Bt基因插入棉花第20染色體，美國抗蟲棉33B中的外源Bt基因則插入棉花第26染色體[10]。曾檢測GK-19、33B葉組織的Bt毒蛋白表達量分別高達1 032.7，1 123.9 ng/g，且對棉鈴蟲均表現(xiàn)為高抗；而種質系WG-20，其葉組織的Bt基因毒蛋白表達量僅88.8 ng/g，且對棉鈴蟲表現(xiàn)為低抗[10-12]。染色體定位結果顯示：WG-20中的外源Bt基因插入到棉花第10號染色體上，與GK-19、33B中的外源Bt基因整合的染色體完全不同。由此推測：陸地棉種質系WG-20中的Bt毒蛋白量呈低水平表達，可能是該外源Bt基因整合到棉花Chr.10的異染色質區(qū)域，因位置效應導致外源基因趨向沉默。