陸地棉細(xì)胞色素P450基因GhP450-94C1黃萎病抗性功能驗證

胡子曜，李秀青，代培紅，雷建峰，柳建飛，趙 燚，鄧嘉輝，劉 超，劉曉東，李 月

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)是最大的蛋白質(zhì)超家族之一，因其與還原態(tài)CO結(jié)合后在450 nm處吸光值最高而得名，其廣泛存在于植物、微生物、昆蟲及哺乳動物細(xì)胞內(nèi)[1]。目前對該超家族蛋白按CYP(細(xì)胞色素的正式縮寫)、家族(數(shù)字)、亞家族(字母)和同工型(數(shù)字)順序命名，例如CYP94C1屬于CYP家族94亞家族C中的一類蛋白質(zhì)[2]。CYP450基因家族在植物基因組中數(shù)目龐大，約占編碼蛋白質(zhì)基因總數(shù)的1%[3]；CYP450蛋白在進(jìn)化上高度保守，暗示其功能具有一定的相似性，通常與線粒體、高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器膜結(jié)合在一起，廣泛參與萜類、激素、苯丙烷、脂肪酸、生物堿、信號分子及類黃酮的合成與降解等多種植物生命活動中的次生代謝反應(yīng)，在植物生長發(fā)育和提高植物對逆境脅迫的適應(yīng)能力中發(fā)揮著重要作用[4]。Ping等[5]過表達(dá)蘋果CYP450基因MdCYPM1后，植株的生長素運輸及開花時間均受到顯著影響，表現(xiàn)出葉綠素的減少及下胚軸伸長等表型，表明該基因在調(diào)控植物的生長發(fā)育上發(fā)揮著重要作用；Xiao等[6]研究發(fā)現(xiàn)，CYP86A8和CYP86A22個基因均通過參與擬南芥角質(zhì)層的合成進(jìn)而增強植株的耐旱性。Chopra等[7]研究發(fā)現(xiàn)，高粱CYP99A1和CYP709C1基因的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)顯著，推測它們可能在抵御冷脅迫中發(fā)揮一定的作用；Wang等[8]研究表明，小麥CYP450基因TaCYP81D5通過參與植株體內(nèi)的活性氧清除進(jìn)而介導(dǎo)植株的抗鹽反應(yīng)；而Mao等[9]發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtCYP709B3基因的表達(dá)受高鹽脅迫誘導(dǎo)，推測其可能與小麥TaCYP81D5基因功能類似，同樣介導(dǎo)植株的耐鹽反應(yīng)；Zhang等[10]過表達(dá)苜蓿CYP2E1基因后顯著增強了植株的抗汞毒性；Yan等[11]過表達(dá)GmCYP82A3基因后顯著增強了轉(zhuǎn)基因大豆對疫霉菌的抗性，且JA、ET信號通路相關(guān)基因表達(dá)量顯著上調(diào)，推測該基因通過參與JA和ET信號通路的正向調(diào)控，介導(dǎo)大豆的抗病反應(yīng)。

棉花是關(guān)系我國民生的重要經(jīng)濟(jì)作物之一[12]。黃萎病是棉花生產(chǎn)最具破壞性的生物脅迫之一，嚴(yán)重制約著我國的棉花產(chǎn)量及纖維品質(zhì)，阻礙著國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb)是引發(fā)我國棉花黃萎病的主要病原菌，作為一種土傳維管束真菌病害，其通過根系感染，繼而引起植株的枯萎、變色、落葉，最終導(dǎo)致植株的死亡[13]。大麗輪枝菌寄主廣泛，可以侵染包括棉花在內(nèi)的200多種雙子葉植物；微菌核是大麗輪枝菌的休眠狀態(tài)，對不良環(huán)境具有很強的抗逆能力，因此，該病原菌在沒有合適寄主的情況下也可以在土壤中長期存活[14]。目前，還缺乏可以有效防止大麗輪枝菌侵染的殺菌劑，因此，挖掘黃萎病相關(guān)抗性基因并培育抗病新品種，對于棉花黃萎病的防治及農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)至關(guān)重要。

目前，對于細(xì)胞色素P450基因在棉花抗黃萎病反應(yīng)中的研究主要集中在海島棉。Zhou等[15]抑制海島棉GbCYP94C1基因表達(dá)后降低了植株對黃萎病菌的敏感性，表明該基因是海島棉抵御黃萎病菌入侵的負(fù)調(diào)節(jié)因子；Wang等[16]過表達(dá)海島棉GbCYP86A1-1基因后通過激活相關(guān)抗病免疫信號途徑，增強了植株對黃萎病菌的耐受性；但目前關(guān)于P450家族基因參與陸地棉抗黃萎病反應(yīng)的相關(guān)研究還未見報道。

本研究通過前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選得到一個響應(yīng)黃萎病菌侵染的細(xì)胞色素P450基因GhP450-94C1，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)初步探究其在棉花抵御黃萎病菌的應(yīng)激反應(yīng)中的生物學(xué)功能，旨在為挖掘、鑒定陸地棉黃萎病相關(guān)基因提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1，其種子由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室繁存；大麗輪枝菌菌株V991及TRV病毒載體均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院黃全生研究員惠贈。FastPfu Fly DNA聚合酶、DH5α和GV3101感受態(tài)細(xì)胞、B-Zero平末端克隆載體、T4DNA 連接酶和DNA分子量Marker均購于北京全式金公司；各種限制性內(nèi)切酶購于賽默飛(Thermo)公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒和RNase A購于南京諾維贊公司，RNA提取試劑盒購于杭州博日公司；反轉(zhuǎn)錄和熒光定量試劑盒均購于加拿大愛必夢(abm)公司；抗生素化學(xué)試劑均購于北京索萊寶公司；試驗所用引物的合成及測序均由上海生工公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 棉花種植 挑選顆粒飽滿的TM-1種子，參照Li等[17]的方法進(jìn)行培育及種植。

1.2.2 黃萎病菌的培養(yǎng)及誘導(dǎo)處理 將-80 ℃保存的大麗輪枝菌V991取出后，參照Li等[17]的方法進(jìn)行活化培養(yǎng)及接菌處理，對照組(CK)為Czapek′s培養(yǎng)基處理，分別于處理前(0 h)和處理后6，12，24，48，72 h 對其根部進(jìn)行取樣；每個時間點均取4個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3 總RNA提取與cDNA合成 使用RNA提取試劑盒對棉花根部樣品進(jìn)行RNA的提取，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。

1.2.4 棉花GhP450-94C1基因的克隆及序列分析 通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得GhP450-94C1基因序列，并在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中檢索其登錄號：XM_016813513。GhP450-94C1基因生物信息學(xué)分析工具參見表1。根據(jù)該基因的CDS序列設(shè)計相應(yīng)的克隆引物(表2)，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，參照胡子曜等[18]的方法進(jìn)行基因克隆。

表1 生物信息學(xué)分析工具Tab.1 Bioinformatics analysis tools and corresponding functions

1.2.5GhP450-94C1基因在黃萎病菌V991侵染下的表達(dá)模式 以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，選取GhUBQ7為內(nèi)參基因[19]，利用qRT-PCR技術(shù)探究GhP450-94C1基因在黃萎病菌侵染下的表達(dá)模式。反應(yīng)結(jié)束后參照各基因的Ct值，使用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達(dá)量[20]。相關(guān)引物見表2。

1.2.6GhP450-94C1基因的VIGS載體構(gòu)建 根據(jù)GhP450-94C1基因的ORF(1503 bp)序列，利用SGN-VIGS(https：//vigs.solgenomics.net/)在線網(wǎng)站設(shè)計抑制GhP450-94C1基因表達(dá)的沉默片段(442 bp)，設(shè)計相應(yīng)引物并在其上、下游5′端分別加入EcoR Ⅰ和KpnⅠ酶切位點(表2)，克隆VIGS靶序列，具體方法同1.2.4。用測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒及TRV2載體經(jīng)EcoR Ⅰ和KpnⅠ酶切后用T4DNA Ligase連接4 h后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行酶切鑒定，正確的重組質(zhì)粒取10 μL轉(zhuǎn)化GV3101感受態(tài)細(xì)胞，28 ℃培養(yǎng)2 d，用于后續(xù)試驗。

1.2.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的VIGS侵染棉花及沉默效率檢測 將TRV∶GhP450-94C1、TRV∶GhCLA1、TRV∶RNA1和TRV∶RNA2分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，選取生長一致、2片子葉完全展開且真葉未露出的棉花幼苗，參照Li等[17]的方法進(jìn)行菌體的活化、重懸及VIGS侵染。大約21 d后，當(dāng)陽性對照TRV∶∶GhCLA1的葉片出現(xiàn)明顯的白化表型時，取各組分的根部及真葉組織進(jìn)行RNA提取及cDNA合成，通過qRT-PCR檢測沉默效率。相關(guān)引物見表2。

1.2.8 棉苗的接種處理 選取生長狀況一致的GhP450-94C1沉默植株和陰性對照植株，參照Li等[17]的方法進(jìn)行黃萎病菌(V991)的接種處理。

1.2.9GhP450-94C1基因的黃萎病抗性鑒定 接種黃萎病菌20 d后拍照記錄GhP450-94C1沉默植株和陰性對照植株的表型差異并采用葉片分級法統(tǒng)計病情指數(shù)[17]，同時對GhP450-94C1沉默植株和陰性對照植株進(jìn)行剖稈檢測及莖段恢復(fù)培養(yǎng)試驗[21]。

表2 引物及用途Tab.2 Primer and application

2 結(jié)果與分析

2.1 GhP450-94C1基因的克隆與序列分析

以陸地棉TM-1的葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，大小與預(yù)期相符(圖1)，表明已成功克隆GhP450-94C1基因的ORF序列。該基因的ORF為1 503 bp，編碼500個氨基酸，分子式為C2597H4025N691O725S22，分子質(zhì)量為57.23 ku，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，理論等電點為6.87，平均疏水性為-0.030，表明該蛋白為酸性、親水性蛋白，脂肪系數(shù)為93.20，不穩(wěn)定指數(shù)為46.44，屬于不穩(wěn)定蛋白，含有跨膜結(jié)構(gòu)，屬于跨膜蛋白；蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白含有一個P450結(jié)構(gòu)域(圖2)；信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，GhP450-94C1蛋白有86.45%的概率存在信號肽(圖3)；二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白含有24個α-螺旋和8個β-折疊，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果完全符合二級結(jié)構(gòu)特征(圖4)。

M.Trans 2000 PlusⅡ DNA Marker。圖6同。M.Trans 2000 PlusⅡ DNA Marker.The same as Fig.6.

圖2 GhP450-94C1蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.2 The prediction protein domain of GhP450-94C1

圖3 GhP450-94C1蛋白信號肽預(yù)測Fig.3 The prediction signal peptide of GhP450-94C1 protein

2.2 黃萎病菌V991處理下GhP450-94C1基因的表達(dá)模式分析

黃萎病菌V991處理后(圖5)，與對照相比GhP450-94C1基因表達(dá)量在6，12，72 h顯著上調(diào)(P<0.05)，24，48 h無顯著差異。表明GhP450-94C1基因響應(yīng)黃萎病菌脅迫處理，可能在棉花抵御黃萎病菌侵染反應(yīng)中發(fā)揮一定的作用。

2.3 GhP450-94C1基因的VIGS載體構(gòu)建

載體構(gòu)建示意圖如圖6-A所示，利用PCR技術(shù)擴增抑制目標(biāo)基因表達(dá)的靶序列(CM-GhP450-94C1)，大小符合預(yù)期。將其進(jìn)行克隆并測序，測序正確的質(zhì)粒酶切后與TRV2載體連接并進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果呈2條帶(TRV∶GhP450-94C1)，一條8 000 bp以上的載體條帶和一條約500 bp的目標(biāo)片段(圖6-B)，表明已成功構(gòu)建GhP450-94C1基因的VIGS載體。

2.4 GhP450-94C1基因的沉默效率檢測

將TRV∶GhP450-94C1、TRV∶GhCLA1和TRV∶RNA2分別與TRV∶RNA1混合后進(jìn)行棉花侵染。15 d后進(jìn)行表型觀察，與陰性對照TRV∶00相比，陽性對照TRV∶GhCLA1的葉片出現(xiàn)明顯的白化現(xiàn)象(圖7-A)；qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，GhCLA1和GhP450-94C1基因的表達(dá)均受到顯著抑制(圖7-B、C)，表明TRV-VIGS體系可以在棉花體內(nèi)正常工作并成功獲得GhP450-94C1沉默植株。

A.GhP450-94C1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；B.GhP450-94C1蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。A.The prediction secondary structure of GhP450-94C1 protein；B.The prediction tertiary structure of GhP450-94C1 protein.

相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母之間表示差異顯著(P<0.05)。圖7—8同。

2.5 GhP450-94C1基因沉默植株的黃萎病抗性鑒定

選取生長狀況一致的GhP450-94C1基因沉默植株和陰性對照植株進(jìn)行黃萎病菌侵染，20 d后拍照記錄其表型差異并統(tǒng)計病情指數(shù)及剖稈檢測和莖段恢復(fù)培養(yǎng)試驗。結(jié)果顯示，與對照植株相比，沉默植株的萎蔫程度及葉片黃化更加嚴(yán)重，其健康狀況明顯更差(圖8-A)；病情指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果顯示，沉默植株病情指數(shù)顯著高于對照植株(P<0.05)(圖8-B)；剖稈檢測結(jié)果顯示，與對照植株相比，沉默植株莖稈的褐變程度更為嚴(yán)重(圖8-C)；莖段恢復(fù)培養(yǎng)結(jié)果顯示，沉默植株的莖段在培養(yǎng)基上長出的真菌菌絲數(shù)量明顯多于對照植株，(圖8-D)。以上結(jié)果初步表明，GhP450-94C1基因是一個棉花抵御黃萎病菌入侵的正調(diào)節(jié)因子。

A.GhP450-94C1的VIGS載體構(gòu)建示意圖；B.GhP450-94C1目標(biāo)片段的PCR擴增；C.TRV∶GhP450-94C1載體的酶切鑒定。A.Construction of VIGS vector of GhP450-94C1；B.PCR amplification of target fragment of GhP450-94C1；C.Identification of TRV∶GhP450-94C1 vectors by restriction enzyme digestion.

A.沉默GhCLA1的表型；B、C.GhCLA1和GhP450-94C1的沉默效率檢測。A.The phenotype of silenced GhCLA1；B，C.Silencing efficiency of GhCLA1 and GhP450-94C1.

3 結(jié)論與討論

黃萎病被稱為棉花的“癌癥”，嚴(yán)重制約著棉花的纖維品質(zhì)及擴大生產(chǎn)，已成為影響我國棉花質(zhì)量及產(chǎn)量的首要生物因素。作為目前我國主要的栽培品種，陸地棉不同于海島棉，其對黃萎病具有較強的抗性，對黃萎病菌較為敏感[22]。由于種間雜交育種難度大且效率低，抗病品種選育進(jìn)展緩慢；因此，篩選、鑒定棉花抗黃萎病關(guān)鍵基因并利用現(xiàn)代基因工程和分子育種技術(shù)培育抗病新品種具有重要意義。

A.GhP450-94C1基因沉默后植株的表型分析；B.病情指數(shù)統(tǒng)計；C.剖稈鑒定；D.病原菌恢復(fù)培養(yǎng)。A.Phenotype analysis of plants after GhP450-94C1 gene silencing；B.Disease index statistics；C.Stem cutting phenotype；D.Restoration culture of pathogenic bacteria.

棉花對黃萎病的防御過程是十分復(fù)雜的，需要一系列抗性基因和相關(guān)蛋白的參與。隨著棉花基因組測序的完成，越來越多的黃萎病抗性相關(guān)基因被克隆并鑒定出來：Zhang等[23]利用VIGS技術(shù)抑制棉花琥珀酸脫氫酶(SDH)基因GhSDH1-1表達(dá)后顯著提高了植株對大麗輪枝菌的敏感性，且水楊酸(SA)通路相關(guān)基因表達(dá)顯著下調(diào)，表明GhSDH1-1基因通過介導(dǎo)SA途徑進(jìn)而在棉花抗黃萎病反應(yīng)中作為一個正調(diào)節(jié)因子；Li等[17]利用VIGS技術(shù)沉默棉花GhBsr-k1基因后顯著增強了植株對大麗輪枝菌和尖孢鐮刀菌的抗性，苯丙烷代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)顯著上調(diào)，木質(zhì)素積累量顯著增加，表明該基因是棉花抗病反應(yīng)的一個負(fù)調(diào)節(jié)因子，其在植物防御中的潛在機制可能與調(diào)控木質(zhì)素通路基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)；Xiong等[24]利用RNAi技術(shù)干涉WRKY轉(zhuǎn)錄因子GhWRKY70D13基因表達(dá)后顯著提高了植株的抗病性，植株中乙烯(ET)和茉莉酸(JA)合成及信號通路基因表達(dá)均顯著增加，表明該基因通過負(fù)調(diào)控ET和JA信號通路，參與了棉花抗病反應(yīng)；Zhu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，棉花PLPs基因GhPLP2通過調(diào)節(jié)脂肪酸的積累和JA信號通路，正向調(diào)節(jié)棉花的抗病反應(yīng)；Xiong等[26]利用VIGS技術(shù)抑制GhGDH2基因表達(dá)后激活了JA合成及信號通路基因的表達(dá)但抑制了SA合成及信號通路基因的表達(dá)，增強了植株的抗病性，判斷該基因是棉花抗病反應(yīng)的一個正調(diào)節(jié)因子，其最終表現(xiàn)出的抗性是2種抗病途徑效果總和抵消后的結(jié)果；Li等[27]過表達(dá)F-box蛋白基因GhACIF1后增強了轉(zhuǎn)基因植株對大麗輪枝菌的抗性，表明該基因正向調(diào)控棉花對黃萎病菌的抗性；Pei等[28]研究發(fā)現(xiàn)，棉花GLP蛋白基因GhABP19通過激活JA途徑和SOD活性，在棉花抵御黃萎病菌和枯萎病菌入侵中發(fā)揮著重要作用；Ma等[29]研究發(fā)現(xiàn)，棉花BEL1-Like轉(zhuǎn)錄因子GhBLH7-D06通過抑制木質(zhì)素的生物合成和JA信號傳導(dǎo)途徑進(jìn)而負(fù)調(diào)節(jié)棉花對黃萎病菌的抗性。此外，近年來還有GhAAT[30]、GbVIP1[31]、GbMPK3[32]、GhRPS6[33]、GhTBL34[34]、GbABR1[35]、GhSKIP35[36]等棉花黃萎病相關(guān)基因被挖掘、鑒定出來。

作為陸生植物中最大的酶蛋白家族之一，目前已有許多研究表明，細(xì)胞色素P450基因在植物抵御病原菌脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。李文奇等[37]過表達(dá)水稻P450基因OsCYP71Z2后顯著提高了轉(zhuǎn)基因水稻對稻瘟病菌的抗性，植保素含量及生物合成通路關(guān)鍵基因的表達(dá)量均顯著增加，推測該基因通過介導(dǎo)植保素的生物合成參與水稻對稻瘟病抗性反應(yīng)的調(diào)控；Zhou等[38]從擬南芥中克隆得到一個CYP71B15基因，該基因同樣通過調(diào)控植保素的生物合成，在作物抵御病原菌侵染中發(fā)揮著重要作用；Maeda等[39]研究發(fā)現(xiàn)，水稻CYP78A基因BSR2基因的敲除顯著增強了植株對立枯病菌的敏感性；Li等[40]研究發(fā)現(xiàn)，小麥對枯萎病菌和赤霉病菌的抗性與細(xì)胞色素P450基因的激活密切相關(guān)；Liu等[41]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥細(xì)胞色素P450基因CYP82C2通過正向調(diào)節(jié)JA誘導(dǎo)的相關(guān)防御基因的表達(dá)，在植株抗灰霉菌反應(yīng)中扮演一個正調(diào)控因子的角色。目前，對于陸地棉P450家族基因的功能研究多集中在對植株的生長發(fā)育的調(diào)控：張翼等[42]從陸地棉中克隆出一個P450基因GhCYP85A2-1，該基因表達(dá)后植株的株高顯著降低，判斷其在棉花株高發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用；辛珊等[43]過表達(dá)GhCYP714A1基因后顯著增強了轉(zhuǎn)基因煙草葉片中過氧化氫(H2O2)量的積累，推測其可能參與了活性氧的產(chǎn)生；Gu等[44]研究發(fā)現(xiàn)，GhCYP94C1基因參與了WRKY轉(zhuǎn)錄因子GhWRKY27調(diào)控的陸地棉衰老途徑；此外Sun等[45]發(fā)現(xiàn)棉花CYP82亞家族成員CYP82D基因通過介導(dǎo)細(xì)胞的系統(tǒng)性死亡，參與陸地棉抵御枯萎病菌的反應(yīng)，表明陸地棉P450基因同樣參與陸地棉抗病反應(yīng)的調(diào)控；但目前關(guān)于該基因家族在陸地棉抗黃萎病反應(yīng)中的功能研究尚無報道。

本研究通過前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選并克隆出一個細(xì)胞色素P450基因GhP450-94C1，該基因的ORF長度為1 503 bp，編碼500個氨基酸，分子式為C2597H4025N691O725S22，分子質(zhì)量為57.23 ku，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，所編碼蛋白為酸性、親水的不穩(wěn)定跨膜蛋白，有86.45%的概率存在信號肽；含有一個P450結(jié)構(gòu)域；此外該蛋白在結(jié)構(gòu)上含有24個α-螺旋和8個β-折疊。該基因響應(yīng)黃萎病菌V991侵染，可能在棉花抵御黃萎病菌入侵中發(fā)揮一定的功能；利用VIGS技術(shù)抑制該基因表達(dá)后降低了植株對黃萎病菌的抗性，其病情指數(shù)顯著高于陰性對照植株；剖稈檢測表明，與對照植株相比，沉默植株維管束的褐變程度更加嚴(yán)重；莖段恢復(fù)培養(yǎng)試驗表明，沉默植株莖段的真菌菌絲數(shù)量明顯多于對照植株。以上結(jié)果初步表明，GhP450-94C1基因是一個棉花抗黃萎病反應(yīng)的正調(diào)節(jié)因子，然而該基因的抗病分子機制及參與的抗病信號通路仍需深入探究。