色氨酸抑制體外模型中晚期糖基化終末產(chǎn)物形成機(jī)理

劉煒妍，鄭曉燕，楊 旸，鄭麗麗，艾斌凌，鐘 爽，校 導(dǎo)，盛占武,*，張偉敏,*

（1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站，海南 ?？?570102）

晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）是通過氨基酸的游離氨基和生物大分子（糖類、蛋白質(zhì)、核酸等）的游離羰基發(fā)生非酶褐變產(chǎn)生的一系列化合物。目前已發(fā)現(xiàn)的AGEs有20 種，依據(jù)熒光性特性可分為熒光AGEs和非熒光AGEs，其中Nε-羧甲基賴氨酸（Nε-carboxymethyllysine，CML）和Nε-羧乙基賴氨酸（Nε-carboxyethyllysine，CEL）是非熒光AGEs的重要代表[1]。已有研究表明，AGEs與許多人體慢性疾病息息相關(guān)，如糖尿病、腎臟疾病、阿爾茨海默癥、心腦血管疾病等[2-3]。約10%食源性AGEs能夠進(jìn)入人體血液循環(huán)，其中1/3通過腎臟排出，其余的2/3蓄積在腎臟中[4]。食源性AGEs的產(chǎn)生通常會(huì)受到食品成分、加工和貯藏方法等因素的影響[1,5]。控制食品中AGEs常見的方法有改進(jìn)加工工藝、調(diào)整食品配方或添加具有抑制作用的物質(zhì)等[5-6]，其中添加天然產(chǎn)物抑制劑被認(rèn)為是抑制AGEs形成的有效干預(yù)方法之一。目前國內(nèi)外研究較多的是在食品中添加植物多酚，如將迷迭香酸加入到高蛋白中間水分食品模型中以抑制AGEs產(chǎn)生[7]；在曲奇中添加根皮素可抑制AGEs的形成[8]；將兒茶素添加于食用醋中，可減少AGEs和5-羥甲基糠醛的產(chǎn)生[9]。雖然植物多酚抑制效果較好，但會(huì)影響食品感官品質(zhì)，如造成顏色加深、風(fēng)味改變等[10-11]。因此探尋一種安全、穩(wěn)定、有效的AGEs抑制劑對(duì)食品加工行業(yè)具有重要意義。

氨基酸因其同時(shí)具有氨基和羧基，從而可以通過捕獲美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物——活性二羰基化合物抑制AGEs的形成，如含硫氨基酸和富硫蛋白可以通過捕集電子化合物和中間體來減少或抑制AGEs的形成；其次，氨基酸還可抑制糖基化蛋白之間的交聯(lián)，進(jìn)而減少AGEs的生成，例如，精氨酸通過防止蛋白質(zhì)聚集和提高蛋白質(zhì)的溶解度來抵抗糖基化作用[12]。此外，氨基酸作為糖基化抑制劑，還能提升食品的風(fēng)味。在土豆模型體系中添加甘氨酸能夠促進(jìn)2,3-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪和2,5-二乙基-3-甲基吡嗪（熟土豆香氣的關(guān)鍵成分）的形成，提高總揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)量[13]；在對(duì)牛肉酶解液美拉德反應(yīng)模型研究中發(fā)現(xiàn)，最佳牛肉調(diào)味基料組合為半胱氨酸3.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、丙氨酸1.2%、甘氨酸1.2%、天冬氨酸1.05%[14]。因此，氨基酸有望成為一種既能減少AGEs形成又能改善食品風(fēng)味的食源性AGEs抑制劑。

目前關(guān)于氨基酸抑制AGEs形成的研究基本上都是針對(duì)內(nèi)源性AGEs，而對(duì)食品體系中AGEs的抑制鮮有報(bào)道。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)選取文獻(xiàn)中報(bào)道的可能具有抗糖基化作用的13 種氨基酸[12,15-17]，利用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）-果糖、BSA-丙酮醛（methylglyoxal，MGO）模型評(píng)估其抑制AGEs的能力，從中選出抑制效果最好的氨基酸，并建立美拉德反應(yīng)不同階段化學(xué)模型，即BSA-果糖模型、BSA-MGO模型、BSA-乙二醛（glyoxal，GO）模型和精氨酸（arginine，Arg）-MGO模型，分析氨基酸對(duì)熒光AGEs、CML和CEL的抑制效果，并進(jìn)一步探究其抑制機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

半胱氨酸（cystine，Cys）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、蛋氨酸（methionine，Met）、甘氨酸（glycine，Gly）、谷氨酸（glutamicacid，Glu）、精氨酸（Arg）、賴氨酸（lysine，Lys）、脯氨酸（proline，Pro）、色氨酸（tryptophan，Trp）、蘇氨酸（threonine，Thr）、天冬氨酸（asparticacid，Asp）、纈氨酸（valine，Val）、組氨酸（histidine，His）、GO（質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%溶液）、MGO（質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%溶液）上海源葉生物科技有限公司；BSA 中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；果糖 上海麥克林生化科技有限公司；氨基胍（amino guanidine，AG） 美國Sigma公司；甲酸（質(zhì)譜級(jí)）、乙腈（質(zhì)譜級(jí)） 上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、疊氮化鈉、硼氫化鈉、硼砂、三氯乙酸、丙酮、鹽酸、氨水均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B-2型恒溫生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；S20K型pH計(jì)、PL303 型電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；F-7000熒光分光光度計(jì)日本島津公司；DL SK-5/20旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JP-080B超聲清洗儀 深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；0.22 μm水系針筒過濾器 上海亞興試劑公司；SCIEX Triple Quad 6500+超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high liquid chromatograph-tandem mass spectrometer，UPLC-MS/MS）儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 氨基酸抑制劑的篩選

1.3.1.1 BSA-果糖模型的建立

利用BSA-果糖模型監(jiān)測(cè)BSA蛋白糖基化過程。用0.2 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.06%的疊氮化鈉，用于防止微生物生長(zhǎng)）分別配制1.5 mol/L的果糖和60 mg/mL BSA溶液。將1.5 mL BSA溶液和1.5 mL果糖溶液、0.5 mL氨基酸溶液（300 μg/mL）在帶有螺帽的10 mL試管中混勻后在50 ℃下反應(yīng)24 h。分別用0.5 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L、pH 7.4）和0.5 mL、300 μg/mL AG溶液代替氨基酸溶液作為空白和陽性對(duì)照。然后，通過F-7000熒光分光光度計(jì)在370 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和440 nm的發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定所有反應(yīng)溶液的熒光強(qiáng)度，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取其平均值，按式（1）計(jì)算AGEs抑制率。

式中：F氨基酸樣品組為氨基酸樣品組相對(duì)熒光強(qiáng)度；F空白組為空白組相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.3.1.2 BSA-MGO模型的建立

參考文獻(xiàn)[18]建立BSA-MGO糖基化模型以評(píng)估氨基酸捕獲AGEs中間體——活性二羰基化合物的能力。用0.2 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%疊氮化鈉）分別配制300 μg/mL氨基酸溶液、60 mmol/L MGO溶液和30 mg/mL BSA溶液。向試管中依次加入0.5 mL 300 μg/mL的氨基酸溶液和1.5 mL、60 mmol/L的MGO溶液，混勻后在37 ℃下反應(yīng)2 h，然后再加入1.5 mL質(zhì)量濃度為30 mg/mL的BSA溶液。在37 ℃下反應(yīng)3 d后，用F-7000熒光分光光度計(jì)在350 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和440 nm的發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定所有反應(yīng)溶液的熒光強(qiáng)度。分別用0.5 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L、pH 7.4）和0.5 mL、300 μg/mL AG溶液代替氨基酸溶液作為空白和陽性對(duì)照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值，按照公式（1）計(jì)算AGEs抑制率。

1.3.2 氨基酸對(duì)糖基化模型熒光性AGEs的抑制作用分析

1.3.2.1 BSA-果糖模型的建立

根據(jù)Sheng Zhanwu等[19]的研究方法并稍作修改建立BSA-果糖模型。用0.2 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（含0.02%疊氮化鈉）配制1.5 mol/L果糖溶液、60 mg/mL BSA溶液及（200、500、1 000、1 500 μg/mL和2 000 μg/mL）Trp溶液。向帶有螺帽的10 mL試管中分別加入1.5 mL BSA溶液、1.5 mL果糖溶液和0.5 mL不同質(zhì)量濃度的Trp溶液，混勻后在50 ℃條件下恒溫反應(yīng)24 h。分別用0.5 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L、pH 7.4）和0.5 mL AG溶液（質(zhì)量濃度同Trp）代替氨基酸溶液作為空白和陽性對(duì)照。然后，通過F-7000熒光分光光度計(jì)在370 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和440 nm的發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定所有反應(yīng)溶液的熒光強(qiáng)度，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值，按照公式（1）計(jì)算AGEs抑制率。

1.3.2.2 BSA-GO/MGO模型的建立

根據(jù)Shen Yixiao等[18]的研究方法并稍作修改建立BSA-GO/MGO模型。將0.5 mL的Trp溶液（200、500、1 000、1 500 μg/mL和2 000 μg/mL）或AG溶液（質(zhì)量濃度同Trp）（均由0.2 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液配制）分別與1.5 mL、60 mmol/L MGO或GO溶液混勻，隨后在37 ℃孵育2 h，然后再加入1.5 mL的30 mg/mL BSA溶液（所有反溶液均用0.2 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液配制）。在37 ℃下反應(yīng)3 d后，用F-7000熒光分光光度計(jì)在350 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和440 nm的發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定所有反應(yīng)溶液的熒光強(qiáng)度。分別用0.5 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L、pH 7.4）和0.5 mL AG溶液（質(zhì)量濃度同Trp）代替氨基酸溶液作為空白和陽性對(duì)照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值，按照公式（1）計(jì)算AGEs抑制率。

1.3.2.3 Arg-MGO模型的建立

Arg-MGO模型按照Sheng Zhanwu等[19]描述的方法建立并稍作修改。用0.2 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%疊氮化鈉）分別配制0.5 mL（200、500、1 000、1 500 μg/mL和2 000 μg/mL）Trp溶液、AG溶液（質(zhì)量濃度同Trp）和1.5 mL、60 mmol/L MGO溶液，Trp溶液和MGO溶液混勻后在37 ℃下反應(yīng)2 h，然后再加入1.5 mL、30 mg/mL的Arg溶液（由含有0.02%疊氮化鈉的0.2 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液現(xiàn)用現(xiàn)配）。在37 ℃下反應(yīng)3 d后，用F-7000熒光分光光度計(jì)在350 nm激發(fā)波長(zhǎng)和440 nm發(fā)射波長(zhǎng)下記錄熒光強(qiáng)度。用0.5 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L、pH 7.4）和0.5 mL質(zhì)量濃度同Trp的AG溶液分別代替氨基酸溶液作為空白和陽性對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值，按照公式（1）計(jì)算AGEs抑制率。

1.3.2.4 熒光AGEs熒光強(qiáng)度的測(cè)定

利用F-7000熒光分光光度計(jì)記錄添加和未添加Trp溶液的天然和糖基化的BSA熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)下從200～600 nm掃描發(fā)射光譜。帶寬、激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均設(shè)置為5.0 nm，掃描速率為2 400 nm/min。將所有樣品掃描3 次，計(jì)算熒光強(qiáng)度平均值。

1.3.3 氨基酸對(duì)非熒光性CML/CEL形成的抑制作用分析

參考Chen Yuanyuan等[20]的方法并作適當(dāng)?shù)男薷姆治霭被釋?duì)非熒光性CML/CEL形成的抑制作用，將上述BSA-果糖模型反應(yīng)體系溶液加入帶有螺帽的10 mL試管中，在50 ℃下恒溫反應(yīng)2 d，用不添加氨基酸的反應(yīng)體系溶液作為空白組。取0.2 mL反應(yīng)體系溶液、0.2 mL硼酸鹽緩沖液（0.2 mol/L、pH 9.2）和0.2 mL、2 mol/L的硼氫化鈉（利用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液現(xiàn)用現(xiàn)配），充分渦旋振蕩，置于4 ℃冰箱避光還原12 h。還原結(jié)束后，向樣品溶液中加入1 mL體積分?jǐn)?shù)20%三氯乙酸溶液，并在4 ℃、14 000×g的條件下離心10 min，棄去上清液，收集蛋白質(zhì)沉淀。使用200 μL、體積分?jǐn)?shù)5%丙酮溶液洗滌蛋白質(zhì)沉淀2 次，并用氮?dú)獯蹈伞＜尤? mL、6 mol/L的鹽酸，氮?dú)獗Ｗo(hù)，在110 ℃條件下水解24 h，然后氮吹除去鹽酸。將干燥的蛋白質(zhì)水解物重新溶于2 mL超純水中，取0.5 mL蛋白水解溶液通過固相萃取柱。固相萃取柱（Cleanert PCX，150 mg/6 mL）萃取條件如下：分別使用3 mL甲醇和3 mL蒸餾水依次通過固相萃取柱活化，上樣后按順序依次使用3 mL甲醇和3 mL蒸餾水對(duì)樣品進(jìn)行淋洗，使用6 mL氨化甲醇（V（甲醇）：V（氨水）＝95∶5）洗脫目標(biāo)化合物。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇后再重新溶解于2 mL的體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-水溶液中，使用0.22 μm的有機(jī)濾頭過濾后通過UPLC-MS/MS分析樣品，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值，按照公式（2）計(jì)算AGEs抑制率。

式中：ρ氨基酸樣品組為氨基酸樣品組樣品質(zhì)量濃度/（ng/mL）；ρ空白組為空白組樣品質(zhì)量濃度/（ng/mL）。

UPLC條件：色譜柱：X-Bridege C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；柱溫：30 ℃；運(yùn)行時(shí)間：5 min。流動(dòng)相A：0.2%甲酸-水溶液、B：乙腈。梯度洗脫條件：0～0.5 min，90% A；0.5～3.5 min，90%～40% A；3.5～4.5 min，40%～90% A；4.5～5.0 min，90% A。

MS/MS條件：將電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）離子源設(shè)置為正離子極性模式。采用多反應(yīng)監(jiān)控模式（multiple reaction monitoring，MRM）；離子源溫度300 ℃；錐孔電壓1.03×105Pa；毛細(xì)管電壓4 kV；MRM模式的設(shè)置：m/z205.0～84.2、m/z205.0～130.2、m/z219.0～84.2、m/z219.0～130.6。

1.3.4 UPLC-MS/MS鑒定色氨酸-羰基衍生物

參照Tang Yao等[21]的方法并略作修改鑒定Trp-羰基衍生物。將Trp和MGO溶解在新鮮制備的0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，定容至100 mL，使得Trp溶液和MGO溶液的終濃度均為10 mmol/L，取50 mL樣品溶液于錐形瓶中，在37 ℃、60 r/min的水浴恒溫振蕩器中振蕩。然后在30、60、120 min和16 h時(shí)取反應(yīng)樣品，于-80 ℃的冰箱中備用。

運(yùn)用UPLC-MS/MS對(duì)反應(yīng)后的衍生物進(jìn)行測(cè)定。UPLC條件：色譜柱：X-Bridege C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；運(yùn)行時(shí)間：8.5 min；流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-水溶液，B：體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈溶液。洗脫梯度：0～0.1 min，95% A；0.1～3.0 min，95%～25% A；3.0～7.0 min，25% A；7.0～8.0 min，25%～95% A；8.0～8.5 min，95% A。

MS/MS條件：離子化方式：ESI；毛細(xì)管電壓：1.8 kV；鞘氣：氮?dú)?，流速?5 psi；輔助氣流速：10 psi；高純度氬氣用作誘導(dǎo)碰撞解離（collision-induced dissociation，CID）及冷卻氣；CID中碰撞能量：35 eV；一級(jí)、二級(jí)離子掃描范圍：m/z190～1 000；儀器控制、數(shù)據(jù)采集及分析應(yīng)用UPLC-MS/MS solution 3.41軟件。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)，采用GraphPad Prism 5、ChemDraw 19.0、Origin 2019軟件作圖，采用SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，模型體系中添加和未添加氨基酸處理及AG對(duì)照組之間的抑制能力變化使用單因素方差分析檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后再用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，以P＜0.05為具有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 13 種氨基酸在抑制AGEs活性比較

BSA-果糖模型通常用于評(píng)估蛋白質(zhì)糖基化，在BSA-果糖模型中，果糖和果糖的氧化產(chǎn)物都與蛋白質(zhì)反應(yīng)生成AGEs。BSA-MGO模型通常用于評(píng)估蛋白質(zhì)糖基化的中間階段，因?yàn)槭÷粤藦奶堑紧驶霓D(zhuǎn)化[18,22]，MGO與蛋白質(zhì)的氨基酸殘基發(fā)生不可逆的反應(yīng)，最終導(dǎo)致AGEs的形成[23]。本研究利用BSA-果糖模型（圖1）與BSAMGO模型（圖2）評(píng)估13 種可能具有抗糖基化作用的氨基酸（Cys、Phe、Met、Gly、Glu、Arg、Lys、Pro、Trp、Thr、Asp、Val和His）[12,15-17]在抑制熒光AGEs形成方面的能力。在BSA-果糖模型中，除Glu和Asp外，其他11 種氨基酸均對(duì)BSA的早期糖基化表現(xiàn)出不同程度的抑制活性，這與以往的研究結(jié)果[22]一致。His對(duì)熒光AGEs的抑制效果最好，抑制率為15.02%，其次是Trp，抑制率為8.37%。氨基酸對(duì)BSA的早期糖基化表現(xiàn)出不同的抑制活性，這主要是由于早期糖基化過程中氨基酸對(duì)活性氧和早期糖基化產(chǎn)物果糖胺的抑制效果不同引起的[16-17]。這種在糖基化早期階段的抑制，有利于避免形成反應(yīng)性更高的中間產(chǎn)物（活性二羰基化合物）和毒性更高的AGEs。

圖1 BSA-果糖模型中13 種氨基酸對(duì)熒光AGEs抑制率的影響Fig.1 Inhibitory effects of 13 amino acids on the formation of fluorescent AGEs in BSA-fructose model

如圖2所示，在BSA-MGO模型中，13 種氨基酸只有7 種氨基酸（Glu、Lys、Pro、Trp、Thr、Val和His）具有抑制熒光AGEs形成的能力。其中，Trp的抑制活性最高，達(dá)到81.66%，其次是Gly和His，抑制率分別為77.10%和64.13%。這種差異可能是由于不同氨基酸對(duì)美拉德反應(yīng)期間產(chǎn)生的活性二羰基化合物捕獲能力不同，也可能是不同氨基酸中氨基數(shù)量不等，導(dǎo)致其在抗糖基化能力上存在差異[17]。已有研究證明，Trp衍生物吲哚及5-羥色胺具有良好的捕獲MGO、GO、2,3-丁二酮和2,3-戊二酮等醛類物質(zhì)的能力[24-25]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇具有較好熒光AGEs抑制效果的Trp進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 BSA-MGO模型中13 種氨基酸對(duì)熒光AGEs抑制率的影響Fig.2 Inhibitory effects of 13 amino acids on the formation of fluorescent AGEs in BSA-MGO model

2.2 Trp對(duì)BSA-果糖、BSA-MGO、BSA-GO及Arg-MGO模型體系中AGEs抑制率的影響

非酶糖基化是蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物大分子與還原糖之間發(fā)生的復(fù)雜美拉德反應(yīng)，可產(chǎn)生AGEs[26]。其中，AGEs含量可以直接反映美拉德反應(yīng)中生物大分子的羰基化程度[27]。鑒于此，本研究評(píng)價(jià)了Trp在BSA-果糖模型（早期糖基化）、BSA-MGO與BSA-GO模型（中期糖基化）以及Arg-MGO模型（易被MGO攻擊并引起不可逆蛋白質(zhì)修飾）體系中對(duì)熒光AGEs的抑制活性。如圖3A所示，在BSA-果糖模型中，Trp對(duì)熒光AGEs的抑制效果與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，在200～2 000 μg/mL之間，其抑制率從（-2.41±1.55）%增加到（15.82±1.36）%，抑制率較低，原因可能是Trp主要是通過作為羰基捕獲劑來實(shí)現(xiàn)對(duì)AGEs的抑制[24-25]，而在美拉德反應(yīng)初期，活性二羰基化合物的生成量還很低；因此，在美拉德反應(yīng)的初期，抑制效果并不是十分明顯。

在糖基化中間階段BSA-MGO和BSA-GO模型體系中，Trp對(duì)熒光AGEs的抑制也顯示出顯著的質(zhì)量濃度依賴性（P＜0.05）。如圖3B所示，在BSA-MGO模型中，在Trp質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)，對(duì)熒光AGEs的抑制率為（23.59±9.81）%，當(dāng)Trp質(zhì)量濃度增加到2 000 μg/mL時(shí)，其抑制率增加到（86.78±0.67）%。在質(zhì)量濃度分別為1 500 μg/mL和2 000 μg/mL時(shí)，Trp與陽性對(duì)照組（AG）對(duì)熒光AGEs的抑制率差異不明顯。如圖3C所示，在BSA-GO模型中，當(dāng)Trp質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)，對(duì)熒光AGEs的抑制率為（26.38±6.74）%，隨著Trp質(zhì)量濃度增加到2 000 μg/mL時(shí)，抑制率增加到（89.89±4.11）%，與陽性對(duì)照（AG）的抑制率差異不明顯。與BSA-MGO模型體系相比，Trp在BSA-GO模型體系中對(duì)熒光AGEs的抑制能力更強(qiáng)。相對(duì)于副作用較大的AG[12,15]，Trp作為無毒無害的天然AGEs抑制劑具有更大的優(yōu)勢(shì)。

如圖3D所示，在Arg-MGO模型中，含有Trp的反應(yīng)溶液對(duì)熒光AGEs的抑制率隨著質(zhì)量濃度的提高而增大，從200 μg/mL時(shí)的（11.79±3.36）%顯著增加到2 000 μg/mL時(shí)的（69.83±1.02）%（P＜0.05），此時(shí)，與陽性對(duì)照（AG）的抑制率差異明顯。以往的研究證明，某些氨基酸在糖基化的后期階段具有較強(qiáng)的AGEs抑制作用，如Asp可以與Arg殘基作用，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)；His結(jié)構(gòu)中的伯胺可以抵抗蛋白質(zhì)交聯(lián)[28]，此外，氨基乙?；彩前被嵋种铺腔脑蛑籟15,21]。圖3結(jié)果說明Trp在BSA-GO模型體系中的抑制效果最佳，其次是在BSA-MGO和Arg-MGO模型體系中，而在BSA-果糖模型中抑制效果較不明顯。因此，在糖基化中間階段具有較高熒光AGEs抑制能力的Trp，可以作為羰基化合物的有效清除劑，這與以往的研究結(jié)果[16]一致。

圖3 BSA-果糖（A）、BSA-MGO（B）、BSA-GO（C）和Arg-MGO（D）模型中Trp對(duì)熒光AGEs抑制率的影響Fig.3 Inhibitory effect of Trp on the formation of AGEs in BSA-fructose (A), BSA-MGO (B), BSA-GO (C) and Arg-MGO (D) models

2.3 Trp抑制BSA-果糖體系中CML及CEL形成的活性

CML和CEL是在美拉德反應(yīng)過程中產(chǎn)生的兩個(gè)典型的非交聯(lián)性AGEs[29]，也是非熒光AGEs的重要代表[30-31]。因此，本實(shí)驗(yàn)考察了Trp在BSA-果糖體系中對(duì)CML和CEL的抑制效果。結(jié)果如圖4、5所示，當(dāng)質(zhì)量濃度在200～1 000 μg/mL之間時(shí)，隨著Trp質(zhì)量濃度的提高，其對(duì)CML的抑制率從（-5.83±1.37）%增加到（41.81±12.05）%，繼續(xù)提高質(zhì)量濃度時(shí)，Trp對(duì)CML的抑制率又呈現(xiàn)出顯著的下降趨勢(shì)；當(dāng)質(zhì)量濃度為2 000 μg/mL時(shí)，對(duì)CML的抑制率降低到（6.35±0.50）%。因此，不同質(zhì)量濃度Trp對(duì)CML抑制率的影響大體上呈鐘形曲線趨勢(shì)，在1 000 μg/mL時(shí)，Trp對(duì)CML的抑制率達(dá)到最大，為（41.81±12.05）%。與CML相比，體系中CEL的含量相對(duì)較少（圖4），但Trp對(duì)CEL的抑制趨勢(shì)與CML的基本一致。當(dāng)質(zhì)量濃度從200 μg/mL提高到1 000 μg/mL時(shí)，Trp對(duì)CEL的抑制率達(dá)到最大值（（38.41±3.16）%），當(dāng)繼續(xù)提高Trp質(zhì)量濃度時(shí)，抑制率呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)（P＜0.05），質(zhì)量濃度達(dá)2 000 μg/mL時(shí)，抑制率降低至（9.16±5.34）%。已有研究證明，GO是CML形成的中間產(chǎn)物，MGO是CEL形成的中間產(chǎn)物[31-32]，一些氨基酸可以通過清除醛類物質(zhì)（如GO、MGO）的方式來抑制AGEs的形成[22]。因此，Trp可能是通過捕獲活性二羰基化合物（GO、MGO）的方式來抑制CML和CEL的產(chǎn)生，這與4 個(gè)模型體系中Trp對(duì)熒光性AGEs的抑制情況一致。

圖4 CML（A）及CEL（B）的離子色譜圖Fig.4 Ion chromatogramas of Nε-carboxymethyllysine (CML) (A) and Nε-carboxyethyllysine (CEL) (B)

圖5 BSA-果糖模型中Trp對(duì)CML及CEL抑制率的影響Fig.5 Inhibitory effect of Trp on fluorescent CML and CEL in BSA-fructose model

2.4 UPLC-MS/MS鑒定Trp-羰基衍生物

以往的文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道，氨基酸和一些短肽具有抗糖基化活性[28]。因此，為進(jìn)一步證實(shí)上述研究結(jié)果中的推測(cè)，厘清Trp抑制AGEs形成的原因，本研究利用UPLCMS/MS分析并鑒定Trp與MGO反應(yīng)的產(chǎn)物。本研究共測(cè)得4 個(gè)加合產(chǎn)物，具體如表1與圖6所示。根據(jù)檢測(cè)到的4 種主要產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量，提出了兩種可能的反應(yīng)途徑（圖7）。路徑1為Trp與MGO在C3位置發(fā)生親電子芳香取代反應(yīng)，在2.93 min時(shí)生成Trp-單-MGO加合物（[M+Na]+＝299.200）。路徑2是在37 ℃生理?xiàng)l件下（0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中），Trp在脫水后首先通過Pictet-Spengler縮合反應(yīng)在1.89 min時(shí)產(chǎn)生脫水Trp-單-MGO加合物（[M+K]+＝297.200），而后又經(jīng)過親電子芳香取代和Pictet-Spengler反應(yīng)在2.19 min時(shí)生成Trp-雙-MGO加合物（[M+H]+＝331.200），最后在2.20 min時(shí)進(jìn)一步發(fā)生Pictet-Spengler縮合反應(yīng)產(chǎn)生Trp-三-MGO加合物（[M+H]+＝403.200）。Trp捕獲MGO的方式與文獻(xiàn)報(bào)道的某些Trp衍生物類似，例如，Trp熱解產(chǎn)物吲哚可以在吲哚的C2和C3位置與醛類物質(zhì)發(fā)生親電芳香取代反應(yīng)[24]；5-羥色胺可以通過Pictet-Spengler縮合路徑形成5-羥色胺-MGO加合物[21]。結(jié)果表明，Trp可以通過芳香親電子取代和Pictet-Spengler反應(yīng)形成4 種Trp-MGO加合物，進(jìn)而減少以MGO為前體物質(zhì)的AGEs的產(chǎn)生，其最高捕獲MGO能力為3 mol（圖6D），這與熒光AGEs、CML和CEL的研究結(jié)果一致。

圖6 不同反應(yīng)時(shí)間下提取的4 種Trp-MGO加合產(chǎn)物離子色譜圖和MS/MS光譜Fig.6 Ion chromatograms and tandem mass spectra of four Trp-MGO adducts extracted at different reaction times

圖7 Trp與MGO反應(yīng)生成Trp-MGO衍生物的模擬反應(yīng)路徑Fig.7 Possible reaction pathways for the reaction between tryptophan and MGO

表1 不同反應(yīng)時(shí)間下提取的Trp-MGO加合產(chǎn)物的ESI-MS/MS碎片離子Table 1 ESI-MS/MS fragment ions of Trp-MGO adducts at different reaction times

3 結(jié) 論

在本研究中，Trp對(duì)熒光AGEs、非熒光AGEs（CML和CEL）的形成均具有抑制作用，Trp在BSA-果糖、BSA-MGO、BSA-GO和Arg-MGO模型中的抗糖基化能力呈質(zhì)量濃度依賴性。在這4 種模型中，Trp在美拉德反應(yīng)中間階段BSA-GO模型對(duì)熒光AGEs表現(xiàn)出最高的抑制率，抑制率可達(dá)89.89%，其次是在BSA-MGO模型和Arg-MGO模型。在Trp對(duì)CML和CEL抑制研究中發(fā)現(xiàn)，Trp對(duì)CML和CEL的抑制趨勢(shì)與熒光AGEs的趨勢(shì)不同，Trp質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)抑制率最大，Trp抑制趨勢(shì)呈鐘形曲線。利用UPLC-MS/MS對(duì)Trp與MGO反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析，共鑒定出4 個(gè)加合產(chǎn)物，分別為2 個(gè)Trp-單-MGO加合物、1 個(gè)Trp-雙-MGO加合物以及1 個(gè)Trp-三-MGO加合物。Trp可以通過芳香親電子取代和Pictet-Spengler反應(yīng)的方式來捕獲MGO，進(jìn)而抑制AGEs的形成，其最高捕獲能力為3 mol。