亞臨界流體萃取高效脫除枸杞中的農(nóng)藥殘留

沈藝楠，王云，劉星汶，趙云鵬，張尚微，楊繼國(guó),*

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.華南協(xié)同創(chuàng)新研究院，廣東東莞 523808）

枸杞（Lycium barbarum）作為一種傳統(tǒng)中藥材，其生物活性成分在抗腫瘤[1]、抗氧化、抗炎[2]、改善腸道微環(huán)境[3]等方面具有重要作用。由于枸杞生長(zhǎng)過(guò)程中易受到病蟲害威脅而導(dǎo)致其產(chǎn)量降低，人們?cè)诜N植過(guò)程中廣泛使用有機(jī)磷類、菊酯類等農(nóng)藥[4]，使得農(nóng)藥使用量超標(biāo)現(xiàn)象日益明顯，嚴(yán)重影響其品質(zhì)和使用安全。目前國(guó)內(nèi)外均頒布了相關(guān)藥典對(duì)中藥材農(nóng)藥殘留限量進(jìn)行了規(guī)定，我國(guó)在2015版的《藥典》第四部中新增了“第五法 藥材及飲片（植物類）中禁用農(nóng)藥多殘留測(cè)定法”，以及33項(xiàng)關(guān)于中藥材農(nóng)殘監(jiān)控項(xiàng)目[5]。國(guó)家對(duì)農(nóng)殘的監(jiān)管力度日益加大[6]，解決枸杞等中藥材中農(nóng)藥殘留問(wèn)題具有重大意義。

目前，對(duì)于枸杞等中藥材農(nóng)藥殘留的脫除方法主要包括化學(xué)法、生物法和物理法[7]。首先，化學(xué)法是采用化學(xué)試劑降解農(nóng)藥成分以降低其毒性，但常用試劑如臭氧、過(guò)氧化氫等殘留會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的二次污染問(wèn)題[8]。生物法脫除農(nóng)藥殘留是指利用天然微生物、基因工程菌等將農(nóng)藥大分子分解為小分子化合物，具有較高廣譜性，但是基因工程價(jià)格昂貴，且中間代謝產(chǎn)物復(fù)雜，難以分析其毒性和生物安全性。物理法如傳統(tǒng)的儲(chǔ)藏法、炮制法脫除殘留農(nóng)藥的范圍有限，僅分別適用于性質(zhì)不穩(wěn)定、易分解和熱敏感農(nóng)藥[9]；上世界八十年代超臨界流體萃取技術(shù)（SFE）開始用于農(nóng)藥殘留的脫除，它是利用物質(zhì)在臨界壓力和溫度以上時(shí)溶解力更強(qiáng)的特性來(lái)萃取農(nóng)藥分子[10]，但該方法要求操作壓力范圍為15～30 MPa，致使其設(shè)備成本及運(yùn)行能耗偏高，不適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)[11]。

亞臨界萃取技術(shù)是通過(guò)控制一定壓力和溫度，使萃取劑處于亞臨界狀態(tài)，此時(shí)的萃取劑具有較好的滲透性和溶解性，可更好的萃取分離目標(biāo)產(chǎn)物[12]。由于其操作溫度范圍在20～60 ℃，壓力控制0.3～0.8 MPa，故可有效避免對(duì)物料本身造成傷害，是一種綠色環(huán)保、節(jié)能安全的萃取分離技術(shù)。目前它被廣泛應(yīng)用于油脂[13]、植物色素[14]、香精[15]等的提取，在脫除農(nóng)藥殘留方面也有涉及，但多數(shù)研究局限于蔬菜和水果[16-18]、茶葉[19]、環(huán)境[20]中農(nóng)藥殘留檢測(cè)，而對(duì)于中藥材中農(nóng)藥殘留脫除應(yīng)用較少。張民等[21]利用亞臨界丙烷萃取脫除人參提取物中有機(jī)氯農(nóng)藥，研究表明，在萃取壓力為8 MPa、65 ℃下萃取120 min，溶劑流量為2.94 kg/h的條件下，可幾乎完全脫除γ-HCH、op-DDT，對(duì)TCNB、pp-DDT、DDE脫除率大于60%。此外還有秦廣雍等[22]、劉智謀等[23]進(jìn)行了相關(guān)研究，但也都僅限于中藥材人參中有機(jī)氯農(nóng)藥的脫除。由于中藥材種植過(guò)程使用的農(nóng)藥種類繁多且極性復(fù)雜，而現(xiàn)階段亞臨界萃取脫除農(nóng)殘多是采用單一溶劑、針對(duì)單一種類農(nóng)藥，缺乏對(duì)不同種類農(nóng)藥多殘留的脫除研究。因此本實(shí)驗(yàn)以中藥材枸杞為原料，添加植物種植過(guò)程中常見的7種不同極性的農(nóng)藥（理化性質(zhì)具體見表1），采用混合萃取劑丁烷和乙醇，以改善萃取劑極性，擴(kuò)大脫除農(nóng)藥極性范圍，探究其對(duì)該7種農(nóng)藥的脫除效果，以建立適用性更廣、更高效的亞臨界流體脫除中藥材中農(nóng)藥殘留的方法。

表1 七種不同農(nóng)藥的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of seven different pesticides

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

農(nóng)藥均為市購(gòu)，包括有機(jī)磷類（毒死蜱）、菊酯類（氯氟氰菊酯、氯氰菊酯）、殺菌劑類（多菌靈）、煙堿類（吡蟲啉）、苯基吡唑類（氟蟲腈）、氨基甲酸酯類（克百威）；枸杞，批號(hào)為 KPGQGG-18-47，來(lái)自青?？灯丈锟萍脊煞萦邢薰?；無(wú)水乙醇（食品級(jí)）、正丁烷（分析純）、濃硫酸，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙醇（色譜純），上海麥克林生化科技有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18 MΩ.cm）

1.2 儀器與設(shè)備

LCMS8045型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；BJ-150型高速多功能粉碎機(jī)，德清拜杰電器有限公司；IX73型熒光顯微鏡，日本 OLYMPUS；BSA-224S型分析天平，德國(guó)賽多利斯；T-9000型電子天平，常熟雙杰測(cè)試儀器廠；200 L亞臨界流體萃取小試系統(tǒng)，河南亞臨界萃取技術(shù)研究院有限公司。

1.3 方法

1.3.1 亞臨界流體脫除中藥材枸杞中農(nóng)藥殘留工藝流程

首先將枸杞置于萃取罐中，關(guān)閉進(jìn)料口，抽真空使萃取罐內(nèi)壓力降至0.01 MPa以下后，加入液化亞臨界流體溶劑進(jìn)行萃取。待萃取結(jié)束后，萃取物和萃取劑一起進(jìn)入溶劑分離罐。通過(guò)減壓回收分離罐中的萃取劑，回收后的萃取劑可以循環(huán)使用，萃取物通過(guò)分離罐底部排料口排出。

1.3.2 試驗(yàn)樣品制備

將7種不同類型的農(nóng)藥分別溶解于80%乙醇溶液中得到農(nóng)藥混合液，控制乙醇中不同類型的農(nóng)藥濃度為GB 2763-2019標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的檢出限的10倍，其中氟蟲腈的濃度以NY/T 1379-2007標(biāo)準(zhǔn)中檢出限的10倍來(lái)計(jì)。

將枸杞浸沒(méi)于上述農(nóng)藥混合液中，枸杞與農(nóng)藥混合液質(zhì)量比為1:1，5 s后取出物料，晾干后裝于塑料袋中，密封，待檢。

1.3.3 不同種類農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法

不同種類農(nóng)藥殘留檢測(cè)送至廣州中科檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，具體檢測(cè)方法參照《中國(guó)藥典》2015版第四部農(nóng)藥多殘留量測(cè)定法-質(zhì)譜法，最低檢出限除氯氰菊酯為0.025 mg/kg以外，其它均為0.005 mg/kg。

1.3.4 亞臨界流體脫除枸杞中農(nóng)殘的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

采用常見的亞臨界丁烷單一溶劑和不同比例的亞臨界丁烷-乙醇混合溶劑（丁烷:乙醇為1:1、2:1、10:1（m/m））進(jìn)行萃取，以篩選合適的亞臨界脫農(nóng)殘的溶劑，并以未經(jīng)過(guò)亞臨界萃取處理的枸杞作為空白對(duì)照，測(cè)定并計(jì)算亞臨界處理前后農(nóng)殘的脫除率，在張民等[21]前人所探究的工藝條件基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室設(shè)備允許工藝參數(shù)范圍，設(shè)置亞臨界流體脫除中藥材農(nóng)殘因素水平，分別考察不同萃取溫度（20、30、40、60 ℃）、萃取時(shí)間（20、30、40、60 min）、萃取次數(shù)（1、2、3次）對(duì)7種農(nóng)殘脫除率的影響。

1.3.4.2 亞臨界流體脫除枸杞中高濃度農(nóng)藥殘留的工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

將樣品枸杞分別按照7種農(nóng)藥的最高檢出限100倍濃度添加農(nóng)藥，利用上述單因素試驗(yàn)條件進(jìn)行亞臨界流體脫除農(nóng)藥殘留試驗(yàn)以驗(yàn)證該工藝對(duì)枸杞中不同種類高濃度農(nóng)藥殘留的脫除效果。

1.4 亞臨界萃取處理對(duì)枸杞理化指標(biāo)的影響

表面結(jié)構(gòu)觀察：利用熒光顯微鏡，將未經(jīng)過(guò)亞臨界流體脫農(nóng)殘?zhí)幚?、處理后的干枸杞均勻切片，分別置于顯微鏡玻片上進(jìn)行外表面的觀察。

水分、枸杞多糖、甜菜堿等指標(biāo)檢測(cè)方法參照《中國(guó)藥典》（2015版）第四部通則。

1.5 數(shù)據(jù)分析

本文采用Excel 2016和Origin 2018對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行組。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 萃取溶劑對(duì)不同種類農(nóng)殘脫除率的影響

針對(duì)不同極性大小的農(nóng)藥，分別使用單一溶劑丁烷、不同比例丁烷-乙醇混合溶劑（1:1、2:1、10:1）（m/m）對(duì)中藥材枸杞進(jìn)行亞臨界脫農(nóng)殘?zhí)幚?，其它條件為溶料比2:1（m/m），萃取溫度30 ℃，時(shí)長(zhǎng)40 min，萃取次數(shù)1次。所得不同種類農(nóng)藥的脫除率如圖1所示。

整體來(lái)看，添加乙醇能夠顯著改變亞臨界流體的極性，進(jìn)而擴(kuò)大農(nóng)藥脫除范圍，這與超臨界提取多酚物質(zhì)的原理相似[24]。在未添加乙醇的情況下，由于亞臨界萃取溶劑丁烷的極性限制，農(nóng)藥克百威的脫除效果最差。隨著乙醇含量的增加，萃取溶劑的極性發(fā)生變化，7種農(nóng)藥的脫除率均有所上升，在丁烷:乙醇為2:1（m/m）時(shí)，克百威、氟蟲腈、氯氟氰菊酯和毒死蜱的脫除率分別為100%、92.59%、90.41%、93.58%。當(dāng)丁烷:乙醇為10:1（m/m）時(shí)，各種農(nóng)藥的脫除率變化不大。因此，綜合實(shí)際成本考慮選擇丁烷:乙醇為2:1（m/m）為最佳溶劑比。

2.1.2 萃取溫度對(duì)不同種類農(nóng)殘脫除率的影響

采用萃取劑丁烷:乙醇2:1（m/m），在料液比為2:1（m/m）、萃取時(shí)長(zhǎng)40 min、次數(shù)為1的條件下，控制萃取溫度分別為 20、30、40、60 ℃，考察溫度對(duì)枸杞中7種農(nóng)殘脫除效果的影響。已知隨著溫度的升高，溶質(zhì)的溶解度增大，分子熱運(yùn)動(dòng)速率加快，分子間相互碰撞幾率也會(huì)增大，農(nóng)藥分子脫除率上升。由圖 2可知，在20～30 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，7種農(nóng)藥的脫除率整體上呈上升趨勢(shì)，且在30 ℃時(shí)克百威、氟蟲腈、氯氟氰菊酯的脫除率達(dá)到最高，分別為100%、91.24%、91.77%。溫度超過(guò)30 ℃時(shí)，部分農(nóng)藥的脫除率下降，可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高導(dǎo)致枸杞內(nèi)部功效成分枸杞油和枸杞色素在萃取劑中溶解，進(jìn)而影響了農(nóng)藥的脫除效果。綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)能耗問(wèn)題，選擇30 ℃為最佳萃取溫度。

2.1.3 萃取時(shí)間對(duì)不同種類農(nóng)殘脫除率的影響

采用溶劑丁烷:乙醇 2:1（m/m），在料液比為 2:1（m/m）、萃取溫度為30 ℃、次數(shù)為1的條件下，控制萃取時(shí)間分別為20、30、40、60 min，考察不同時(shí)長(zhǎng)對(duì)枸杞中7種農(nóng)殘脫除效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。當(dāng)萃取時(shí)間由20 min增加到40 min時(shí)，農(nóng)藥的脫除率均不同程度的上升，克百威、氟蟲腈和氯氟氰菊酯的最高脫除率可分別達(dá)98.57%、93.66%和92.85%。隨著萃取時(shí)間延長(zhǎng)，農(nóng)藥的脫除率基本不變或略有下降，說(shuō)明溶劑已和樣品表面充分接觸，溶解趨于飽和或者樣品遭到重復(fù)污染，致使農(nóng)藥殘留量增加，這與張民等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[21]。因此綜合選擇40 min為最佳萃取時(shí)間。

2.1.4 萃取次數(shù)對(duì)不同種類農(nóng)殘脫除率的影響

采用溶劑丁烷:乙醇 2:1（m/m），在料液比為 2:1（m/m）、萃取時(shí)長(zhǎng)40 min、萃取溫度30 ℃的條件下，控制萃取次數(shù)分別為1、2、3次，考察萃取次數(shù)對(duì)枸杞中7種農(nóng)殘脫除效果的影響。由圖4可以看出對(duì)于農(nóng)藥克百威萃取1次脫除率即可達(dá)到100%，其它農(nóng)藥在萃取第二次時(shí)，脫除率均有所增加，說(shuō)明萃取劑繼續(xù)溶解農(nóng)藥，而在萃取第三次時(shí)，各種農(nóng)殘的脫除率基本保持不變，說(shuō)明枸杞表面大部分的農(nóng)殘經(jīng)過(guò)前兩次萃取基本已脫除完全。綜合經(jīng)濟(jì)成本，選擇兩次為最佳萃取次數(shù)。

2.2 亞臨界流體脫除枸杞中高濃度農(nóng)藥殘留的工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

采用溶劑丁烷:乙醇 2:1（m/m），在料液比為 2:1（m/m）、萃取時(shí)間40 min、溫度30 ℃、萃取2次的條件下，考察亞臨界流體對(duì)添加7種高濃度農(nóng)藥的枸杞農(nóng)藥殘留脫除情況，具體結(jié)果見下表。由表2可以看出，農(nóng)藥克百威、氟蟲腈、氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、毒死蜱、吡蟲啉和多菌靈的脫除率均在80%以上?？偟膩?lái)看，上述亞臨界流體萃取技術(shù)對(duì)脫除中藥材枸杞中農(nóng)藥殘留具有較好效果。

表2 亞臨界流體對(duì)枸杞中不同種類農(nóng)藥殘留的脫除效果Table 2 Effect of subcritical fluid on the removal of pesticide residues in Lycium barbarum

表3 亞臨界萃取處理對(duì)枸杞水分、多糖等生化成分的影響（%）Table 3 Effect of subcritical extraction treatment on water and polysaccharide of Lycium barbarum

2.3 亞臨界萃取處理對(duì)枸杞理化指標(biāo)的影響

2.3.1 亞臨界萃取處理對(duì)枸杞生化成分的影響

采用溶劑丁烷:乙醇 2:1（m/m），在料液比為 2:1（m/m）、萃取時(shí)間40 min、溫度30 ℃、萃取2次的條件下對(duì)枸杞進(jìn)行亞臨界脫除農(nóng)殘?jiān)囼?yàn)，然后對(duì)處理前后枸杞中成分進(jìn)行檢測(cè)，具體結(jié)果見表3。經(jīng)t檢驗(yàn)，p＞0.05，這表明亞臨界流體脫除農(nóng)藥殘留對(duì)枸杞中的主要生化成分影響不顯著。

2.3.2 亞臨界萃取處理對(duì)枸杞表面結(jié)構(gòu)的影響

采用溶劑丁烷:乙醇2:1（m/m），在料液比為2:1（m/m）、萃取時(shí)間40 min、溫度30 ℃、萃取2次的條件下對(duì)中藥材枸杞進(jìn)行亞臨界脫除農(nóng)殘?jiān)囼?yàn)，然后對(duì)處理前后的枸杞進(jìn)行表面結(jié)構(gòu)觀察（見圖5、6）。采用熒光顯微鏡放大100、200倍觀察可知，除脫除農(nóng)殘后枸杞表面褶皺紋路有舒展外，其表面結(jié)構(gòu)無(wú)明顯區(qū)別。亞臨界流體脫除農(nóng)殘是一種對(duì)物料外觀無(wú)影響，可保證產(chǎn)品品質(zhì)的無(wú)損溫和脫除技術(shù)。

3 結(jié)論

為廣泛探究亞臨界流體萃取技術(shù)對(duì)中藥材農(nóng)藥殘留的脫除效果，本實(shí)驗(yàn)以添加了7種不同種類、不同極性農(nóng)藥的枸杞為原料，在萃取劑丁烷:乙醇為 2:1（m/m），料液比為2:1（m/m）、萃取時(shí)間40 min、溫度30 ℃、萃取2次的條件下對(duì)枸杞進(jìn)行亞臨界流體脫除農(nóng)殘?jiān)囼?yàn)，克百威、氯氟氰菊酯、氯氰菊酯和毒死蜱的脫除率均在90%以上，分別為95.53%、92.73%、93.58%和93.41%，而吡蟲啉、多菌靈和氟蟲腈的脫除率也均在85%以上，分別為86.61%、89.04%和89.59%。枸杞中多糖、甜菜堿和水分的損失率分別為4.50%、4.41%和0.54%，處理前后含量基本不變，顯微鏡下觀察枸杞表面結(jié)構(gòu)也沒(méi)有明顯變化。前人研究中，羅金鳳等[25]采用不同清洗劑對(duì)水果中農(nóng)殘毒死蜱、氯氰菊酯進(jìn)行洗脫，最高脫除率為33%和34%；韓玉謙等[26]利用超臨界 1,1,1,2-四氟乙烷萃取技術(shù)脫除人參中殘留農(nóng)藥，對(duì)有機(jī)氯農(nóng)藥脫除率可達(dá)91.5%。對(duì)比本文可見，亞臨界流體萃取技術(shù)對(duì)枸杞中農(nóng)藥殘留達(dá)到了較高的脫除效果。因此，亞臨界流體萃取技術(shù)對(duì)于脫除中藥材枸杞中各類農(nóng)藥具有廣泛適用性。本文為廣泛脫除中藥材農(nóng)藥殘留提供了一定的數(shù)據(jù)支撐，也為企業(yè)進(jìn)一步開發(fā)利用枸杞等中藥材資源提供了安全保障。