多功能針式過(guò)濾器-高效液相色譜法快速檢測(cè)豆芽中的吲哚乙酸

覃國(guó)新，閆飛燕，周其峰，李慧玲，勞水兵，楊玉霞，莫仁甫，羅麗紅，陳泳锨，何潔，韋宇寧，王海軍

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部甘蔗品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(南寧)，廣西南寧 530007）

豆芽作為人們?nèi)粘２妥郎系氖卟酥?，其營(yíng)養(yǎng)豐富，富含維生素C、維生素A、氨基酸、膳食纖維等有易于人體健康的成份，深受人們的喜愛(ài)[1]。然而，為了提高豆芽產(chǎn)量，有不法商販在豆芽種植生產(chǎn)過(guò)程中濫用添加劑（如植物激素、化學(xué)試劑、抗生素等），致使有關(guān)“毒豆芽”的事件時(shí)有報(bào)道，使人們對(duì)食用豆芽存在一定的安全隱患。由于植物激素能參與調(diào)控植物生長(zhǎng)和發(fā)育的全過(guò)程[2-4]，成為了不法商販主要濫用的添加劑之一。吲哚乙酸（Indole acetic acid，IAA）作為重要的植物激素之一，對(duì)植物的生長(zhǎng)、分化起著極其重要的調(diào)節(jié)控制作用[5,6]。在豆芽種植過(guò)程中使用IAA不僅能促進(jìn)豆芽生長(zhǎng)發(fā)育縮短生產(chǎn)周期，而且能提高產(chǎn)量，但是盲目或者過(guò)量的使用該植物激素，勢(shì)必會(huì)造成環(huán)境污染、殘留量超標(biāo)、危害人們身體健康等與“毒豆芽”事件息息相關(guān)的問(wèn)題[7,8]。然而，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)尚未規(guī)定吲哚乙酸在豆芽中的殘留限量值，也未查到豆芽中吲哚乙酸殘留檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。因此，建立簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的方法檢測(cè)豆芽中吲哚乙酸殘留尤為重要。

目前，測(cè)定吲哚乙酸的方法主要有酶聯(lián)免疫分析法[9]、化學(xué)發(fā)光分析法[10]、氣相色譜法[11]、高效液相色譜法[12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]等。其中，酶聯(lián)免疫分析方法雖然儀器操作簡(jiǎn)單且分析速度快，但容易造成假陽(yáng)性，定性和定量同時(shí)存在問(wèn)題；化學(xué)發(fā)光分析法背景干擾較大且檢測(cè)過(guò)程操作較復(fù)雜；氣相色譜法需要柱前衍生，明顯增加了影響因素；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)具有高靈敏度和高選擇性好的優(yōu)勢(shì)[14]，但面臨儀器購(gòu)置和運(yùn)行成本高昂等問(wèn)題，難以實(shí)現(xiàn)普及；高效液相色譜分析法因具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性可靠、儀器較容易普及等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。但由于豆芽樣品本身存在一定的基質(zhì)干擾，按傳統(tǒng)固相萃取凈化方法前處理，操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，難于滿足大批樣品的快速檢測(cè)需求。

QuEChERS前處理技術(shù)是2003年由Anastassiades等開(kāi)發(fā)并用于植物源性食品中農(nóng)藥多殘留檢測(cè)的樣品前處理，因其具有簡(jiǎn)單、快速、有效、可靠等優(yōu)點(diǎn)而獲得廣泛應(yīng)用[15,16]。近年來(lái)，水果和蔬菜中農(nóng)藥多殘留色譜分析檢測(cè)一般都選擇 QuEChERS方法進(jìn)行樣品前處理[17,18]，而多功能針式過(guò)濾器（F-QuEChERS）是基于QuEChERS原理，在通過(guò)式固相固相萃取凈化的基礎(chǔ)上[19]，將提取溶液的凈化和過(guò)濾集于一步完成而建立的色譜分析樣品前處理方法，不僅具有QuEChERS方法的優(yōu)點(diǎn)，而且還節(jié)省了振搖凈化和離心的多個(gè)環(huán)節(jié)。將多功能針式過(guò)濾器方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)固相萃取凈化方法，不僅能簡(jiǎn)化繁瑣的步驟，縮短樣品前處理時(shí)間，而且能有效降低樣品本身帶來(lái)的基質(zhì)效應(yīng)，從而有效解決傳統(tǒng)固相萃取凈化方法操作繁瑣費(fèi)時(shí)的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，基于F-QuEChERS原理，建立了多功能針式過(guò)濾器-高效液相色譜（HPLC）法快速檢測(cè)豆芽中的吲哚乙酸，方法操作簡(jiǎn)便，快速準(zhǔn)確，能滿足豆芽中吲哚乙酸殘留快速檢測(cè)的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀配置有二級(jí)管陣列檢測(cè)器，美國(guó) Waters公司；色譜柱 XDB-C18（4.6 mm×250，5 μm），Agilent；DS-1 型高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)模儀器廠；LD5-2A型低速離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司；多功能針式過(guò)濾器F-QuEChERS（含150 mg MgSO4、50 mg乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）PSA、50 mg十八烷基鍵合相硅膠（C18）、5 mg石墨化碳黑（GCB）），天津阿爾塔科技有限公司。

吲哚乙酸（純度≥99.6%，m/m），上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司；甲酸、乙酸、乙腈（色譜純），賽默飛世爾（中國(guó)）科技有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量的吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成濃度為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備容液；準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈稀釋成濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液；接著用乙腈逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，配制得到0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L系列的乙腈標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品的前處理

提?。喝⌒迈r豆芽試樣（購(gòu)于本地市場(chǎng)）用組織搗碎機(jī)搗碎并混勻后，準(zhǔn)確稱取10.00 g，加入10.0 mL 1%乙酸乙腈提取液，渦旋提取2 min后，再加入1 g氯化鈉、2 g無(wú)水硫酸鎂后，接著渦旋提取1 min，最后以4000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，收集上清液待凈化。

凈化：取上述上清液1.5 mL以2滴/s的速度通過(guò)多功能針式過(guò)濾器F-QuEChERS于進(jìn)樣瓶中，供高效液相色譜測(cè)定。

1.4 高效液相色譜的檢測(cè)條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm），Agilent；柱溫：35 ℃；流速 1.0 mL/min；進(jìn)樣量10.0 μL。流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：0.1%甲酸溶液。梯度洗脫程序?yàn)椋?～2.0 min，10% A；2.0～3.0 min，10%～40% A；3.0～4.0 min，40% A；4.0～5.0 min，40%～80% A；5.0～6.0 min，80% A；6.0～7.0 min，80%～40% A；7.0～8.0 min，40% A；8.0～9.0 min，40%～10% A；9.0～10.0 min，10% A；檢測(cè)波長(zhǎng)：267 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

眾所周知，農(nóng)藥殘留檢測(cè)樣品前處理通常使用的提取溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等。根據(jù)目標(biāo)農(nóng)藥的理化性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了甲醇、乙腈、酸化甲醇及酸化乙腈作為提取溶劑對(duì)目標(biāo)物的提取效果，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲醇和乙腈對(duì)吲哚乙酸都有較好的提取效率，但甲醇提取所得成分更復(fù)雜，提取液較難凈化，檢測(cè)干擾較大。而吲哚乙酸在酸性條件下提取效果更好，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究表明，1.0%的乙酸乙腈提取樣品中的吲哚乙酸，其回收率達(dá)到80%以上，均比其它幾種溶劑的提取效果好。因此，實(shí)驗(yàn)以濃度為1.0%的乙酸乙腈作為提取溶劑。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)比了甲醇和乙腈作為高效液相色譜法的流動(dòng)相時(shí)的分離效果，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用乙腈時(shí)得到響應(yīng)值較高且的峰形較好；同時(shí)，考察不同濃度甲酸水溶液（0.01%、0.05%、0.1%、0.5%）為流動(dòng)相的響應(yīng)效果，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲酸水溶液濃度為0.1%時(shí)得到的峰形及響應(yīng)值均最佳，且在優(yōu)化的色譜條件下，待測(cè)植物激素在豆芽基質(zhì)中能達(dá)到良好的基線分離（分離色譜圖如圖1所示），因此，選擇了乙腈-0.1%甲酸溶液作為分離分析的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，由圖可見(jiàn)，豆芽基質(zhì)不干擾目標(biāo)物的分離測(cè)定。

2.3 凈化方式的選擇

高效液相色譜法分析植物源性樣品的農(nóng)藥殘留，色譜分析容易受樣品基質(zhì)的干擾，從而影響檢測(cè)的靈敏度及準(zhǔn)確性。因此，選擇合適的樣品前處理凈化方式極其重要。多功能針式過(guò)濾器主要是基于QuEChERS原理，將凈化材料（PSA、C18、GCB等）填充于帶有有機(jī)濾膜的一次性注射針管筒中，以簡(jiǎn)化樣品前處理過(guò)程，具有QuEChERS的簡(jiǎn)單、快速、可靠、有效等特點(diǎn)，有效提高樣品前處理的效率，適合大批量樣品的分析檢測(cè)。本研究采用酸化乙腈渦旋提取2 min后，加入適量氯化鈉和無(wú)水硫酸鎂，再繼續(xù)渦旋提取 1 min，離心后，上清液直接經(jīng)多功能針式過(guò)濾器凈化以吸附蛋白質(zhì)、色素等干擾物質(zhì)，和傳統(tǒng)的固相萃取凈化方式相比，本方法將凈化方式縮減到一步完成，明顯提高了檢測(cè)效率。

2.4 實(shí)際樣品基質(zhì)效應(yīng)的考察

在實(shí)際樣品的分析檢測(cè)過(guò)程中，采用同一種前處理方法處理不同的樣品，樣品基質(zhì)仍然會(huì)對(duì)同一目標(biāo)物產(chǎn)生不同的干擾。本實(shí)驗(yàn)采用了基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值（ME），來(lái)評(píng)價(jià)豆芽基質(zhì)對(duì)吲哚乙酸色譜分析的基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)ME越接近于1時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)就越小。方法如下：取不含待測(cè)物的豆芽空白樣品，經(jīng)“1.3”方法進(jìn)行前處理，得到樣品提取凈化液，接著用此凈化液稀釋100 mg/L的吲哚乙酸溶液，配成濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作容液。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣分析，以吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度作為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的峰面積作為縱坐標(biāo)進(jìn)行制作基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，吲哚乙酸在豆芽提取凈化液中的基質(zhì)效應(yīng)較?。∕E=0.98），因此，本實(shí)驗(yàn)選擇純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行外標(biāo)法定量。

表1 豆芽中吲哚乙酸的基質(zhì)效應(yīng)Table 1 Matrix effects of indoleacetic acid in matrix of bean sprout

表2 實(shí)際樣品中吲哚乙酸殘留量回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 2 Spike recovery rates for indoleacetic acid (n=6)

2.5 方法的線性范圍、檢出限及定量下限

本研究在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定“1.2”節(jié)配制的系列吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吲哚乙酸在0.05～10.0 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9999。以3倍信噪比所對(duì)應(yīng)的吲哚乙酸濃度來(lái)確定檢出限（LOD），以10倍信噪比所對(duì)應(yīng)的吲哚乙酸濃度來(lái)確定定量限（LOQ），計(jì)算得吲哚乙酸在豆芽基質(zhì)中的檢出限（LOD）為0.03 μg/kg，定量下限（LOQ）為 0.1 μg/kg。

2.6 回收率及精密度

取市售未檢出吲哚乙酸的豆芽為空白樣品，按“1.2”節(jié)進(jìn)行前處理。按低、中、高3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，對(duì)比多功能針式過(guò)濾器凈化方法（F-QuEChERS）和固相萃取凈化方法（SPE）兩種前處理方式。在10 g勻漿樣品中吲哚乙酸添加0.1、0.5、5.0 mg/kg 3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果如表2所示，吲哚乙酸在豆芽中2種凈化方式的平均添加回收率范圍分別為80.6%～105.3%和78.5%～98.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為 1.8%～4.6%和2.9%～5.2%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)-QuEChERS和SPE的方法回收率和精密度都能滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求，但F-QuEChERS方法操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，適合大批樣品的快速檢測(cè)。

2.7 實(shí)際樣品的檢測(cè)

從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買10份豆芽樣品，按照本研究新建立的方法對(duì)豆芽中的吲哚乙酸進(jìn)行測(cè)定，10份樣品均未檢出吲哚乙酸殘留。

3 結(jié)論

本研究基于QuEChERS前處理技術(shù)，將多功能針式過(guò)濾器用于樣品前處理，將凈化和過(guò)濾集于一體，報(bào)道了HPLC方法檢測(cè)豆芽中吲哚乙酸殘留量，以乙腈和0.1%甲酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)267 nm，該方法操作簡(jiǎn)潔、快速、準(zhǔn)確、可靠。將多功能針式過(guò)濾器用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)樣品前處理，不僅能有效除去蛋白質(zhì)、色素等樣品基質(zhì)的干擾物質(zhì)，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)研究中吲哚乙酸能保持較高的回收率，有效提高了檢測(cè)效率，適用于批量豆芽樣品中吲哚乙酸殘留的快速檢測(cè)。