二苯乙烯化合物的提取工藝優(yōu)化及其酪氨酸酶抑制活性

李紫微，梁鈺，陳曉曼，吳安萍，吳曉翔，阿卜杜拉·玉蘇普，劉果，程金生，蔣文明，曹庸，苗建銀*

（1.新疆特色藥食用植物資源化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆喀什 844000）（2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）（3.韶關(guān)學(xué)院英東食品學(xué)院，廣東韶關(guān) 512015）

隨著人們生活水平的提高，食物除了需要滿足基本的營(yíng)養(yǎng)需求外，還期望能夠在預(yù)防某些疾病中發(fā)揮有益作用。全球人口老齡化、慢性疾病的增加和當(dāng)下新型冠狀病毒肺炎的爆發(fā)等眾多社會(huì)問題，使人們逐漸意識(shí)到健康維護(hù)、保健養(yǎng)生的重要性，預(yù)計(jì)在2030年我國的健康市場(chǎng)行業(yè)需求可達(dá)到16萬億人民幣[1]。越來越多的研究表明，食用水果和蔬菜直接對(duì)健康有很大的益處，其有益影響歸因于水果和蔬菜中的各種抗氧化劑，主要包括多酚、類胡蘿卜素、抗壞血酸等[2]。近年來，研究者們從植物中提取多酚化合物做了大量研究，旨在尋求天然來源的抗氧化活性物質(zhì)[3,4]。

氧化過程是人體必不可少的生理變化，氧化自由基的過度產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致皮膚疾病，加速衰老。酪氨酸酶是人體黑色素生成的關(guān)鍵酶，酪氨酸酶的過量表達(dá)會(huì)引起黃褐斑等多種皮膚疾病，導(dǎo)致皮膚老化。因此，研究人員致力于研發(fā)可用于食品和化妝品的低毒有效的酪氨酸酶抑制劑。Oh等[5]提取山葡萄根提取物發(fā)現(xiàn)，提取物是通過二苯乙烯類化合物對(duì)酪氨酸酶產(chǎn)生抑制效果。

二苯乙烯類是許多植物產(chǎn)生的重要次生代謝產(chǎn)物，屬于植物多酚中的一大類化合物[6]。值得注意的是，包括白藜蘆醇、氧化白藜蘆醇及其二苯乙烯衍生物的天然二苯乙烯類化合物在近些年被廣泛研究。因?yàn)檫@些植物化學(xué)物質(zhì)具有抗癌、抗炎、抗菌和抗氧化等多種重要的生物活性而受到廣泛的關(guān)注[7]。其中最具代表性的白藜蘆醇作為近幾年熱點(diǎn)研究的植物化學(xué)物質(zhì)，在食品，藥品和化妝品等眾多領(lǐng)域都有良好的應(yīng)用價(jià)值，被認(rèn)為是一種最有希望預(yù)防癌癥的化合物之一[8]。目前，白藜蘆醇的主要來源是葡萄和虎杖等少數(shù)植物，且價(jià)格昂貴限制了它的市場(chǎng)發(fā)展。氧化白藜蘆醇是一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，與白藜蘆醇相比，在2位上多了一個(gè)羥基，因此，被認(rèn)為具有比白藜蘆醇更強(qiáng)的生物活性[9]。白藜蘆醇苷作為白藜蘆醇的糖苷形式，其對(duì)心血管的保護(hù)作用引起了廣泛關(guān)注，并且在腸道糖苷酶的作用下，白藜蘆醇苷可轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇[10]。因此，本研究將以氧化白藜蘆醇、白藜蘆醇和白藜蘆醇苷這三個(gè)二苯乙烯化合物的典型代表作為研究對(duì)象。

基于前期的研究發(fā)現(xiàn)植物桑的桑果、桑枝和桑根中，桑根來源的二苯乙烯化合物含量最為豐富。?？浦参镉捎诰哂胸S富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能而受到人們的廣泛青睞，桑白皮作為藥食同源的原料之一往往能很好的被利用，但其桑根部分常常被丟棄，這不僅造成資源的浪費(fèi)，而且引起嚴(yán)重的環(huán)境污染。為了合理開發(fā)和利用桑根資源，本研究以二苯乙烯化合物含量為依據(jù)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化富集提取工藝條件，并探討最佳富集條件下二苯乙烯化合物提取物的體外抗氧化、酪氨酸酶抑制活性，為開發(fā)具有抗氧化和美白效果的保健食品和化妝品提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

新鮮桑根采自廣東省英德市。將桑根用水清洗并于50 ℃烘箱烘24 h至干燥，粉碎過40目篩，隨后密封于塑料袋中，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

乙醇、石油醚，乙酸乙酯均為分析純，天津富宇精細(xì)化工廠；乙腈，甲醇均為色譜純，上海阿拉丁生化科技有限公司；氧化白藜蘆醇（≥98%），白藜蘆醇（≥98%），白藜蘆醇苷（≥98%），多酚氧化酶（25 KU），L-酪氨酸，上海源葉生物科技有限公司；ABTS（2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽，≥98%），DPPH（2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基，≥98%），熊果苷（≥98%），上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

AL104萬分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DHG-9030A電熱恒溫干燥箱，上海恒一儀器有限公司；WZ-100恒溫水浴鍋，上海申生科技有限公司；119型中藥粉碎機(jī)，浙江溫嶺市藥材機(jī)械廠；LC-10A分析型高效液相色譜儀，島津儀器（中國）有限公司；Enspire2300多功能酶標(biāo)儀，美國PerkinElmer公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 桑根二苯乙烯化合物提取物的富集制備

取3 g桑根粉末，按照料液比1:15（g/mL）的比例向樣品中加入80%的乙醇溶液，并于避光條件下超聲提取兩次，每次30 min。收集濾液，然后用布氏漏斗進(jìn)行抽濾，將濾液減壓濃縮至10 mL并向其中加入NaCl至析出，靜至20 min。再次過濾，收集的濾液于4 ℃下靜置10 h。然后向其中加入90 mL的石油醚靜置2 h后，過濾，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)皿去除石油醚。然后向提取液中加入40 mL的乙酸乙酯水溶液（V/V=1:1）進(jìn)行萃取。取上層（乙酸乙酯層）過濾蒸發(fā)至干，用50%甲醇溶液溶解所得濃縮物，最后利用超高速真空離心干燥機(jī)去除甲醇后冷凍干燥，制得富含二苯乙烯化合物的凍干樣品，-20 ℃下保存。富含二苯乙烯化合物提取物得率計(jì)算如下式：

式中：

W——富含二苯乙烯化合物提取物得率，%；

m1——富含二苯乙烯化合物凍干樣的質(zhì)量，g；

m2——桑根粉末的質(zhì)量，g。

1.3.2 二苯乙烯化合物的成分分析及含量測(cè)定

采用島津LC-10A分析型高效液相色譜（HPLC）測(cè)定三種二苯乙烯化合物成分。色譜條件為 Innoval C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)器：紫外分光檢測(cè)器（SPD），306 nm和328 nm處進(jìn)行檢測(cè)；流動(dòng)相組成：0.1%磷酸水（A）和乙晴（B）；梯度洗脫程序：0～20 min，17%～25% B；20～40 min，25%～28% B；40～75 min，28%～45% B；75～85 min，45%～95% B；85～95 min，95%～95% B；95～100 min，95%～17% B。以標(biāo)準(zhǔn)品在色譜柱上的保留時(shí)間為對(duì)照，判斷各化合物成分。利用面積歸一化法，根據(jù)最大吸收峰確定各化合物含量。

質(zhì)譜條件：ESI離子源，負(fù)離子模式，電噴霧電壓-4.5 kV，離子源溫度500 ℃，霧化氣流速采用中等流速，離子化電壓5.5 kV，噴霧器電壓20 psi。采用負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，掃描范圍m/z100～500。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別考察提取時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）、料液比（1:10、1:15、1:20、1:25）和乙醇濃度（75%、80%、85%、90%）3個(gè)因素對(duì)桑根中二苯乙烯化合物含量的影響。去除雜質(zhì)步驟按照方法1.2.1進(jìn)行。

1.3.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇提取時(shí)間（A）、料液比（B）和乙醇濃度（C）作為影響因素進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design of Box-Behnken

1.3.5 抗氧化能力的測(cè)定

1.3.5.1 DPPH自由基抗氧化實(shí)驗(yàn)

DPPH自由基清除能力的測(cè)定參考Miao等的方法[11]，并稍作修改。取100 μL稀釋至合適濃度樣品溶液（0.05、0.1、0.2、0.25、0.5 mg/mL）于96孔酶標(biāo)板中，加入100 μL 2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液，震蕩1～2 min，室溫避光靜置30 min，然后在517 nm處測(cè)定樣品組吸光度At，樣品與溶劑混合液組吸光度Ar，乙醇代替樣品的空白組吸光度A0，DPPH自由基清除能力按下式計(jì)算。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

并采用SPSS軟件計(jì)算樣品的IC50值，其中，IC50值越小，則表示清除DPPH自由基的能力越強(qiáng)。

1.3.5.2 ABTS自由基抗氧化實(shí)驗(yàn)

ABTS自由基清除能力的測(cè)定參考 Miao等的方法[11]，并稍作修改。取100 μL稀釋至合適濃度樣品溶液（0.05、0.1、0.2、0.25、0.5 mg/mL）于96孔酶標(biāo)板中，加入100 μL ABTS工作液充分混合，于37 ℃避光靜置10 min后在734 nm處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度At，樣品與溶劑混合液的吸光度Ar，乙醇代替樣品空白組的吸光度A0，ABTS自由基清除能力按下式計(jì)算。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

并采用SPSS軟件計(jì)算樣品的IC50值，其中，IC50值越小，則表示清除ABTS自由基的能力越強(qiáng)。

1.3.6 酪氨酸抑制活性的測(cè)定

酪氨酸抑制活性的測(cè)定參考 Deveci[12]和 Lim[13]等的方法，并稍作修改。吸取40 μL不同濃度樣品（0.5、2.5、5、10、20 μg/mL）于96孔酶標(biāo)板中，加入80 μL PBS（pH 6.8）和40 μL L-Tyr底物溶液于37 ℃的恒溫箱孵育10 min后，迅速加入40 μL預(yù)熱過的酪氨酸酶啟動(dòng)反應(yīng)。在475 nm處測(cè)定反應(yīng)液0 min和30 min的吸光度A。同時(shí)，以熊果苷作為陽性對(duì)照組。按照下式計(jì)算樣品液對(duì)酪氨酸酶的抑制率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

式中：

A1——加底物和樣品溶液組；

A2——加樣品溶液，不加底物組；

A3——加底物，不加樣品組；

A4——既不加樣品也不加底物組。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert.V8.0.6.1和SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，p＜0.05則認(rèn)為樣品間具有顯著性差異，所得結(jié)果進(jìn)一步用Excel 2016作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)二苯乙烯物質(zhì)含量的影響

如圖1所示，提取時(shí)間在0.5～1.5 h內(nèi)，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，桑根中二苯乙烯化合物的含量也隨之增加，當(dāng)提取時(shí)間高于1.5 h后，化合物含量開始下降。這是因?yàn)闀r(shí)間過長(zhǎng)，提取過程產(chǎn)生了多余的熱量，導(dǎo)致二苯乙烯化合物分解。相似的研究也認(rèn)同這一原因，如：Xuan等人優(yōu)化提取時(shí)間對(duì)花青素含量的影響發(fā)現(xiàn)，提取時(shí)間從45 min至90 min時(shí)，花青素含量急劇從6.67 mg/g下降至5.65 mg/g[14]；楊丹等[15]發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間過長(zhǎng)，桂花果皮多酚提取量下降。因此，本研究選擇1.5 h繼續(xù)優(yōu)化提取工藝條件。

2.1.2 料液比對(duì)二苯乙烯物質(zhì)含量的影響

由圖2可知，隨著提取液體積的增加，二苯乙烯化合物的含量也在增加，當(dāng)料液比為1:15時(shí)，提取化合物含量最大，之后隨著料液比的增加提取化合物含量反而減少。這是因?yàn)樵谝欢舛确秶鷥?nèi)，增加溶劑用量，可將未充分溶解的二苯乙烯化合物擴(kuò)散至溶劑中[3,16]。但是當(dāng)料液比達(dá)到 1:15（g/mL）的飽和狀態(tài)時(shí)，化合物含量不再增加，這是因?yàn)樘崛∪軇┯昧吭黾訒?huì)導(dǎo)致二苯乙烯化合物濃度降低，從而使分子間作用力減弱，降低穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致含量稍降低。正如Rinku等人優(yōu)化甜菜渣中甜菜堿的提取工藝時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著料液比從1:15增加到1:30，酚類物質(zhì)濃度顯著下降，認(rèn)為是提取溶劑濃度較高時(shí)稀釋了溶液所致[17]。因此，此研究選擇當(dāng)料液比為1:15作為最低水平進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.3 乙醇濃度對(duì)二苯乙烯物質(zhì)含量的影響

由圖3可知，桑根中二苯乙烯化合物的含量隨乙醇濃度提高而提高。乙醇濃度在75%～85%時(shí)，隨乙醇濃度提高，二苯乙烯化合物的含量提高速度較快，乙醇濃度高于85%后，二苯乙烯化合物的含量提高速度減慢。原因在于隨著提取液中乙醇濃度的提高，其他脂溶性物質(zhì)和二苯乙烯化合物競(jìng)爭(zhēng)溶解從而其含量提取速度減慢。相似的研究也認(rèn)同這一原因，如朱沛沛等人發(fā)現(xiàn)殘茶多酚得率在乙醇濃度為50%時(shí)提取率最高，認(rèn)為可能原因是其他物質(zhì)與多酚發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)溶解[18]。因此，本研究進(jìn)一步的工藝優(yōu)化試驗(yàn)選擇85%乙醇為宜。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodologies

根據(jù)單因素試驗(yàn)，繼續(xù)選擇提取時(shí)間（A），料液比（B），乙醇濃度（C）三個(gè)因素為響應(yīng)設(shè)計(jì)變量，設(shè)置3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)共有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中5個(gè)中心點(diǎn)，12個(gè)析因點(diǎn)，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

2.2.2 方差分析與顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert.軟件對(duì)表2響應(yīng)面的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到二苯乙烯化合物含量（Y）對(duì)對(duì)自變量提取時(shí)間（A），料液比（B），乙醇濃度（C）的多元二次回歸方程為：Y=1833.83-116.46×A-91.17×B+191.83×C+318.32×A×B-3.13×A×C+482.93×B×C+12.46×A2+422.5×B2+297.23×C2

為了檢驗(yàn)回歸方程的可靠性，進(jìn)一步確定各因素對(duì)二苯乙烯化合物含量的影響程度，對(duì)回歸模型進(jìn)行了方差分析。由表3可知，二次模型的p＜0.05，是顯著的，說明模型是有意義的，失擬項(xiàng)F=2.35，失擬項(xiàng)誤差不顯著，失擬項(xiàng)P=0.2138＞0.05，說明該方程擬合度較好。模擬系數(shù)R2=0.89＞0.8，說明該模型能夠很好解釋的各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，結(jié)果可靠。并且表3表明，一次項(xiàng)C、交互項(xiàng)AB、二次項(xiàng)C2對(duì)二苯乙烯化合物的提取含量影響顯著；交互項(xiàng) BC、二次項(xiàng)B2對(duì)二苯乙烯化合物的提取含量影響極顯著。此外，由F值檢驗(yàn)可獲得影響二苯乙烯化合物提取含量的主次因素：料液比（B）＞提取時(shí)間（A）＞乙醇濃度（C）。

最后由圖4的二苯乙烯化合物提取含量的殘差分布圖可以看出，17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)基本分布在同一條直線上，表明各響應(yīng)值之間相關(guān)性良好，該模型可以用其確定最佳提取工藝條件[19]。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析與最優(yōu)條件驗(yàn)證

利用Box-Behnken分析各因素交互作用，擬合出響應(yīng)面3D圖，更直觀描述各因素之間的交互作用對(duì)二苯乙烯化合物提取含量的影響，結(jié)果如圖5～7所示。

由圖5～7可知，在交互項(xiàng)對(duì)二苯乙烯化合物提取含量的影響中，提取時(shí)間與乙醇濃度、提取時(shí)間與料液比交互作用明顯，表現(xiàn)為響應(yīng)面曲面更為陡峭，響應(yīng)值變化較大；乙醇濃度與料液比交互作用影響較小，表現(xiàn)為響應(yīng)面曲面較為平緩，響應(yīng)值變化較小。此結(jié)果與表3中方差分析所得結(jié)果一致。

根據(jù)模型預(yù)測(cè)，從桑根中富集二苯乙烯化合物的最佳提取工藝為：提取時(shí)間1.025 h，料液比1:20，乙醇濃度90%。此時(shí)理論的可從桑根中提取三種二苯乙烯化合物含量為 2958.84 μg/g?？紤]到實(shí)驗(yàn)條件的可操作性，將最佳提取工藝條件調(diào)整為：提取時(shí)間1 h，料液比1:20，乙醇濃度90%。在此條件下，從3 g的桑根原料粉末中得到307 mg富含三種二苯乙烯化合物的提取物，提取物得率為10.23%。并且從桑根中提取得到的二苯乙烯化合物含量為2959.2 μg/g，與預(yù)測(cè)理論值僅相差0.36%，說明響應(yīng)值法優(yōu)化得到富集二苯乙烯化合物的最佳提取工藝條件可行、可信，可為純天然來源的二苯乙烯化合物的開發(fā)利用提供借鑒。

2.3 桑根中三種二苯乙烯化合物含量分析及結(jié)構(gòu)鑒定

三種二苯乙烯化合物（氧化白藜蘆醇、白藜蘆醇和白藜蘆醇苷）的標(biāo)準(zhǔn)品和富含三種二苯乙烯化合物提取液的高效液相色譜分析見圖8。為進(jìn)一步確認(rèn)化合物，此研究通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)二苯乙烯化合物提取液的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，根據(jù)各化合物的保留時(shí)間和特征質(zhì)譜信息，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比確認(rèn)富集得到的三種二苯乙烯化合物，結(jié)果見表4。

最優(yōu)提取富集條件下的桑根二苯乙烯化合物提取物通過高效液相色譜定量分析，并將化合物含量換算成干桑根原料和提取液中的三種二苯乙烯的含量見表5?？梢钥闯?，桑根中氧化白藜蘆醇、白藜蘆醇、白藜蘆醇苷的含量分別為 2923.59、32.45、3.15 μg/g。通過富集提取，可將在二苯乙烯化合物提取物中的氧化白藜蘆醇、白藜蘆醇、白藜蘆醇苷的含量分別提升至為 28569.326、317.131、30.816 μg/g。相比于桑根原料，二苯乙烯化合物提取物中氧化白藜蘆醇、白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量約是原料的10倍，這表明此研究的提取方法達(dá)到了很好的富集二苯乙烯化合物的效果。同時(shí)提取物中氧化白藜蘆醇含量最豐富，是不同品種石斛甲醇提取物的179.7～3048.4倍[22]。另外，桑根中的氧化白藜蘆醇含量也比其他植物來源的豐富，比如，不同產(chǎn)地的金剛藤（0.02～2.24 mg/g）[23]等。因此，桑根可作為高活性化合物氧化白藜蘆醇的重要天然來源之一。

表4 三種二苯乙烯化合物的高效液相分析與質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息Table 4 High performance liquid chromatography and mass spectrometry data information and confirmation of three stilbene compounds

表5 三種二苯乙烯化合物的含量分析Table 5 Content analysis of three stilbene compounds

2.4 抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基的清除能力

由圖9可知，隨著富含二苯乙烯化合物提取物濃度的增加，DPPH自由基的清除率也在增加，且各濃度之間有顯著性差異（p＜0.05）。樣品濃度從 0.05 mg/mL提高至0.5 mg/mL，其對(duì)DPPH自由基的清除率由46.20%上升至94.97%，這表明二苯乙烯化合物提取物有很好的抗氧化活性。同時(shí)計(jì)算得到富含二苯乙烯化合物提取物對(duì)DPPH自由基清除作用的IC50值為0.063 mg/mL。從IC50值分析發(fā)現(xiàn)，提取物的DPPH自由基清除作用效果明顯優(yōu)于覆盆子（IC50=0.82 mg/mL）[24]，和多種藥用植物如野甘草（IC50=1.02 mg/mL）和木橘（IC50=0.97 mg/mL）[25]等提取物。

2.4.2 ABTS自由基的清除能力

從圖10可以看出，富含二苯乙烯化合物提取物對(duì)ABTS自由基的清除率隨濃度增加而逐漸增加，清除ABTS自由基能力與濃度存在一定的量效關(guān)系。且所測(cè)樣品濃度范圍（0.05～0.5 mg/mL）清除ABTS自由基能力均大于80%，0.5 mg/mL的二苯乙烯化合物提取物的清除ABTS自由基率達(dá)到98.59%。同時(shí)計(jì)算得到樣品對(duì) ABTS自由基清除作用的 IC50值為 0.008 mg/mL。從清除ABTS自由基的IC50值分析，富含二苯乙烯化合物提取物的抗氧化活性顯著優(yōu)于山蒼子水提取物（IC50=149.82 μg/mL）[26]和苜蓿醇提物（IC50=12.33 μg/mL）[27]，甚至強(qiáng)于一些純化合物，比如橘皮苷（IC50=8.1 μg/mL）[28]，樺木酸（IC50=105 μg/mL）[29]等。這可能是由于富集的二苯乙烯化合物發(fā)揮了重要的抗氧化能力協(xié)同作用[30]。

2.5 對(duì)酪氨酸的抑制活性

酪氨酸酶又稱多酚氧化酶，可參與人體黑素細(xì)胞黑素生成的調(diào)節(jié)過程，多個(gè)研究表明天然植物提取物可通過抑制酪氨酸酶活性和體外抗氧化能力來抑制黑色素形成[31,32]。由圖11可知，富含二苯乙烯化合物提取物表現(xiàn)出具有極好的抑制酪氨酸酶效果，其抑制能力與樣品濃度呈良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。在 0.5～20 μg/mL的樣品濃度內(nèi)，富含二苯乙烯化合物提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制率分別達(dá)到9.76%、49.06%、77.08%、80.35%、96.00%。且在相同濃度時(shí)，相比于陽性對(duì)照品熊果苷，樣品表現(xiàn)更強(qiáng)的抑制酪氨酸酶活性。0.5～20 μg/mL的熊果苷對(duì)酪氨酸酶的抑制率為 3.19%、19.33%、23.03%、48.07%、50.59%。計(jì)算兩者抑制酪氨酸酶的IC50值分別為2.514 μg/mL和15.551 μg/mL，提取物抑制酪氨酸酶活性的 IC50僅約為熊果苷的16.00%，這表明富含二苯乙烯化合物提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制效果非常顯著得高于熊果苷，分析原因可能是提取物中的三類二苯乙烯化合物在酪氨酸酶抑制方面起到了協(xié)同增效的作用。同時(shí)，富含二苯乙烯化合物提取物的抑制酪氨酸酶活性明顯強(qiáng)于其他植物提取物，比如接力草提取物（IC50=9 μg/mL）[33]和草莓根提取物（IC50=533.69 μg/mL）[34]，甚至強(qiáng)于一些純化合物比如黑松中提取的原花色素（IC50=37.64 μg/mL）[35]。此外，其他研究表明酚類物質(zhì)可在提取物的體系中對(duì)酪氨酸酶活性起主導(dǎo)作用，并且可作為抗黑色素的天然來源添加到藥物和化妝品中[36]。由此可知，富含二苯乙烯化合物提取物具有美白效果，有望適用于美白類化妝品的開發(fā)。

3 結(jié)論

本研究利用桑根作為富集二苯乙烯化合物的原料來源，確定了最佳富集提取工藝，使得桑根提取物中的三種二苯乙烯化合物含量得到顯著提升。同時(shí)，最佳提取工藝條件下的富含二苯乙烯化合物提取物表現(xiàn)出很好的清除DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和抑制酪氨酸酶活力，并表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。綜上所述，本研究能有效提高三種二苯乙烯化合物（氧化白藜蘆醇、白藜蘆醇和白藜蘆醇苷）的含量，這將對(duì)實(shí)現(xiàn)桑根的綜合利用與其活性化合物的開發(fā)研究提供重要的參考價(jià)值，后期將深入探究富含二苯乙烯化合物提取物的抗氧化、美白相關(guān)的活性機(jī)制。