交聯(lián)殼聚糖水凝膠的分子結(jié)構(gòu)差異與其控釋性能關(guān)系

黃靄珺，項(xiàng)拓，梁剛強(qiáng)，楊婧雯，吳潔儀，葉盛英，司徒文貝

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510641）

隨著社會(huì)的發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越重視食品的營(yíng)養(yǎng)健康。功能性食品中具有特殊效應(yīng)活性物質(zhì)，與諸多慢性疾病預(yù)防密切相關(guān)，因而受到廣泛關(guān)注[1]。但在加工儲(chǔ)運(yùn)及胃腸道運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中，活性蛋白類功能因子面臨水分、溫度、pH值等條件的不利影響[2,3]，為提高此類功能因子的生物利用度，需要運(yùn)用一定的載體材料對(duì)其進(jìn)行包載[4]，如纖維素、殼聚糖、玉米醇溶蛋白等[5,6]。

在眾多的天然材料中，殼聚糖是以β-(1,4)糖苷鍵連接的帶正電荷的多糖，由于其具有良好的生物相容性和降解性，物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定性，在自組裝復(fù)合材料、生物聚合物膜和藥物遞送載體等方面有廣泛的應(yīng)用[7]。目前，殼聚糖及其衍生物可用作生物活性化合物載體，以克服上消化道中不利的生理?xiàng)l件影響（如：低pH值胃酸、各種消化酶），提高藥物及活性物質(zhì)的生物利用率[8]。此外，在低于pH 6.5的酸性水溶液中，CS主鏈上的氨基質(zhì)子化[9]，可與三聚磷酸鈉、檸檬酸鈉等交聯(lián)劑形成靜電連接，生成水凝膠網(wǎng)絡(luò)[10]。交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)可包載蛋白質(zhì)、多肽[11]、小分子藥物和DNA片段[12]，以保護(hù)活性物質(zhì)，避免外界環(huán)境的侵蝕。有研究表明，交聯(lián)過(guò)程中，離子強(qiáng)度對(duì)殼聚糖基水凝膠中的活性物質(zhì)釋放有顯著影響[13]。Sang等[14]以三聚磷酸鈉（tripolyphosphate，TPP）、植酸和六偏磷酸鈉（sodium hexametaphosphate，SHMP）為交聯(lián)劑，制備了可用于粘膜給藥的殼聚糖納米粒。與TPP相比，植酸或SHMP交聯(lián)的納米粒具有更高的包封率和更低的釋放率。司徒文貝等[15]以三聚磷酸為交聯(lián)劑，對(duì)殼聚糖進(jìn)行改性，獲得交聯(lián)殼聚糖水凝膠骨架片，研究表明改性后的交聯(lián)殼聚糖可有效抵御胃酸腐蝕，能明顯降低模型功能因子在胃液中前期的釋放率，顯示出對(duì)活性物質(zhì)遞送的能力。

殼聚糖經(jīng)交聯(lián)后，其微觀結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，從而影響水凝膠的控釋性能。前人的研究多從pH、離子強(qiáng)度等對(duì)水凝膠的包載性能、控釋性能進(jìn)行探討，較少對(duì)水凝膠制備過(guò)程中水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)、控釋性能變化進(jìn)行探討。因此，本文選擇TPP和SHMP兩種常用的離子交聯(lián)劑，對(duì)分子量為150,000 g/mol的殼聚糖進(jìn)行交聯(lián)，控制交聯(lián)劑濃度，獲得具有不同微觀結(jié)構(gòu)的交聯(lián)殼聚糖水凝膠，對(duì)其鏈結(jié)構(gòu)、結(jié)晶結(jié)構(gòu)、熱性能、溶脹性能和釋放性能等進(jìn)行測(cè)定，探討在制備過(guò)程中殼聚糖水凝膠微觀結(jié)構(gòu)變化與其釋放性能之間的相互作用規(guī)律，為殼聚糖基載體材料在功能食品中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖，上海凱揚(yáng)生物科技有限公司，分子量150,000 g/mol；牛血清白蛋白（BSA），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；三聚磷酸鈉（TPP），廣州西龍化工有限公司，分析純；六偏磷酸鈉（SHMP），廣州西龍化工有限公司，分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器，金壇市城東新瑞儀器廠，型號(hào)HJ-6；高速離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司，型號(hào)H/T16MM；EYELA冷凍干燥機(jī)，上海愛朗儀器有限公司，型號(hào)FDU-1200；FT-IR光譜儀，塞默飛世爾科技有限公司，型號(hào)Thermo Nicolet 380；AXS衍射儀，德國(guó)布魯克公司，型號(hào)D8；熱重分析儀，德國(guó)耐馳公司，型號(hào)209 F3；電子掃描顯微鏡，蔡司公司，型號(hào)EVO 18。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 交聯(lián)殼聚糖水凝膠制備

稱取1.0000 g殼聚糖，溶于100 mL 1%（V/V）冰醋酸中，25 ℃下磁力攪拌1 h，隨后按殼聚糖/交聯(lián)劑質(zhì)量比（1、1.667和 3.333，m/m），加入相應(yīng)的交聯(lián)劑（交聯(lián)劑濃度1%m/V）進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)結(jié)束后，溶液pH調(diào)至pH 4.8～5.0，10000 r/min離心10 min，得到沉淀物，水洗3次，得到不同的交聯(lián)殼聚糖水凝膠。部分水凝膠經(jīng)冷凍干燥、研磨和粉碎，用于后續(xù)表征實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 交聯(lián)殼聚糖水凝膠的表征

利用傅里葉紅外光譜儀，采用溴化鉀壓片法進(jìn)行制樣，以空氣為背景，對(duì)樣品的相關(guān)官能團(tuán)及化學(xué)鍵進(jìn)行測(cè)定，設(shè)置分辨率為4 cm-1，利用DTGS檢測(cè)器先掃去空氣的空白，掃描波數(shù)在 4000～400 cm-1范圍內(nèi)，掃描64次，取平均值[16]。

利用粉末X射線衍射儀，在Cu-Kα輻射（λ=0.1542 nm）、40 kV、40 mA、范圍 5 °～45 °、步長(zhǎng) 0.033 °的條件下，對(duì)樣品粉末的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定[17]。

采用熱重分析儀對(duì)樣品的熱性能進(jìn)行分析。精確稱取4 mg樣品粉末置于鋁盤中，在氮?dú)夥諊?，?0 ℃/min的速度，從30 ℃升溫至650 ℃，記錄樣品的重量變化[18]。

采用液氮對(duì)交聯(lián)殼聚糖水凝膠進(jìn)行脆斷，獲得水凝膠斷面，通過(guò)導(dǎo)電膠將斷面粘在樣品臺(tái)上，噴金后，通過(guò)電子掃描顯微鏡，在10.00 kV下進(jìn)行觀察。

另外，參考文獻(xiàn)提及方法[19,20]，稱取0.5000 g（精確到0.0001 g）樣品粉末于離心管中，分別加入20 mL pH 2.2、4.0和7.0的緩沖液，混合后，置于37 ℃水浴100 r/min，2 h后取出，10000 r/min離心20 min，棄去上清液，稱溶脹沉淀重量（扣去管重），每個(gè)樣品平行兩次，測(cè)定其溶脹率，溶脹率計(jì)算公式如下：

式中：

w1——溶脹后沉淀與離心管的總重量，g；

w2——離心管重量，g；

w3——溶脹前稱入的粉末重量，g。

1.3.3 體外模擬釋放實(shí)驗(yàn)

將1.3.1中所述方法，制備殼聚糖-交聯(lián)劑溶液（pH 4.8），然后將一定量的牛血清白蛋白（BSA）滴入溶液中，攪拌2 h，10000 r/min離心30 min，獲得包載有BSA的殼聚糖基水凝膠。并用BCA試劑盒對(duì)上清液中的游離BSA進(jìn)行測(cè)定，按照文獻(xiàn)中提及的方法對(duì)殼聚糖基水凝膠中的BSA包載率進(jìn)行計(jì)算。

另外，參考文獻(xiàn)提及方法[21]，將上述包載有BSA的殼聚糖基水凝膠置于200 mL溶出介質(zhì)中，37 ℃水浴100 r/min。水凝膠在在模擬胃液（pH 1.2）中運(yùn)轉(zhuǎn)2 h，然后在模擬小腸液（pH 6.8）中運(yùn)轉(zhuǎn)6 h，最后在模擬結(jié)腸液（pH 7.0）中運(yùn)轉(zhuǎn)38 h。BSA的釋放量通過(guò)BCA試劑盒測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)差異性采用單因素方差分析及Duncan檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為p＜0.05，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 交聯(lián)殼聚糖水凝膠的鏈結(jié)構(gòu)分析

未改性的殼聚糖在 3400 cm-1有羥基和氨基的聯(lián)合非對(duì)稱伸縮振動(dòng)，在1650 cm-1和1560 cm-1的特征峰表征酰胺Ⅰ帶的 C=O鍵的伸縮振動(dòng)和酰胺Ⅱ帶的N-H 鍵振動(dòng)峰[22]。殼聚糖上的-NH3+與交聯(lián)劑中的磷酸基團(tuán)，通過(guò)氫鍵進(jìn)行交聯(lián)，因此，交聯(lián)后的殼聚糖水凝膠在1650 cm-1附近的峰向1635 cm-1方向發(fā)生紅移，這與殼聚糖上N-H彎曲振動(dòng)以及處于締合態(tài)的酰胺Ⅱ帶有關(guān)。而交聯(lián)殼聚糖基水凝膠中的磷酸基團(tuán)在1215～1280 cm-1處有P=O的振動(dòng)吸收峰，且隨著殼聚糖與交聯(lián)劑質(zhì)量比的降低，峰強(qiáng)度有所上升，說(shuō)明更多的磷酸基團(tuán)參與交聯(lián)反應(yīng)[23,24]，這結(jié)果與參考文獻(xiàn)相近。另外，交聯(lián)后，由于磷酸基團(tuán)的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)，TPP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠在800～900 cm-1有強(qiáng)吸收峰出現(xiàn)，這是P-O-C鍵的伸縮振動(dòng)。而SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠則1036 cm-1有吸收峰出現(xiàn)，這是交聯(lián)劑SHMP中P-OH鍵的吸收峰[23,25]。

比較兩種交聯(lián)劑，TPP中帶有PO3-磷酸基團(tuán)，而SHMP帶有PO43-磷酸基團(tuán)，在交聯(lián)反應(yīng)中，殼聚糖分子鏈段可相互間形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，也可以在分子鏈段內(nèi)進(jìn)行交聯(lián)[11]，而SHMP中可形成更多的作用位點(diǎn)[26]，參與殼聚糖的交聯(lián)反應(yīng)[23]，因此，在SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠中，N-H鍵在1530 cm-1附近的峰強(qiáng)度明顯增加[15]，這與交聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中殼聚糖上-NH3+的構(gòu)象轉(zhuǎn)變以及水凝膠內(nèi)部交聯(lián)程度上升形成緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有關(guān)。參考文獻(xiàn)中曾提及，在SHMP交聯(lián)殼聚糖水凝膠中有復(fù)雜的分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，使殼聚糖中C2、C3、C5和C6位在13C固體核磁譜圖中向低場(chǎng)輕微移動(dòng)[16]。這與本論文的研究結(jié)果一致，交聯(lián)劑SHMP具有較多的作用位點(diǎn)，通過(guò)殼聚糖的分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

2.2 交聯(lián)殼聚糖水凝膠的結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析

未改性的殼聚糖在10.26 °和19.83 °附近出現(xiàn)寬泛的衍射峰，分別代表殼聚糖中結(jié)晶區(qū)和非晶區(qū)[27]，同時(shí)結(jié)晶區(qū)域也與殼聚糖中酰胺鍵的形成、氨基和羥基之間氫鍵有關(guān)[28]。從圖2a看出，交聯(lián)后，當(dāng)CS/TPP比值為3.333時(shí)，20.06 °附近有一衍射峰，當(dāng)CS/TPP比值為1.667時(shí)，20.06 °附近的衍射峰移至24.43 °，并且峰的強(qiáng)度略有降低。而當(dāng)CS/SHMP之比為3.333時(shí)，CS基凝膠在 20.91 °左右有一峰（圖2b）。隨著CS/SHMP 比值的降低，峰向 22.73 °～22.83 °方向移動(dòng)。這說(shuō)明在交聯(lián)過(guò)程中，分子鏈重新排列。如前所述，交聯(lián)后，陰離子交聯(lián)劑與殼聚糖之間通過(guò)氫鍵而形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，隨著分子鏈段的重排，水凝膠中的分子內(nèi)和分子間的作用力增強(qiáng)[18,29]，在不同的殼聚糖/交聯(lián)劑質(zhì)量比的影響下，最終生成具有不同結(jié)晶結(jié)構(gòu)的交聯(lián)殼聚糖，水凝膠鏈結(jié)構(gòu)與結(jié)晶結(jié)構(gòu)的改變會(huì)影響水凝膠的性能，后續(xù)會(huì)通過(guò)熱性能分析及體外控釋實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步探討。

2.3 交聯(lián)殼聚糖水凝膠的熱性能分析

在30～150 ℃范圍內(nèi)出現(xiàn)8.22%的失重，屬于未改性殼聚糖天然結(jié)構(gòu)中的水分散失。當(dāng)CS/TPP的質(zhì)量比從1增加到3.333時(shí)，TPP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠在此溫度范圍內(nèi)的失重率分別為 5.82%、6.077%和13.10%（圖3a）。當(dāng)CS/SHMP的質(zhì)量比從1增加到3.333時(shí)，SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的失重分別為11.76%、11.43%和12.03%（圖3b）。在30～150 ℃范圍內(nèi)，殼聚糖基水凝膠的降解與其親水性有關(guān)，由于交聯(lián)作用，交聯(lián)劑中的磷酸基團(tuán)增強(qiáng)了水與殼聚糖分子鏈的相互結(jié)合[30]，所以交聯(lián)殼聚糖水凝膠在此溫度范圍內(nèi)的失重率上升。

從150到600 ℃，由于殼聚糖分子的分解[30]，天然殼聚糖的失重率約為55.15%。當(dāng)CS/TPP的質(zhì)量比從1增加到3.333時(shí)，TPP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的失重率分別為 38.87%、38.59%和 41.08%（圖 3a）。當(dāng)CS/SHMP的質(zhì)量比從1增加到3.333時(shí)，SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的失重率分別為 34.44%、34.99%和37.40%（圖 3b）。在 650 ℃下，未改性的殼聚糖有35.10%的重量殘留。當(dāng) CS/TPP質(zhì)量比從 1增加到3.333時(shí)，TPP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的物質(zhì)殘留率分別為53.40%、53.45%和43.23%。當(dāng)CS/SHMP的質(zhì)量比從1增加到3.333時(shí)，SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的物質(zhì)殘留率分別為50.66%、50.78%和47.94%。

對(duì)比兩種水凝膠，SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的失重率要低于TPP交聯(lián)的，這與殼聚糖基水凝膠分子結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。與交聯(lián)劑TPP相比，SHMP交聯(lián)劑可提供更多的交聯(lián)作用位點(diǎn)。在FT-IR分析中，由于殼聚糖上-NH3+在交聯(lián)過(guò)程中構(gòu)象轉(zhuǎn)變以及水凝膠內(nèi)部交聯(lián)程度上升而形成緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，SHMP交聯(lián)的殼聚糖基水凝膠中N-H鍵在1530 cm-1附近的峰強(qiáng)度明顯增加。另外，在交聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中，殼聚糖分子鏈段重排，破壞其原有的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，殼聚糖分子通過(guò)分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)，水凝膠內(nèi)部的作用力逐漸增強(qiáng)，提高了水凝膠的穩(wěn)定性，所以在熱性能分析中，SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠要優(yōu)于 TPP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠。此處的研究結(jié)果與參考文獻(xiàn)的相近[18,29]。

2.4 交聯(lián)殼聚糖水凝膠的形貌分析

圖4為交聯(lián)殼聚糖水凝膠的斷面形貌，從斷面中可以看出，未改性的殼聚糖原膜的斷面均勻，而通過(guò)交聯(lián)劑改性后的水凝膠，其斷面結(jié)構(gòu)致密，且隨著交聯(lián)劑用量的提升，斷面致密程度增加。對(duì)比兩種不同的交聯(lián)劑，采用SHMP交聯(lián)的殼聚糖水凝膠，其斷面的致密程度要比相同條件下TPP交聯(lián)的殼聚糖水凝膠要大。

在交聯(lián)后，殼聚糖水凝膠變得致密，這與交聯(lián)過(guò)程形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有關(guān)。當(dāng)殼聚糖與交聯(lián)劑質(zhì)量比下降，殼聚糖分子鏈段可形成分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)，交聯(lián)程度上升，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越多，水凝膠越致密。這與文獻(xiàn)的結(jié)果一致，也與前述的XRD分析結(jié)果一致，同時(shí)，交聯(lián)過(guò)程所形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也會(huì)進(jìn)一步改變水凝膠的溶脹性能、控釋性能等。

2.5 交聯(lián)殼聚糖水凝膠的溶脹性能

殼聚糖基水凝膠的溶脹能力與離子交聯(lián)過(guò)程中通過(guò)靜電作用形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[23]，易受pH的影響，本文通過(guò)對(duì)殼聚糖基水凝膠在pH 2.2、4.0和7.0條件下的溶脹情況進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。

當(dāng)pH為2.2時(shí)，隨著CS/TPP的質(zhì)量比從1增加到3.333，TPP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的溶脹率從13.06%下降到10.83%。當(dāng)pH為4.0時(shí)，TPP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的溶脹率隨CS/TPP質(zhì)量比的增加，從7.90%下降到6.21%。當(dāng)pH為7.0時(shí)，TPP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的溶脹率隨CS/TPP質(zhì)量比的增加，從7.84%下降到5.51%。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在相同CS/TPP質(zhì)量比下，TPP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的溶脹率隨pH的增加而逐漸下降。對(duì)于SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠，隨著CS/SHMP的質(zhì)量比從1增加到3.333，SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的溶脹率從5.40%上升到19.41%。當(dāng)pH為 4.0時(shí)，SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的溶脹率隨CS/SHMP質(zhì)量比的增加，從4.48%上升到6.73%。當(dāng)pH為7.0時(shí)，SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的溶脹率隨CS/SHMP質(zhì)量比的增加，從2.97%上升到5.26%。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在相同CS/SHMP質(zhì)量比下，SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的溶脹率隨pH的增加而逐漸下降，同時(shí)，與TPP交聯(lián)殼聚糖水凝膠相比，SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的溶脹能力明顯減小。

表1 殼聚糖基水凝膠的溶脹能力Table 1 Swelling capacity of CS-based hydrogel.

同一交聯(lián)殼聚糖基水凝膠在pH 2.2環(huán)境下溶脹性能最好，這是由于在酸性環(huán)境下溶液中 H+濃度的增加，溶脹的水凝膠與外部溶液之間滲透壓增加[22]，使得交聯(lián)殼聚糖基水凝膠在pH值為2.2時(shí)迅速膨脹。隨著pH的上升，溶液中的H+數(shù)量下降，水凝膠內(nèi)外的滲透壓減小，水分滲透速度減慢，從而降低水凝膠的溶脹率。而在同樣的pH條件下，TPP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠隨CS/TPP質(zhì)量比增大，其溶脹率逐漸下降，這是由于CS/TPP質(zhì)量比增大，TPP可更多地交聯(lián)殼聚糖分子鏈段，形成殼聚糖分子內(nèi)、分子間交聯(lián)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。CS/TPP質(zhì)量比增大，TPP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越緊密，這對(duì)水分的向內(nèi)滲透遷移不利，從而造成水凝膠的溶脹能力下降[18,29]，這也與FT-IR和SEM的分析結(jié)果一致。對(duì)于SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠，SHMP是一種復(fù)雜的磷酸鹽混合物，其磷酸鹽成分比例隨 pH變化，這容易導(dǎo)致殼聚糖與SHMP之間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)解體[14]，從而減少SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的吸水溶脹能力。這也是SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的溶脹能力小于TPP交聯(lián)殼聚糖水凝膠的原因。隨CS/SHMP質(zhì)量比增大，交聯(lián)劑周圍的殼聚糖分子鏈段增加，致密的水凝膠結(jié)構(gòu)既減緩了水分的滲入，也降低了SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠解體的可能，從而在一定程度上提高水凝膠的溶脹性。

最后，圖5展示在不同pH值下交聯(lián)殼聚糖水凝膠紅外光譜。在pH 2.2條件下，周圍環(huán)境中H+濃度增加，利用水凝膠內(nèi)外滲透壓，水凝膠發(fā)生溶脹，在對(duì)應(yīng)的紅外圖譜中，1750 cm-1附近存在-NH3+基團(tuán)的振動(dòng)峰。隨著pH的升高，這一峰逐漸減弱并消失，這與該基團(tuán)轉(zhuǎn)變成N-H帶振動(dòng)（1539 cm-1）有關(guān)[23,31]。

2.6 交聯(lián)殼聚糖水凝膠的體外釋放及其變化機(jī)理

當(dāng)CS/TPP比值分別為3.333、1.667和1時(shí)，TPP殼聚糖基水凝膠的 BSA的包載率分別為 96.89%、93.43%和10.88%。當(dāng)CS/TPP的質(zhì)量比分別為3.333、1.667和1時(shí)，在模擬胃液中，TPP殼聚糖基水凝膠中BSA的釋放率分別為15.12%、15.82%和15.04%（圖6a）。隨后，TPP殼聚糖基水凝膠運(yùn)轉(zhuǎn)到模擬小腸液，在該環(huán)境下，BSA逐漸釋放。6 h后，TPP殼聚糖基水凝膠轉(zhuǎn)換至模擬結(jié)腸液中運(yùn)轉(zhuǎn)。體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，牛血清白蛋白的累積釋放率分別為 59.90%、70.10%和76.57%。

與此相比，當(dāng)CS/SHMP的質(zhì)量比分別為3.333、1.667和 1時(shí)，交聯(lián)殼聚糖水凝膠的包載率分別為99.68%、98.31%和21.70%，在模擬胃液中，BSA釋放率分別為14.89%、13.04%和22.41%。當(dāng)運(yùn)轉(zhuǎn)至模擬小腸環(huán)境，分別有3.164%、19.81%和7.90%的BSA從SHMP交聯(lián)殼聚糖水凝膠中釋放。在整個(gè)體外模擬釋放過(guò)程中，BSA的累積釋放率分別為30.47%、47.6%和50.27%。研究報(bào)道顯示，以TPP交聯(lián)的殼聚糖水凝膠（質(zhì)量比4），大約有55%的活性蛋白累積釋放率，其中約有45%的活性蛋白釋放于模擬上消化道環(huán)境，真正釋放于結(jié)腸部位的活性蛋白較少。而以SHMP交聯(lián)的殼聚糖水凝膠（質(zhì)量比4），其活性蛋白的累積釋放率則與本研究的相近[10]。

在胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，pH值由1.2（模擬胃液）升至6.8（模擬小腸液），再升至7.0（模擬結(jié)腸液），水凝膠由酸性介質(zhì)向中性環(huán)境轉(zhuǎn)變。在此過(guò)程中，模擬胃液中高濃度的 H+使交聯(lián)殼聚糖基水凝膠發(fā)生溶脹，后續(xù)隨模擬胃腸道運(yùn)轉(zhuǎn)，水凝膠逐漸被侵蝕。因此，在上消化道，交聯(lián)殼聚糖水凝膠中的活性物質(zhì)是通過(guò)載體材料溶脹、水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的侵蝕以及活性物質(zhì)分子擴(kuò)散進(jìn)行釋放的[17]。在模擬結(jié)腸液中，交聯(lián)殼聚糖水凝膠的釋放速率下降，這與殼聚糖在中性條件下不溶于水有關(guān)，處于水凝膠外圍的殼聚糖鏈段在酸性環(huán)境下溶脹后，隨胃腸道pH的轉(zhuǎn)變而逐漸不溶于水，從而形成限制內(nèi)部物質(zhì)遷移的障礙，因此，BSA在中性的模擬結(jié)腸環(huán)境中緩慢釋放。

而對(duì)比兩種不同的交聯(lián)劑，TPP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠在低CS/TPP質(zhì)量比情況下，在TPP分子周圍對(duì)殼聚糖分子鏈段進(jìn)行分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，形成復(fù)雜致密的水凝膠結(jié)構(gòu)，以保護(hù)活性蛋白，減少上消化道環(huán)境的侵蝕，增大運(yùn)送至結(jié)腸部位的活性蛋白量。如前所述，SHMP是一種復(fù)雜的磷酸鹽混合物，其在酸性介質(zhì)中能被水解成三磷酸鈉和正磷酸鈉，磷酸基團(tuán)的改變，會(huì)破壞其與殼聚糖-NH3+之間所形成的氫鍵[14]。在模擬胃酸中，SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠的氫鍵被破壞，殼聚糖分子鏈段發(fā)生游離，處于水凝膠周圍。所以，在模擬胃液運(yùn)轉(zhuǎn)階段，BSA從兩種水凝膠中的累積釋放率相近。

隨著模擬小腸液和模擬結(jié)腸液的運(yùn)轉(zhuǎn)，釋放介質(zhì)pH上升，在SHMP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠中，游離的殼聚糖不溶于水，且水解后的磷酸鹽可重新與殼聚糖分子鏈段結(jié)合，水凝膠內(nèi)部發(fā)生分子內(nèi)、分子間的復(fù)雜交聯(lián)。因此，在中性的腸道環(huán)境，SHMP交聯(lián)殼聚糖水凝膠內(nèi)部仍然致密，而外部有不溶于水的殼聚糖層，共同限制BSA的釋放，使得SHMP交聯(lián)殼聚糖水凝膠在模擬結(jié)腸環(huán)境的 BSA累積釋放率明顯低于TPP交聯(lián)殼聚糖基水凝膠。

3 結(jié)論

為提高活性物質(zhì)的生物利用度，本文通過(guò)不同的交聯(lián)劑，在不同的濃度下對(duì)殼聚糖進(jìn)行離子交聯(lián)，獲得具有不同微觀結(jié)構(gòu)的殼聚糖基水凝膠。通過(guò)紅外光譜和X-射線衍射分析，交聯(lián)殼聚糖水凝膠通過(guò)殼聚糖上的氨基和交聯(lián)劑中的磷酸基團(tuán)間形成氫鍵，使得殼聚糖分子鏈段間可形成分子內(nèi)和分子間的相互作用，提升水凝膠空間結(jié)構(gòu)的緊密程度。同時(shí)，隨著殼聚糖/交聯(lián)劑質(zhì)量比的下降，即交聯(lián)劑用量增加，交聯(lián)殼聚糖水凝膠緊密性增大。熱重分析也表明隨著交聯(lián)程度的提高，殼聚糖基水凝膠的熱穩(wěn)定性上升。由于交聯(lián)劑分子結(jié)構(gòu)的差異，TPP交聯(lián)殼聚糖水凝膠在較低pH下具有較好的溶脹性能，所以在模擬胃液環(huán)境中，其對(duì)BSA的控釋能力優(yōu)于SHMP交聯(lián)殼聚糖水凝膠。在后續(xù)的模擬小腸液和模擬結(jié)腸液中，松散的SHMP交聯(lián)殼聚糖水凝膠由于釋放介質(zhì)pH的提升以及殼聚糖溶解性下降而形成致密結(jié)構(gòu)，減緩BSA在腸道中的快速釋放。本文的研究結(jié)果可為活性蛋白類功能因子的遞送以及功能食品的發(fā)展提供一定的參考。