利用同源建模、分子模擬和分子對(duì)接技術(shù)分析家蠶中碳酸酐酶的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制

陳胤熹，黎菁菁，羅佳偉，鄭少鵬，余潔婷，黃嘉惠，李鑫堯，余銘怡，郝錦亨，黎佩瑜，古偉明，吳易達(dá)，曹詩林,，賴林浩

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528000）（2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510641）（3.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東廣州 510006）（4.暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東廣州 510640）（5.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

碳酸酐酶（Carbonic Anhydrase，碳酸酐酶）是一種重要的含鋅金屬酶，廣泛存在于動(dòng)、植物及微生物體中。碳酸酐酶不僅能夠快速、高效地催化二氧化碳和碳酸氫鹽的可逆轉(zhuǎn)化而且還具有維持生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、參與光合作用、鈣化作用、CO2及碳酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)等生命功能[1]。由于碳酸酐酶的這些特性，它既可被應(yīng)用于生物檢測(cè)，CO2捕集和生理診斷等領(lǐng)域，也被廣泛應(yīng)用于食品和藥品工業(yè)中，因此具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景[2-3]。

根據(jù)碳酸酐酶的氨基酸序列不同，一般可分為α、β、γ、δ、ε、η、θ和ι等八種類型[4]，游離的碳酸酐酶普遍存在著容易失活、熱穩(wěn)定性低、可重復(fù)利用率低等問題，難以得到大規(guī)模應(yīng)用[5]，因此，開拓更多來源的碳酸酐酶酶，并對(duì)其進(jìn)行分子改造和設(shè)計(jì)，是解決該問題的潛在途徑。獲得準(zhǔn)確的碳酸酐酶的三維結(jié)構(gòu)是理性改造的基礎(chǔ)。

目前已知的獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法有很多，例如：核磁共振，X射線單晶衍射、冷凍電鏡等實(shí)驗(yàn)方法，但是這些方法成本高，耗時(shí)長(zhǎng)，難以得到更廣泛的應(yīng)用。另一方面，可以使用蛋白質(zhì)建模技術(shù)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。蛋白質(zhì)建模的方法包括同源建模和非同源建模。若在現(xiàn)有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫可檢索出與目的蛋白具有序列同源性的模板，則可進(jìn)行同源建模。若無法得到同源模板，或同源模板無法覆蓋蛋白全序列，則需要通過穿針引線、從頭算或分段建模和結(jié)構(gòu)域組裝等方法進(jìn)行建模。通過從NCBI與SilkDB3.0中獲得大量的數(shù)據(jù)[6,7]，使用同源建模將已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的序列與同源蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，通過分析蛋白質(zhì)序列中的保守區(qū)域來識(shí)別蛋白質(zhì)活性區(qū)域，可望快速預(yù)測(cè)出蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息[8]。

家蠶（Bombyxmori，Bm）的第五齡幼蟲的絲腺中存在著四種不同的上皮細(xì)胞，其中一種產(chǎn)生活性碳酸酐酶，用于調(diào)節(jié)家蠶內(nèi)環(huán)境的 pH，維持管腔內(nèi)的pH梯度[9]。本文以家蠶碳酸酐酶為研究的對(duì)象，通過蛋白建模、結(jié)構(gòu)分析、分子動(dòng)力學(xué)模擬、分子對(duì)接等手段，建立和分析了家蠶碳酸酐酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型、活性區(qū)域和催化作用機(jī)制，并對(duì)所建立的模型進(jìn)行了一系列的計(jì)算評(píng)分，最后采用分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。本文研究為家蠶碳酸酐酶后續(xù)的分子改造提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

家蠶碳酸酐酶的基因和蛋白質(zhì)序列信息來源于NCBI與SilkDB3.0數(shù)據(jù)庫[10]。NCBI是美國國家分子生物學(xué)信息資源中心，具有廣大的公共數(shù)據(jù)庫，可被用于檢索和分析基因組數(shù)據(jù)等。而SilkDB3.0是由西南大學(xué)蠶絲科學(xué)與技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)維護(hù)的家蠶的多組學(xué)數(shù)據(jù)庫，可進(jìn)行可視化的多組學(xué)分析。蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)信息從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫RCSB PDB獲得，該數(shù)據(jù)庫保存了通過X射線衍射、核磁共振、冷凍電鏡等實(shí)驗(yàn)手段獲得蛋白質(zhì)等生物大分子的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。利用SWISS-MODEL計(jì)算平臺(tái)和Modeller軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)建模。其中SWISS-MODEL是一個(gè)自動(dòng)化的蛋白質(zhì)比較建模服務(wù)器。Modeller是一款同源建模軟件，主要用于家蠶碳酸酐酶的優(yōu)化與評(píng)價(jià)[11]。利用PROCHECK評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)合理性[12]。利用分子三維結(jié)構(gòu)顯示軟件PyMol對(duì)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析[13]。通過Gromacs軟件[14]考察酶在催化過程中結(jié)構(gòu)變化及反應(yīng)體系的狀態(tài)變化。AutoDock-Vina是由Scripps研究所的Olson實(shí)驗(yàn)室開發(fā)與維護(hù)的分子對(duì)接的開源軟件[15]，用于對(duì)乙酸對(duì)硝基苯酯底物與家蠶碳酸酐酶分子對(duì)接計(jì)算，獲得最優(yōu)的對(duì)接結(jié)果，獲得對(duì)接模型后，結(jié)合gromacs的MM/PBSA分析插件，共同分析家蠶碳酸酐酶與底物間相互作用的具體數(shù)值和具體部位。MM/PBSA[16]是利用分子力學(xué)和連續(xù)介質(zhì)模型來計(jì)算蛋白和配體之間存在的結(jié)合自由能，其中配體可以是蛋白、小分子或者多肽，在該方法中，計(jì)算分子力學(xué)（MM）、極性溶劑化能（PB）、非極性溶劑化能（SA）的相關(guān)能量得以被分解計(jì)算及分析。其中PROCHECK、AutoDock-Vina以及Modeller已經(jīng)被本團(tuán)隊(duì)進(jìn)行二次開發(fā)并部署于互聯(lián)網(wǎng)在線平臺(tái)中（https://atomevo.com/），開放給研究人員免費(fèi)使用。

1.2 方法

1.2.1 碳酸酐酶同源建模

在NCBI數(shù)據(jù)庫和SilkDB3.0中獲得家蠶碳酸酐酶的信息（XP_004922882.1）序列為：MDNRTVKID PKFLSAQPKKTSSDAEHISRLRPSQSPIAISLSRCPT WSSLDPLKFKGYWDSNANAILLNNGSTAYFTFND ASVRPTLSGGPLIGEYIFEQMHFHWSVDDFTGCEH VLDGHGYAAECHFVHYNSKYESLETAVGHPDGLA VVGFLLETVDAPNPRFDRLVQGLEGIQKRESVMN VTSESLLWMDREDLQIGNYVTYKGSLTTPPYTEC VTWIIYEKPVQIGSEQLGLLRQLEGPDSQPIERNVR PTQRHPPGHSVIYVKQVRSKL。

首先使用 SWISS-MODEL[17]對(duì)所得到的家蠶碳酸酐酶蛋白質(zhì)序列進(jìn)行模板搜索，篩選出酶種類接近、同源性高、序列覆蓋度高的模板，并進(jìn)行同源建模，其中SWISS-MODEL服務(wù)器模板數(shù)據(jù)庫ExPDB是從PDB中提取的[18]。

如出現(xiàn)單個(gè)模板無法覆蓋整個(gè)目標(biāo)序列的情況，則先進(jìn)行分段建模，再進(jìn)行穿針引線拼接。具體方法是：（1）若結(jié)構(gòu)域存在同源性高的模板，則利用SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模，若部分結(jié)構(gòu)域無同源模板，則使用trrosetta進(jìn)行建模。（2）將得到的各結(jié)構(gòu)域模型作為模板，使用本團(tuán)隊(duì)自行開發(fā)的Modeller軟件的穿針引線拼接程序進(jìn)行拼接，從而得到目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)。

1.2.2 碳酸酐酶潛在活性區(qū)域

綜合分析RCSB PDB數(shù)據(jù)庫中的模板，以及對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的參考文獻(xiàn)中的活性區(qū)域信息進(jìn)行分析。利用活性區(qū)域的信息包括：易形成疏水口袋、組氨酸聚集、活性中心金屬離子臨近區(qū)域。再通過比對(duì) SWISSMODEL中最優(yōu)結(jié)果酶蛋白氨基酸序列與RCSB PDB得到同樣種屬的酶蛋白的氨基酸序列，得出酶潛在的活性區(qū)域。

1.2.3 碳酸酐酶活性區(qū)域與底物的分子對(duì)接

以乙酸對(duì)硝基苯酯作為模型底物，以碳酸酐酶模型作為受體結(jié)構(gòu)，利用Auto Dock-Vina模塊中將受體與配體進(jìn)行對(duì)接。根據(jù)1.2.2得到碳酸酐酶活性區(qū)域的空間位置確立一個(gè)長(zhǎng)方形盒子限制計(jì)算范圍，計(jì)算得到盒子參數(shù)后與受體的PDB文件、配體的PDB文件共同上傳至 Auto Dock-Vina模塊進(jìn)行計(jì)算，并利用Vina-XScore連用模塊，對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，找出受體與配體結(jié)合模式[15]。

1.2.4 家蠶碳酸酐酶的分子動(dòng)力學(xué)模擬

本課題利用 Gromacs軟件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬[19]，以Amber03力場(chǎng)。模擬步驟如下：首先，輸入在1.2.3中對(duì)接后所輸出的蛋白結(jié)構(gòu)和力場(chǎng)參數(shù)的相關(guān)文件（電荷，鍵合參數(shù)和非鍵參數(shù)等勢(shì)能函數(shù)）。隨后，確定其體系的大小并且對(duì)體系進(jìn)行能量最小化，再進(jìn)行NVT與NPT平衡。隨后開始100 ns分子模擬，并且分析模擬輸出關(guān)于溶劑可及面積、氫鍵數(shù)目和徑向分布函數(shù)的數(shù)據(jù)，并進(jìn)行MM/PBSA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶碳酸酐酶同源建模及結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)

首先通過SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模，結(jié)果顯示家蠶碳酸酐酶的主要區(qū)域（25E-268K）可以利用Protein Data Bank中4ZX1模型為模板進(jìn)行建模，但是1M-24A以及269Q-274L這兩個(gè)區(qū)域缺少模板。因此先通過SWISS-MODEL同源建模得到主體結(jié)構(gòu)區(qū)域。1M-24A以及269Q-274L區(qū)域通過trRosetta進(jìn)行非同源建模。隨后利用本課題組自行開發(fā)的基于Modeller的穿針引線建模方法，將三個(gè)模板進(jìn)行穿針引線拼接，得到家蠶碳酸酐酶模型。

Ramachandran plot用于描述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基二面角φ和Ψ是否處于合理區(qū)域，可用于表征同源建模結(jié)果的合理性[20]。結(jié)果表明（圖 1）其完全允許區(qū)域（89.3%）與允許區(qū)域（10.3%），總和超過了99%[21]，表明本研究所得的家蠶碳酸酐酶結(jié)構(gòu)合理。

2.2 家蠶碳酸酐酶潛在活性部位分析

通過前人對(duì)與家蠶碳酸酐酶同種屬的碳酸酐酶 IX（PDB代號(hào)：4XZ1）的研究表明[22]，4ZX1的活性區(qū)域?yàn)?62N～65S，89L～91Q，120L～122H，131V～143V，198L～206C。利用分子疊合技術(shù)對(duì)家蠶碳酸酐酶與4ZX1的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行疊合對(duì)比（圖 2a），確定家蠶碳酸酐酶活性口袋的空間位置。通過蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析（圖2b），得到家蠶碳酸酐酶的潛在活性口袋為：70N～72S（區(qū)域A），98F～100Q（區(qū)域B），128F～130H（區(qū)域C），138L～150V（區(qū)域D），209L～217C（區(qū)域E）。

以家蠶碳酸酐酶蛋白的活性口袋周邊（空間中心坐標(biāo)為 X=0.1、Y=1.4、Z=88）為對(duì)接位點(diǎn)，通過Autodock-Vina進(jìn)行蛋白與對(duì)乙酸對(duì)硝基苯酯之間的分子對(duì)接。對(duì)接后得到最優(yōu)對(duì)接結(jié)果表明，家蠶碳酸酐酶與底物結(jié)合能為-6.1 Kcal/mol。

2.3 家蠶碳酸酐酶的分子動(dòng)力學(xué)模擬數(shù)據(jù)分析

均方根偏差（RMSD）分析可以揭示家蠶碳酸酐酶整體構(gòu)象的穩(wěn)定性。該結(jié)果顯示（圖 3a），在模擬的前10 ns，家蠶碳酸酐酶的RMSD迅速從0 nm上升至0.3 nm，隨后在0.3 nm～0.35 nm左右波動(dòng)。家蠶碳酸酐酶最后50 ns的RMSD值約為0.35 nm，表明該酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。家蠶碳酸酐酶最后50 ns的平均可及面積（圖3b）為142 nm2。家蠶碳酸酐酶蛋白分子內(nèi)平均氫鍵數(shù)（HBN）為181，家蠶碳酸酐酶與水溶液間的平均氫鍵數(shù)為587。

徑向分布函數(shù)可以揭示酶蛋白與水的分布距離以及對(duì)應(yīng)的概率密度，對(duì)模擬輸出的數(shù)據(jù)作圖分析，研究表明水與家蠶碳酸酐酶在距離＜0.35 nm區(qū)間形成一個(gè)聚集峰，該峰主要?dú)w因于水和蛋白之間的氫鍵作用（圖4）。

2.4 家蠶碳酸酐酶MM/PBSA分析

在動(dòng)力學(xué)分子模擬后，通過MM/PBSA法進(jìn)一步分析對(duì)接模型的結(jié)合自由能，得到總結(jié)合能為-40.72 kJ/mol。其中，對(duì)自由能的貢獻(xiàn)主要是范德華力的相互作用-57.86 kJ/mol。而極性溶劑化21.39 kJ/mol，對(duì)結(jié)合有顯著的反作用。通過分析蛋白質(zhì)氨基酸殘基結(jié)合能（圖4），得知家蠶碳酸酐酶對(duì)接后的模型中，分子間相互作用力主要存在于家蠶碳酸酐酶活性口袋中的D、E區(qū)域。

表1 家蠶碳酸酐酶的主要氨基酸殘基與底物乙酸對(duì)硝基苯酯的g_mmpbsa分析結(jié)果Table 1 The g_mmpbsa analysis of 4-nitrophenyl acetate and the main residues of BmCA

3 結(jié)論

3.1 本文通過同源建模建立結(jié)構(gòu)合理的家蠶碳酸酐酶模型，結(jié)果顯示其氨基酸殘基處于完全允許區(qū)域（89.3%）與允許區(qū)域（10.3%）的總和超過了99%。2010年鄧秋紅等預(yù)測(cè)甘藍(lán)型油菜碳酸酐酶結(jié)構(gòu)，其模型的完全允許區(qū)域（87.0%）與允許區(qū)域（12.4%）總和超過99%[23]，通過Ramachandran plot分析的結(jié)果與前人的研究數(shù)據(jù)對(duì)比，證明該酶結(jié)構(gòu)模型可靠性良好。2015年Mahon Brian P等研究碳酸酐酶IX（PDB代號(hào)：4ZX1），獲得了潛在活性區(qū)域?yàn)椋?2N～65S、89L～92Q、120L～122H、131V～143V、198L～206C。利用分子疊合技術(shù)對(duì)家蠶碳酸酐酶與 4ZX1的蛋白結(jié)構(gòu)疊合對(duì)比，獲得了家蠶碳酸酐酶潛在的活性口袋：70N～72S、98F～100Q、128F～130H、138L～150V、209L～217C。結(jié)果表明同源建模所得的家蠶碳酸酐酶潛在活性區(qū)域與4ZX1號(hào)蛋白活性區(qū)域是相吻合的。

3.2 隨后，利用Autodock-Vina將家蠶碳酸酐酶與乙酸對(duì)硝基苯酯進(jìn)行對(duì)接，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)對(duì)接結(jié)果的家蠶碳酸酐酶與底物的結(jié)合能為-6.1 kcal/mol，2007年向福利用分子對(duì)接技術(shù)研究與本文同種屬的碳酸酐酶（PDB：2CAB）與乙酰唑胺進(jìn)行分子對(duì)接，得到對(duì)接結(jié)合能為-2.1 Kcal/mol[24]，經(jīng)對(duì)比表明家蠶碳酸酐酶與底物乙酸對(duì)硝基苯酯經(jīng)對(duì)接得到的結(jié)果較為穩(wěn)定。通過MM/PBSA探究家蠶碳酸酐酶與乙酸對(duì)硝基苯酯的相互作用，其結(jié)果表明：（1）范德華力在結(jié)合中占主導(dǎo)地位，而極性溶劑化對(duì)結(jié)合有顯著的反作用；（2）家蠶碳酸酐酶和底物相互作用的區(qū)域?yàn)?38L～150V（區(qū)域D）和209L～217C（區(qū)域E）。2013年孫維琦等運(yùn)用分子動(dòng)力學(xué)模擬和自由能計(jì)算方法，研究了苯磺酰胺分子從碳酸酐酶II的活性位點(diǎn)的相互作用，顯示關(guān)鍵殘基198L、199T和200T（該區(qū)域相當(dāng)于本研究中的區(qū)域E）與苯磺酰胺的氫鍵作用阻礙了底物從酶中的脫離[25]。

3.3 綜上所述，本文通過同源建模獲得了一個(gè)良好的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型，并通過分子模擬與分子對(duì)接技術(shù)探究其潛在活性位點(diǎn)與催化機(jī)制，為家蠶碳酸酐酶進(jìn)一步改造探究以及實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。