類芽孢桿菌ZX-5產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件優(yōu)化及其保濕特性

楊棒棒，符運會，周佳，屈建航，羅宇，李海峰，孫靜怡，張鑫

（河南工業(yè)大學生物工程學院，河南鄭州 450001）

多糖作為新型天然產(chǎn)物，越來越受到人們關注。自然界中多糖主要從植物和微生物中提取，其中微生物具有生長周期短、條件易控、多糖易與菌體分離、提取精制容易且不受季節(jié)因素和病蟲害影響等優(yōu)點，在工業(yè)化生產(chǎn)方面具有廣闊的發(fā)展前景[1]。

胞外多糖（Extracellular polysaccharides，EPS）是一些特殊微生物在生長代謝過程中分泌到細胞壁外的一種高分子水溶性物質(zhì)，從表觀形態(tài)上分為莢膜多糖和粘液多糖[2]。胞外多糖具有抗氧化性[3]、抗腫瘤[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]等活性，也可作為增稠劑、乳化劑、穩(wěn)定劑等食品添加劑運用到食品生產(chǎn)和生活中[6]。目前報道產(chǎn)胞外多糖的微生物有細菌、真菌和放線菌，細菌中已有報道明串珠菌屬（Leuconostoc）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等，類芽孢桿菌也有報道。Gao等[7]從西藏牦牛奶中分離得到一株類芽孢桿菌，經(jīng)鑒定該菌是一個新種，所產(chǎn)生的EPS可增強免疫活性[8]。戴德慧等[9]用不同濃度的類芽孢桿菌胞外多糖喂養(yǎng)小鼠，并進行急性經(jīng)口毒性試驗、骨髓細胞染色體畸變等實驗，表明小鼠的最大粘多糖耐受劑量為 12 g/kg，該粘多糖為無毒物質(zhì)。Sun等[10]利用Paenibacillussp.產(chǎn)的EPS，在相對濕度為43%和 81%的條件下，吸濕率接近于透明質(zhì)酸，這些特性使EPS成為化妝品行業(yè)中較昂貴的透明質(zhì)酸的良好替代品。保濕作用是護膚品行業(yè)最重要的性能之一，在護膚品中添加一定比例的保濕劑，既可減少產(chǎn)品水分的散失，又可和表皮水分進行水合，從而起到保濕增濕作用[11]。雖然微生物胞外多糖具有巨大的優(yōu)勢，但產(chǎn)胞外多糖菌株的開發(fā)及其發(fā)酵工藝條件的研究，仍是當前該領域研究的前提和關鍵。本研究通過對實驗室分離的一株類芽孢桿菌EPS的研究，獲得該菌的最佳發(fā)酵條件和EPS保濕性能，以提高EPS的產(chǎn)量，并為提升對天然微生物多糖的認識及應用開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

實驗室自湖泊沉積物中分離的一株產(chǎn)胞外多糖細菌菌株ZX-5。

1.1.2 培養(yǎng)基

蛋白胨酵母膏培養(yǎng)基（每L）：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，酵母粉3 g，氯化鈉5 g，Na2HPO4·12H2O 2.50 g，pH 5；固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉13.50 g。115 ℃條件下，滅菌30 min。

基礎產(chǎn)糖培養(yǎng)基（每L）：蔗糖30 g，酵母粉3 g，K2HPO4·3H2O 3 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，pH 5。115 ℃條件下，滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

葡萄糖、可溶性淀粉、酵母粉等，購于生工生物工程（上海）股份有限公司；濃硫酸、HCl、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O，購于阿拉丁試劑（上海）有限公司。試劑均為國產(chǎn)分析純。其中5%苯酚配制方法為：稱取5 g苯酚加入蒸餾水加熱溶解，冷卻后100 mL容量瓶定容。

1.3 方法

1.3.1 16S rRNA基因測序及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

利用細菌E. coli通用引物PCR擴增16S rRNA基因。PCR產(chǎn)物進行電泳檢測及核苷酸序列測定，GenBank數(shù)據(jù)庫BLAST比對并下載相似序列，使用MEGA 7.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定菌株的系統(tǒng)分類地位[7]。

1.3.2 胞外多糖的提取

將ZX-5菌種接種到蛋白胨酵母膏固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)19 h，接入蛋白胨酵母膏液體培養(yǎng)基進行搖瓶培養(yǎng)，溫度28 ℃，轉速150 r/min，21 h后形成種子液，以5%（V/V）的接種量接至基礎產(chǎn)糖培養(yǎng)基。

按照賈玉香[4]等人的方法，稍作修改，將上述發(fā)酵液在4 ℃、10000 r/min離心15 min，收集上清液；通過旋轉蒸發(fā)儀55 ℃濃縮至1/5；向上清液加入4倍體積無水乙醇，4 ℃靜置過夜，離心15 min，收集沉淀，并用適量蒸餾水溶解；液體中加入 1/4體積比sevage試劑（氯仿:正丁醇=4:1），室溫下置于搖床振蕩30 min，然后8 000 r/min離心10 min，保留水相。重復多次，直至蛋白完全除去，凍干保存。

1.3.3 胞外多糖的測定采用硫酸-苯酚法[12]測定ZX-5胞外多糖含量。測試并繪制葡萄糖標準曲線[13]，得到線性回歸方程：Υ=0.0047Χ+0.041，R2=0.994

一次改變一個獨立變量，同時保持其他因素在固定水平（初始pH 5，裝液量100 mL/250 mL，接種量5%，溫度28 ℃，轉速150 r/min，初始培養(yǎng)基為基礎產(chǎn)糖培養(yǎng)基）。選取3%水平的不同碳源（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖）、0.3%水平的不同氮源（蛋白胨、酵母浸粉、硝酸鈉、尿素），以及不同培養(yǎng)條件即初始 pH（5.50、6、6.50、7 和 7.50）、培養(yǎng)溫度（10 ℃、20 ℃、28 ℃、35 ℃、40 ℃）進行單因素實驗。培養(yǎng)20 h，測定胞外多糖產(chǎn)量。

1.3.5 響應面實驗設計

在單因素試驗基礎上，運用Box Behnken的中心組合設計原理，選取蔗糖濃度、溫度和硝酸鈉濃度作為自變量，細菌胞外多糖產(chǎn)量作為響應值，設計3因素3水平試驗進行響應面分析，如表1所示，從而獲得菌株高產(chǎn)胞外多糖的最佳培養(yǎng)條件。

表1 響應面試驗的因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.3.6 方差分析

使用IBM SPSS Statistics 26統(tǒng)計軟件對單因素優(yōu)化實驗結果進行單因素方差分析，通過F檢驗確定其顯著性，并以p值表示，以確定對ZX-5產(chǎn)胞外多糖影響顯著的因素。

1.3.7 多糖保濕性測定

語法即語言的法則。扎實的基礎語法知識對于學生準確理解文章中的長難句以及做好主觀卷中的語法填空、改錯題尤其是寫作是極其重要的。對于語法復習，我們將采用“思維導圖+重難點、考點突破+專項練習+閱讀分析+寫作運用”的復習方法對語法進行系統(tǒng)、全面的復習。要求學生通過思維導圖系統(tǒng)了解各個語法項目，掌握、落實和運用語法重點。教師幫助學生突破重難點、解決學生問題。教師分工收集和改編各個語法重點在近幾年高考題中的考查。試題講評過程中選擇性的讓學生分析長難句。同時教師在復習過程中要加強鍛煉學生將語法知識在英語寫作中的正確、靈活使用，為英語寫作增色、提分。

參照魯鐵等[14]實驗方法，稱取ZX-5胞外多糖、甘油、殼聚糖的干燥樣品各0.20 g，置于培養(yǎng)皿中，向培養(yǎng)皿中分別加入5 g的蒸餾水將樣品完全均勻地濕潤，置于干燥器中（硅膠干燥劑環(huán)境），放入25 ℃恒溫箱中，定時稱量樣品的重量。水分殘存率為放置后樣品中水分的質(zhì)量比放置前樣品中水分的質(zhì)量。實驗設置平行重復。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

實驗均設置3組平行，數(shù)據(jù)采用Origin軟件作圖，結果以平均值±標準差表示。在“響應面方法”中，使用Design Exper（t版本11.1.0.1, Stat-Ease Inc., Minneapolis,MN, USA）統(tǒng)計軟件進行回歸分析。多項式模型方程的擬合質(zhì)量由確定系數(shù)R2表示，其統(tǒng)計顯著性通過F檢驗來確定。每個回歸系數(shù)的顯著性水平由t檢驗確定，顯著性水平以p值給出。

2 結果與分析

2.1 基于16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

通過對菌株ZX-5的16S rRNA基因核苷酸序列測定，完成GenBank的BLAST同源性比對，并下載相似序列，構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 1）。經(jīng)鑒定，ZX-5是一株類芽孢桿菌（Paenibacillussp.）。

2.2 單因素結果分析

2.2.1 碳源對ZX-5產(chǎn)胞外多糖的影響

碳源優(yōu)化結果如圖2a，不同碳源之間對多糖產(chǎn)量具有顯著性差異（p<0.05），蔗糖為碳源時，菌株ZX-5的胞外多糖產(chǎn)量最大，為18.03 g/L。據(jù)報道細菌產(chǎn)胞外多糖的最適碳源多為蔗糖[15]，如周璇等[16]在敦煌地區(qū)篩選的地衣芽孢桿菌Ⅱ4-01，25 g/L蔗糖為碳源，胞外多糖產(chǎn)量最大達8.59 g/L，王波等[17]對多粘類芽孢桿菌菌株XZ-2的培養(yǎng)基配方及發(fā)酵培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化研究，表明蔗糖15 g/L為最佳碳源；大多數(shù)類芽孢桿菌利用蔗糖發(fā)酵產(chǎn)糖量較高[18]。菌株ZX-5以可溶性淀粉作為碳源時，由于淀粉本身是多糖，在發(fā)酵過程中可能菌體產(chǎn)胞外多糖量沒有消耗的淀粉量大，因此測得的產(chǎn)糖量結果是負值。蔗糖濃度優(yōu)化結果如圖2b，當蔗糖濃度為200 g/L時，胞外多糖產(chǎn)量最大為37.59 g/L，蔗糖濃度進一步增大，多糖產(chǎn)量反而減少，可能是蔗糖濃度過高，外界滲透壓較大，不利于菌株生長和產(chǎn)胞外多糖。

2.2.2 氮源對ZX-5胞外多糖產(chǎn)量的影響

測定不同氮源培養(yǎng)液中ZX-5的產(chǎn)糖量，結果如圖3所示，ZX-5發(fā)酵產(chǎn)糖過程中對硝酸鈉、酵母浸粉和尿素的利用率較高，但對蛋白胨利用率較低。以蛋白胨為氮源時，多糖產(chǎn)量僅為1.20 g/L，而以硝酸鈉為氮源時，產(chǎn)糖量最高，為17.18 g/L，表明該菌對速效氮源的利用率更高。在硝酸鈉濃度3 g/L時，菌株產(chǎn)胞外多糖量達到最大 13.90 g/L，與其它組有顯著性差異（p<0.05），氮源濃度過低，ZX-5生長所需氮源成為限制因素，影響其生長繁殖和合成胞外多糖，濃度過高，碳氮比值變小，生長環(huán)境不適宜，同樣會產(chǎn)生負面影響。因此，初步確定最適氮源濃度為3 g/L硝酸鈉。

2.2.3 溫度、pH對ZX-5胞外多糖產(chǎn)量的影響

不同培養(yǎng)溫度下ZX-5產(chǎn)糖量如圖4a所示，20 ℃時產(chǎn)糖量最大。隨著培養(yǎng)溫度的降低，胞外多糖的產(chǎn)量逐漸增加，與Bruno等[19]研究結果一致，可能該菌胞外多糖能夠保護菌株生長繁殖，溫度過低時，影響體內(nèi)相關酶的活性，產(chǎn)糖量進而減小。不同溫度間存在顯著性差異，表明溫度是產(chǎn)糖量的主要影響因素之一。不同pH對微生物生長代謝影響很大，孫紅斌[20]等人研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液的初始pH值對多糖產(chǎn)量有較大影響，pH過高或過低均會影響菌株的生長繁殖，進而影響多糖產(chǎn)量，本研究也印證了這一點，如圖 4b所示，當pH增加到7.50或者降低為5.50時，兩組數(shù)據(jù)沒有顯著性差異，但胞外多糖產(chǎn)量下降明顯，pH為6時，EPS產(chǎn)量達到最大值23.12 g/L，差異為極顯著水平（p<0.01），因此選擇培養(yǎng)基初始pH值為6。

2.3 方差分析

在單因素實驗優(yōu)化基礎上，進行方差分析來確定各因素對ZX-5胞外多糖產(chǎn)量影響的大小。方差分析結果如表2所示。

根據(jù)表2結果可以得出：硝酸鈉濃度、蔗糖濃度、初始 pH、發(fā)酵溫度的p<0.01，說明硝酸鈉濃度、蔗糖濃度、初始pH、發(fā)酵溫度均對ZX-5產(chǎn)胞外多糖量產(chǎn)生極顯著影響，初始pH影響菌的生存能力，間接影響胞外多糖的產(chǎn)量，因此不適宜做響應面的優(yōu)化指標，最終選擇硝酸鈉濃度、蔗糖濃度、發(fā)酵溫度這三個影響因素。

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance

表3 Box Behnken試驗設計與結果Table 3 Response surface test design and results

2.4 多因素結果分析

進行3因素3水平的響應面實驗，共17組實驗。表3為實驗設計與結果。

2.5 響應面分析

對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到二次方程為：

式中：

Y——胞外多糖產(chǎn)量，g/L；

A——蔗糖濃度，g/L；

B——溫度，℃；

C——硝酸鈉濃度，g/L。

對二次模型進行方差分析，從中可以看出（表4），模型F值為127.93，具有顯著性。p值小于0.05表示模型項具有顯著性，p值小于0.01表示模型項具有極顯著性，同樣的，A、B、C、AB、BC、A2、C2、和B2均具有極顯著性。失擬項F值為43.64，p值大于0.05，意味著失擬項相對于純誤差不顯著。決定系數(shù)R2=0.99>90%，說明EPS產(chǎn)量的試驗值與模型回歸數(shù)值有良好的一致性。模型的校正系數(shù) R2Adj=0.98，說明該模型能夠解釋相應值變化的98%，模型擬合度較好，預測值與實測值有較好的相關性，可用于對ZX-5胞外多糖發(fā)酵生產(chǎn)進行分析和預測。

三個因素（溫度、硝酸鈉濃度和蔗糖濃度）對ZX-5胞外多糖產(chǎn)量的交互作用，可以由響應面圖和等高線圖直觀地看出，由圖 5（a）和（d）可看出，溫度和蔗糖濃度增大或減小，胞外多糖產(chǎn)量也隨之變化，二者之間存在交互作用故變化趨勢不同，圖的顏色的變化表示多糖產(chǎn)量從少到多的變化，變化的越快，表示坡度越大，即對試驗結果的影響更為顯著。圖5（b）和（e）是硝酸鈉濃度和蔗糖濃度對ZX-5胞外多糖產(chǎn)量影響的響應面及等高線圖，圖 5（c）和（f）是硝酸鈉濃度和溫度對ZX-5胞外多糖產(chǎn)量影響的響應面及等高線圖。

表4 二次模型的方差分析Table 4 Analysis of variance in quadratic model

2.6 多糖最優(yōu)條件驗證

通過單因素和響應面實驗分析，得到最佳產(chǎn)糖條件為：蔗糖200 g/L，硝酸鈉3 g/L，溫度20 ℃，其它條 件 為 K2HPO4·3H2O 3 g/L ，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.50 g/L，pH 6，轉速 150 r/min，21 h，預測產(chǎn)糖量為35.48 g/L。根據(jù)最佳培養(yǎng)方案，進行三組平行實驗，實驗結果平均值為34.55 g/L，與預測結果接近。

2.7 多糖的保濕性

胞外多糖作為天然物質(zhì)具有一定的濕度，可應用于食品工業(yè)及化妝品工業(yè)中。本研究表明（圖6），干燥環(huán)境中，ZX-5胞外多糖在 38 h的水分殘留率為50%，保濕性略優(yōu)于殼聚糖和甘油。Li等[12]研究一株假單胞菌PGM37的胞外多糖，發(fā)現(xiàn)其保濕能力優(yōu)于甘油，但次于透明質(zhì)酸，在化妝品和臨床醫(yī)學領域具有潛在應用價值。Chao等[21]研究發(fā)現(xiàn)蔗糖酯和玉竹多糖混合可調(diào)節(jié)水分結合能力，并提高多孔碳水化合物基質(zhì)的保濕和防潮性能。Yong等[22]研究發(fā)現(xiàn)Phyllobacteriumsp.產(chǎn)生的EPS是一種新型多糖，具有良好的流變性和優(yōu)異的保水能力。本研究中 ZX-5菌株的胞外多糖易溶于水，具有良好的保水能力，在32 h時，水分殘留率優(yōu)于殼聚糖6%，在37 h水分殘留率優(yōu)于甘油7.52%，并且在70 h之前，保濕能力一直大于甘油和殼聚糖。因此ZX-5胞外多糖可作為天然物質(zhì)保持一定的濕度，具有應用于食品工業(yè)或化妝品工業(yè)的保濕潛力。

3 結論

3.1 本研究對分離自湖泊沉積物的一株產(chǎn)胞外多糖的細菌菌株，通過單因素和響應面實驗分析，得到最佳產(chǎn)糖條件為：初始蔗糖濃度200 g/L、硝酸鈉3 g/L、K2HPO4·3H2O 3 g/L、KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.50 g/L，pH 6，發(fā)酵溫度20 ℃。該最優(yōu)條件下菌株搖瓶發(fā)酵的胞外多糖產(chǎn)量為34.55 g/L，是基礎水平17.15 g/L的2.01倍，產(chǎn)糖量提升比較明顯。本研究類芽孢桿菌ZX-5的多糖產(chǎn)量，在目前相關報道中處于前列。

3.2 目前的保濕劑主要為多元醇類、甘油、透明質(zhì)酸及其鈉鹽等品種，近年來研究者在拓寬傳統(tǒng)保濕劑的應用和開發(fā)新型保濕劑方面做了許多工作，尤其以多糖類物質(zhì)為主。本研究所得到的類芽孢桿菌ZX-5所產(chǎn)胞外多糖在56 h前保濕性一直優(yōu)于甘油和殼聚糖，在38 h其水分殘留率仍為50%，具有較長時效的保濕性能，在食品和化妝品等水分保持應用中，具有一定的潛力和價值，有待于進一步開發(fā)。