低GI高蟲草素和噴司他丁含量蛹蟲草固體發(fā)酵條件的優(yōu)化

胡龍，范秀芝，姚芬，殷朝敏，史德芳，高虹，胡中澤*

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023）（2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北武漢 430064）（3.國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖北武漢 430064）（4.林下經(jīng)濟(jì)湖北省工程研究中心，湖北武漢 430064）

蛹蟲草（Cordyceps militaris），又名北冬蟲夏草，含有與冬蟲夏草相似的生物活性成分[1-4]，但其子實(shí)體的核苷類成分含量與抗氧化活性高于冬蟲夏草[5,6]，且冬蟲夏草不能合成蟲草素和噴司他丁[7]。與冬蟲夏草相比，蛹蟲草具有明顯的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，因此，它是冬蟲夏草理想的替代品[8-10]。但蛹蟲草子實(shí)體栽培周期長(zhǎng)，栽培過(guò)程需要對(duì)溫度、光照、濕度等多因素嚴(yán)格控制，生產(chǎn)成本高[11,12]。近年來(lái)，有報(bào)道指出蛹蟲草菌絲體發(fā)酵谷物所得到的發(fā)酵菌質(zhì)中也含有蟲草多糖、蟲草素等，且與子實(shí)體中的功效相同[13-15]，因此可考慮用發(fā)酵菌質(zhì)來(lái)替代蛹蟲草子實(shí)體用于產(chǎn)品開發(fā)，以縮短生產(chǎn)周期、節(jié)約生產(chǎn)成本[12]。

蟲草素（cordycepin），化學(xué)名為 3′-脫氧腺苷（3'-deoxyadenosine），具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抑菌抗炎、保護(hù)肝臟心臟、抗肺纖維化等多種功效[16]，其作為腺苷受體的激活劑，在新冠肺炎防治中起到積極作用[17]。但在使用過(guò)程中，純化后的蟲草素在人體內(nèi)易受腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）的脫氨基作用快速降解，形成無(wú)生物活性的3′-脫氧肌苷（3'-deoxyinosine）而失效[18,19]。2017 年，Xia 等[7]發(fā)現(xiàn)了蟲草素的保護(hù)分子-噴司他?。╬entostatin），其分子中的脫氧核苷結(jié)構(gòu)，能與ADA緊密結(jié)合并抑制其活性，保護(hù)蟲草素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而有效防止蟲草素的降解。

血糖指數(shù)（glycemic index，GI）是衡量碳水化合物對(duì)血糖反應(yīng)的一種有效指標(biāo)[20]。根據(jù)GI值的高低，分為高GI（GI＞70）、中GI（55≤GI≤70）和低GI（GI＜55）食品[21]。按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)WS/T 652-2019食物血糖生成指數(shù)測(cè)定方法的規(guī)定[22]，食品的 GI值需要通過(guò)測(cè)定人體餐后血糖變化量而得，檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜且費(fèi)用昂貴，目前我國(guó)具備檢測(cè)能力的機(jī)構(gòu)很少。因此，研究者們大都通過(guò)體外消化這一簡(jiǎn)單有效的方法來(lái)測(cè)定食品的GI值。為與人體試驗(yàn)測(cè)定GI值相區(qū)分，研究人員多用預(yù)估血糖指數(shù)（expected glycemic index，eGI）來(lái)表示[23-25]。

前期研究證實(shí)了利用蛹蟲草對(duì)大米發(fā)酵，能有效降低大米的eGI值[26]。為進(jìn)一步降低發(fā)酵菌質(zhì)的eGI值，并提高發(fā)酵菌質(zhì)中蟲草素和噴司他丁活性物質(zhì)的含量，本研究在前期篩選獲得蛹蟲草菌株基礎(chǔ)上以發(fā)酵菌質(zhì)eGI值、蟲草素和噴司他丁含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，以期為后續(xù)直接利用發(fā)酵菌質(zhì)開發(fā)營(yíng)養(yǎng)及功能食品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草菌株為全蟲草，購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種試驗(yàn)中心。

大米，湖北國(guó)寶橋米有限公司；燕麥，悅聯(lián)商業(yè)管理有限公司；豆粕，石家莊銀億科技有限公司；蟲草素，標(biāo)準(zhǔn)品上海源葉生物科技有限公司；噴司他丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海麥克林生化科技有限公司；豬胰α-淀粉酶、色譜級(jí)乙腈，美國(guó)Sigma公司；色譜級(jí)甲醇、乙酸銨，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；可消化淀粉及抗性淀粉試劑盒、淀粉葡萄糖苷酶，愛(ài)爾蘭Megazyme公司；甘氨酸、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等均為食品級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

FD5-3P真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)金西盟公司；KQ-5200 DE超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器公司；3K15高速冷凍離心機(jī)，德國(guó) Sigma公司；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基配置

馬鈴薯固體培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 L，pH自然。

液體完全培養(yǎng)基（liquid complete yeast medium，LCYM）：葡萄糖 20 g，蛋白胨 2 g，酵母膏 2 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，K2HPO41.00 g，KH2PO40.46 g，加蒸餾水定容至1 L，50 mL分裝。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：由固體培養(yǎng)料和營(yíng)養(yǎng)液按一定比例混勻裝入罐頭瓶，121 ℃滅菌30 min制成。其中，固體培養(yǎng)料又可分為主料和輔料。初始固體培養(yǎng)基包括：80%主料-20 g大米，20%輔料-5 g豆粕，營(yíng)養(yǎng)液-35 mL LCYM，料液比1:1.4（m/V）。

1.3.2 液體菌種制備

取一菌絲塊轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后，8 mm打孔器打孔，接入50 mL的LCYM培養(yǎng)基，每瓶接種6個(gè)菌絲塊，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)5 d。

1.3.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)

將液體菌種勻漿后按3 mL/罐接種到冷卻的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，5 ℃避光培養(yǎng)13 d。培養(yǎng)結(jié)束后收集發(fā)酵菌質(zhì)，冷凍干燥、粉碎后，檢測(cè)其eGI值、蟲草素和噴司他丁含量。

1.3.4 eGI值的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[26]，采用體外消化法測(cè)定蛹蟲草發(fā)酵菌質(zhì)eGI值。

1.3.5 蟲草素的測(cè)定

按照 NY/T 2116-2012[27]高效液相色譜法測(cè)定蛹蟲草發(fā)酵菌質(zhì)中蟲草素的含量。

色譜條件為：色譜柱 Inertsil ODS-SP（C18）柱250 nm×4.6 nm，5 μm；流動(dòng)相為乙腈-水（5:95），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.6 噴司他丁的測(cè)定

噴司他丁的測(cè)定參考文獻(xiàn)稍作修改[28]，取 1.00 g于50 mL容量瓶中，加水約40 mL，超聲處理10 min，用水定容，取2 mL樣液8000 r/min離心10 min后，將上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。

色譜條件為：色譜柱 Inertsil ODS-SP（C18）柱250 nm×4.6 nm，5 μm，流動(dòng)相為2.5 g/L乙酸銨溶液-甲醇-乙腈（96:2:2），流速為 1.0 mL/min，柱溫為 30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為282 nm。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在1.3.1的初始固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加一定比例燕麥替代大米作主料，LCYM 中添加甘氨酸作營(yíng)養(yǎng)液，輔料組成不變，采用單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)大米和燕麥質(zhì)量配比、豆粕添加量、營(yíng)養(yǎng)液中甘氨酸濃度、料液比四個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。

1.4.1 大米與燕麥配比單因素試驗(yàn)

在1.3.1的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，保持主料總重量為20 g，分別稱取質(zhì)量比值為10:0、9:1、3:7、5:5、7:3、1:9的大米與燕麥作為主料，裝入200 mL罐頭瓶，輔料與料液比不變配制培養(yǎng)基，滅菌冷卻后按1.3.3所述方法接種和培養(yǎng)，制備發(fā)酵菌質(zhì)。

1.4.2 豆粕添加量單因素試驗(yàn)

在 1.3.1固體培養(yǎng)基中，固定固體培養(yǎng)料總量為25 g，調(diào)節(jié)豆粕添加量分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%，料液比不變，滅菌冷卻后按1.3.3所述方法接種和培養(yǎng)，制備發(fā)酵菌質(zhì)。

1.4.3 營(yíng)養(yǎng)液中甘氨酸濃度單因素試驗(yàn)

在1.3.1固體培養(yǎng)基中，主料和輔料不變，分別配置0、1、4、8、16、20 g/L甘氨酸與LCYM混合營(yíng)養(yǎng)液，料液比不變，滅菌冷卻后按1.3.3所述方法接種和培養(yǎng)，制備發(fā)酵菌質(zhì)。

1.4.4 料液比單因素試驗(yàn)

分別按照 1:0.8、1:1.1、1:1.4、1:1.7、1:2.0比例取新鮮配置的LCYM加入到裝有20 g大米、5 g豆粕的200 mL罐頭瓶中，混合均勻，滅菌冷卻后按1.3.3所述方法接種和培養(yǎng)，制備發(fā)酵菌質(zhì)。

1.5 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素的基礎(chǔ)上，進(jìn)行大米與燕麥質(zhì)量配比（A）、豆粕添加量（B）、營(yíng)養(yǎng)液中甘氨酸濃度（C）、料液比（D）四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)（表1），按1.3.3所述方法接種和培養(yǎng)，制備發(fā)酵菌質(zhì)后，測(cè)定其 eGI值、蟲草素和噴司他丁含量。

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 1 L9(34) factors and levels of orthogonal experimental

1.6 發(fā)酵時(shí)間的確定

為進(jìn)一步獲得eGI值低、蟲草素和噴司他丁含量高的發(fā)酵菌質(zhì)，對(duì)優(yōu)化培養(yǎng)基中蛹蟲草菌絲體的最佳培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)定培養(yǎng)周期為60 d，每3 d取樣，測(cè)定發(fā)酵菌質(zhì)eGI值、蟲草素和噴司他丁含量。

1.7 擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)

以500 mL罐頭瓶為培養(yǎng)容器，將正交優(yōu)化所得培養(yǎng)基按等比例擴(kuò)大（2.5倍）加入罐頭瓶中制備固體發(fā)酵培養(yǎng)基。將液體菌種勻漿后按7.5 mL/罐接種到冷卻后的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25 ℃避光培養(yǎng)18 d，培養(yǎng)結(jié)束后收集發(fā)酵菌質(zhì)，測(cè)定eGI值、蟲草素和噴司他丁含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)。采用SPSS 25和Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析和作圖。差異顯著水平為p＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 大米與燕麥配比對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響

阮元等[29]發(fā)現(xiàn)維生素 B1的分解產(chǎn)物對(duì)蟲草素合成具有促進(jìn)作用，當(dāng)添加量為 0.83 g/L的維生素 B1時(shí)，發(fā)酵液中蟲草素的產(chǎn)量最高，較未添加維生素B1的空白組提高了75%。而燕麥中含有豐富的維生素，其中維生素B1較大米的含量高，且與其他谷物（如小麥、玉米、大米）相比，其 GI值較低[30]，因此選用燕麥代替部分大米。由圖1可知，隨著燕麥比例的增加，發(fā)酵菌質(zhì)eGI值顯著降低，蟲草素和噴司他丁含量都顯著增加（p＜0.05）。結(jié)果表明，與大米相比，燕麥確實(shí)有利于蛹蟲草菌株合成蟲草素，這與已有報(bào)道一致。劉紅等[31]發(fā)現(xiàn)選用燕麥與燕麥復(fù)合培養(yǎng)基所得子實(shí)體中蟲草素含量均較高其他培養(yǎng)基；胡景霞等[32]分別以早秈米、小米、玉米、燕麥、小麥這五種谷物為基質(zhì)，所得谷物發(fā)酵菌質(zhì)中燕麥組蟲草素含量最高。當(dāng)主料中大米與燕麥配比為3:7時(shí)，eGI值達(dá)到最低為57.25，蟲草素含量達(dá)到最高為4092.60 mg/kg，噴司他丁含量為601.79 mg/kg，當(dāng)燕麥在主料中占比超過(guò)70%時(shí)，eGI值反而升高，這可能是由大米和燕麥淀粉含量與種類差異造成的。因此，選取大米與燕麥配比為3:7進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 豆粕添加量對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響

豆粕作為輔料為蛹蟲草菌種提供氮源，俞海峰[33]選用豆粕、大豆粉、棉籽粉、酵母粉、花生粉及麩皮作為氮源，以發(fā)酵液中蟲草素含量和菌餅干重為指標(biāo)，確定豆粕為最適氮源，有利于蛹蟲草菌株合成蟲草素，因此本研究選用豆粕作為蛹蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基輔料。由圖2可知，隨著豆粕添加量上升，發(fā)酵菌質(zhì)eGI值顯著降低，蟲草素含量與噴司他丁含量都顯著增加（p＜0.05）。當(dāng)豆粕添加量為20%時(shí)，噴司他丁含量達(dá)到最高，為561.90 mg/kg，當(dāng)豆粕添加量為25%時(shí)，eGI值達(dá)到最低58.57，噴司他丁含量略微下降。綜合考慮，選取豆粕添加量為25%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 營(yíng)養(yǎng)液中甘氨酸濃度對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響

甘氨酸作為蟲草素的前體物質(zhì)，有利于蛹蟲草菌種合成蟲草素[34]。由圖3可知，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)液中甘氨酸濃度為0～8 g/L時(shí)，隨著甘氨酸濃度升高，eGI值顯著降低，蟲草素含量與噴司他丁含量都呈上升趨勢(shì)（p＜0.05）。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)液中甘氨酸濃度為8 g/L時(shí)，eGI值降到最低為56.19，蟲草素含量與噴司他丁含量都接近最大值，分別為7009.49 mg/kg、632.78 mg/kg，當(dāng)甘氨酸濃度繼續(xù)升高時(shí)，蟲草素含量與噴司他丁含量的上升趨勢(shì)變緩。因此，選取營(yíng)養(yǎng)液中甘氨酸濃度為8 g/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 料液比對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響

營(yíng)養(yǎng)液為蛹蟲草菌種提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但過(guò)多的營(yíng)養(yǎng)液使培養(yǎng)基質(zhì)的透氣性與含氧量降低，不利于菌絲的生長(zhǎng)[35]。由圖4可知，隨著營(yíng)養(yǎng)液的增加，eGI值呈上升趨勢(shì)，蟲草素與噴司他丁含量均呈下降趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1:1.1時(shí)，eGI值達(dá)到最低為54.83，蟲草素與噴司他丁含量都達(dá)到最大值，分別為 4725.65、621.10 mg/kg。因此，選取料液比為1:1.1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of L9(34) orthogonal experimental

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)配方，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由極差分析可知，四個(gè)因素對(duì)eGI值和蟲草素含量的影響順序?yàn)?B＞D＞A＞C，對(duì)噴司他丁含量的影響順序?yàn)?B＞A＞D＞C，表明豆粕添加量對(duì)三個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)都具有重要影響。其中 eGI值最優(yōu)組合為A3B3C3D3，蟲草素和噴司他丁含量的最優(yōu)組合均為A3B3C2D1。差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)，甘氨酸濃度在 C2和C3水平時(shí)蟲草素含量及噴司他丁含量差異不顯著，此外，考慮料液比D對(duì)三個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的綜合影響，選擇 A3B3C3D1為發(fā)酵培養(yǎng)最優(yōu)配方，即大米與燕麥配比為4:6作主料占70%，豆粕30%，營(yíng)養(yǎng)液中甘氨酸濃度為10 g/L，料液比為1:0.9。以此配方進(jìn)行蛹蟲草固體發(fā)酵，25 ℃培養(yǎng)13 d后所得到的發(fā)酵菌質(zhì)eGI值為53.81，達(dá)到低GI水平；蟲草素含量為8656.04 mg/kg，噴司他丁含量為776.62 mg/kg。

2.3 發(fā)酵時(shí)間的確定

發(fā)酵菌質(zhì)的 eGI值、蟲草素和噴司他丁含量在0～60 d期間的變化趨勢(shì)如圖5所示，eGI值在0～12 d內(nèi)顯著下降（p＜0.05），在12～60 d期間略微上升，可能是由于蟲草菌絲持續(xù)生長(zhǎng)對(duì)發(fā)酵菌質(zhì)中淀粉種類的比例產(chǎn)生了變化。發(fā)酵菌質(zhì)的蟲草素在0～60 d培養(yǎng)周期內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加不斷累積，到18 d時(shí)達(dá)到峰值，其后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)含量基本穩(wěn)定，這一現(xiàn)象與Wen等[36]的報(bào)道類似，他們發(fā)現(xiàn)蛹蟲草子實(shí)體中蟲草素含量在15～60 d內(nèi)快速上升，當(dāng)?shù)竭_(dá)一定數(shù)值后，蟲草素含量基本穩(wěn)定。而發(fā)酵菌質(zhì)中噴司他丁含量變化趨勢(shì)與蟲草素的有所不同，在0～18 d培養(yǎng)期內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，噴司他丁含量逐漸增加，在第18 d達(dá)到峰值，其后逐漸下降，并在第36 d時(shí)基本穩(wěn)定。目前并無(wú)不同培養(yǎng)時(shí)間蛹蟲草中噴司他丁含量的報(bào)道，因此出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因還有待進(jìn)一步研究。綜合三個(gè)指標(biāo)確定最佳發(fā)酵時(shí)間為18 d，此時(shí)發(fā)酵菌質(zhì)中蟲草素和噴司他丁含量分別為12161.28 mg/kg、1033.23 mg/kg。

2.4 擴(kuò)大驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為驗(yàn)證本研究所獲得培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)時(shí)間的有效性，在500 mL罐頭瓶中接種蛹蟲草菌絲培養(yǎng)18 d后，測(cè)定發(fā)酵菌質(zhì) eGI值為 53.86，蟲草素含量為12204.55 mg/kg，噴司他丁含量為1021.48 mg/kg。擴(kuò)大驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與優(yōu)化試驗(yàn)中所得結(jié)果差異不顯著，表明本研究所得培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間是可靠的，可應(yīng)用于蛹蟲草發(fā)酵菌質(zhì)的規(guī)模生產(chǎn)中。

3 結(jié)論

本研究以燕麥部分替代大米為主料，豆粕為輔料，LCYM添加甘氨酸為營(yíng)養(yǎng)液，通過(guò)單因素和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定了蛹蟲草固體配方為：配比為4:6的大米和燕麥用量占70%，豆粕添加量為30%，含10 g/L甘氨酸的LCYM培養(yǎng)基作營(yíng)養(yǎng)液，料液比為1:0.9。經(jīng)過(guò)60 d發(fā)酵周期，確定出最佳培養(yǎng)時(shí)間為18 d。最終經(jīng)過(guò)擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)在25 ℃避光培養(yǎng)18 d，所得發(fā)酵菌質(zhì)eGI值由65.86下降到53.86，達(dá)到了低GI水平；蟲草素含量為 12204.55 mg/kg，噴司他丁的含量為 1021.48 mg/kg，與初始配方相比，蟲草素含量增加了348.13%，噴司他丁含量提高了81.79%，為后續(xù)低GI功能食品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。