鮮切苦菊、生菜和紫甘藍(lán)上假單胞菌的分離鑒定及其噬菌體的初步篩選

楊園平，潘旬，雷智棟，石慧

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

鮮切蔬菜是經(jīng)清洗、切割、包裝等加工過程制成的即食產(chǎn)品，是人類飲食的重要組成部分[1]，是人類攝取礦物質(zhì)和維生素的重要來源，其高含量的維生素、纖維、礦物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)是有益人體健康的重要因素[2]，既保留鮮切蔬菜原有的物理、化學(xué)、感官和營養(yǎng)特性，可利用度高（100%可食用）[3]，又滿足消費者對于天然、營養(yǎng)、新鮮、方便的生活方式的需求。隨著人們生活節(jié)奏的加快以及對輕食健康生活方式的追求，人們對鮮切苦菊、生菜和紫甘藍(lán)的關(guān)注度越來越高，其憑借新鮮、方便、環(huán)保及健康的特點已成為國內(nèi)外蔬菜加工的主流?？嗑漳廴~中氨基酸種類齊全，蛋白質(zhì)、膳食纖維含量較高；生菜富含維生素、纖維素、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)；紫甘藍(lán)富含多酚、花色苷及硫代葡萄糖苷等營養(yǎng)成分。然而，水果蔬菜是屬于易腐敗易變質(zhì)的農(nóng)產(chǎn)品[4]，巨量的果蔬浪費是全球面臨難題[5]。

鮮切果蔬在從收獲、加工、包裝、運輸，最后到銷售的過程中都會發(fā)生微生物的污染，導(dǎo)致鮮切果蔬上的微生物種群發(fā)生改變[6,7]。在加工過程中，鮮切果蔬因為本身高水分的特性，再加上鮮切生菜加工過程中的物理損傷導(dǎo)致的傷口暴露，汁液流出，提供給微生物有益的生存環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)，使微生物大量繁殖，導(dǎo)致鮮切果蔬加快腐敗變質(zhì)。因此，鑒定出果蔬中常見優(yōu)勢腐敗菌，從而針對性加以控制，以期更好地延長其保質(zhì)期就尤為重要。

在很多研究中都證明假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）是鮮切蔬菜葉面上的主要腐敗菌[8-10]，通過產(chǎn)生水解酶（果膠酶），致使蔬菜軟腐爛。保持低溫是常用的抑制腐敗菌生長繁殖的手段，但某些假單胞菌是嗜冷菌，因此在冷藏保存的鮮切蔬菜上，它們可以正常繁殖[11]。常見的假單胞菌有銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）[12]。其中銅綠假單胞菌是條件致病菌[13]，可引起人嚴(yán)重感染，包括敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎、中耳炎和角膜炎等[14]；熒光假單胞菌在4 ℃時繁殖速度很快，是低溫狀態(tài)下常見腐敗菌，人感染了會引起敗血癥、感染性休克、血管內(nèi)凝血等后果[15]。

噬菌體是專門攻擊細(xì)菌，并在其細(xì)胞內(nèi)繁殖的一類病毒，對其他類型的細(xì)胞沒有影響[16]。噬菌體在自然界中廣泛分布[17]，且其具有高度特異性，一種噬菌體只針對某一種細(xì)菌，通常在單獨屬或種內(nèi)有特異性，因此它不會影響其他非目標(biāo)細(xì)菌[18]，這也使得噬菌體可被應(yīng)用于鮮切蔬菜中針對性地殺滅假單胞腐敗菌。利用噬菌體控制銅綠假單胞菌的感染在醫(yī)療方面被廣泛應(yīng)用，許多研究表明銅綠假單胞菌噬菌體可有效控制由其引起的呼吸道感染[19]、肺部感染[20]等，熒光假單胞菌主要引起食物腐敗，Nascimento等人[21]分離得到一株熒光假單胞菌噬菌體并進行抑菌應(yīng)用，結(jié)果表明噬菌體對變質(zhì)乳中的熒光假單胞菌具有跟大抑菌潛力。Zhang等人[22]利用沙門氏菌噬菌體的內(nèi)溶酶成功對液體樣品和固體樣品中的銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌進行了有效控制，并對他們在各種固體表面形成的生物膜進行了抑菌研究，但關(guān)于利用噬菌體控制鮮切蔬菜上的假單胞菌鮮有研究。

本研究以鮮切苦菊、生菜和紫甘藍(lán)為研究對象，從中篩選分離得到4株假單胞菌并對其鑒定，以鑒定出的兩株假單胞菌為宿主菌篩選分離得到噬菌體。再將這兩株假單胞菌回接至滅菌的三種鮮切蔬菜中，鑒定其致腐能力。對于進一步了解鮮切蔬菜中的假單胞菌至關(guān)重要，以便有針對性地對鮮切蔬菜中的假單胞菌加以控制，為鮮切蔬菜的保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 實驗樣品

鮮切生菜，鮮切苦菊，鮮切紫甘藍(lán)均購于北碚區(qū)永輝超市、天生菜市場及渝北區(qū)新世紀(jì)超市，共9個樣品；噬菌體實驗所用的水樣源于重慶市北碚區(qū)龍鳳溪與嘉陵江。

1.1.2 實驗試劑

假單胞菌（CFC）培養(yǎng)基、LB肉湯、PALCAM瓊脂、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；agar瓊脂，上海源葉生物科技有限公司；全式金試劑盒，北京三藥科技開發(fā)公司；二甲亞砜，上海生工生物工程有限公司；次氯酸鈉、乙醇（95%）、丙三醇、鹽酸，重慶川東化工有限公司；氯化鈣（分析純）、氯化鈉（分析純），上海泰坦科技股份有限公司；MgSO4·7H2O（分析純），成都市科龍化工試劑廠；Tris（分析純），索萊寶生物技術(shù)有限公司；SM 緩沖液（由 NaCl、MgSO4·7H2O、Tris-HCl和蒸餾水按一定比例配制）。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

SQP電子天平，Sartorius；DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱、MX-F微型渦旋混合儀、DK-98-II萬用電爐，上海瀘西分析儀器有限公司；BHC-1300IIA/B3生物安全柜，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZF-30KB立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械有限公司；10-1000 μL移液器，上海泰坦科技股份有限公司；DZF-6021鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BCD-649W普通冰箱，青島海爾集團；SW-CJ-FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；VeritiTM2720 PCR熱循環(huán)儀，賽默飛世爾中國；Mill-Q純水系統(tǒng)，Merck Millipore；U410超低溫冰箱，NEW BRUNSWICK Premium；THZ-D恒溫?fù)u床，江蘇太倉市實驗設(shè)備廠；5810R冷凍高速離心機，Eppendorf；ZF-90多功能暗箱紫外透射儀，上海寶山顧村電光儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 假單胞菌的分離與鑒定

剪取5 g腐敗樣品于50 mL錐形瓶，加入45 mL 0.85%生理鹽水，振蕩，靜置，制成菌液。吸取50 μL菌液，涂布于假單胞菌（CFC）選擇培養(yǎng)基，放入37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h。挑取培養(yǎng)基上形態(tài)不同的菌落，在假單胞菌（CFC）培養(yǎng)基上進行平板劃線，放入37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h。重復(fù)平板劃線，直至獲得大小、形態(tài)相同的菌落。

將純化后的菌株提取DNA，用全式金DNA提取試劑盒依據(jù)說明書提取 DNA，提取的 DNA產(chǎn)物于-20 ℃保存。稱取2.5 g瓊脂糖置于25 mL TAE電泳緩沖液中，稱重，加熱融化，然后用TAE配平，趁熱加入染料，待溫度降至 60 ℃左右時，均勻鋪板，制成1%的瓊脂糖凝膠。PCR反應(yīng)結(jié)束后，加樣（DNA示蹤劑染色），以200 V，120 mA進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀觀察記錄結(jié)果。

表1 PCR試劑及用量Table 1 PCR reagents and dosage

PCR擴增，將提取的DNA進行PCR擴增，正向引物為 27 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），反向引物為1492 R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGA CTT-3’）[23]，總體系為30 μL，其中各種試劑及用量見表1。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸5 min：4 ℃保存。PCR產(chǎn)物測序，由上海生物工程公司測序，生物工程（上海）公司完成，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站，BLAST數(shù)據(jù)庫中進行同源性搜索，選取同源性較高的序列，用軟件 MAGE-X中的Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.2 假單胞菌致腐能力鑒定

在超凈滅菌臺中，挑取單菌落于30 mL LB培養(yǎng)液，搖床培養(yǎng)16 h，制成菌懸液。將鮮切菜樣本純水沖洗，洗去表面泥土，摘去外層葉片和不健康的葉片，用滅菌后的剪刀分成大小均一的組織片，再用 200 mg/kg次氯酸鈉溶液浸泡10 min，再用無菌純水沖洗，晾干。在超凈滅菌臺中，將處理過的鮮切菜組織片，分別浸泡0.85%生理鹽水（作為對照）和稀釋10倍后的菌懸液，裝入滅菌后的保險密封袋，室溫保存，每天對蔬菜進行感官評定分析[24]，觀察記錄鮮切蔬菜的組織結(jié)構(gòu)、顏色與氣味，進而評價鮮切蔬菜的腐敗程度。

1.2.3 噬菌體的分離與純化

從重慶市北碚區(qū)龍鳳溪水與嘉陵江采集水樣，水樣通過濾紙過濾，加入終濃度為1 mmol/L的CaCl2[25]，在8000 ×g離心4 min，取上清液用無菌0.22 μm濾膜過濾到無菌容器。將純化后的假單胞菌挑取單菌落接種到LB培養(yǎng)基中并過夜培養(yǎng)。將處理后的水樣與過夜培養(yǎng)的宿主菌混勻加入2× LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)液離心后收集上清液，上清液通過0.22 μm濾膜過濾。取10 μL濾液滴在含有宿主菌的雙層板中并觀察噬菌斑[26]。

利用雙層平板法純化噬菌體。用無菌牙簽挑取雙層板上的噬菌斑加入1 mL的SM緩沖液震蕩混勻后靜置20 min，離心后取上清液到無菌容器中。將上清液10倍稀釋后，取稀釋液與等體積的假單胞菌菌液混合均勻，并在室溫下靜置15 min。將混合物全部加入5 mL LB soft agar中混勻，傾倒在TSA板上。待上層軟瓊脂凝固后，倒置放于37 ℃培養(yǎng)16 h，挑取大且透亮的單斑加入1 mL的SM緩沖液中，重復(fù)上述的步驟5～6次，直到得到大小、形態(tài)相同的單斑為止。將純化后的噬菌體加入10%二甲亞砜溶液混合均勻后于-80 ℃保藏。

1.2.4 噬菌體對假單胞菌生長的抑制作用

挑取假單胞菌的單菌落于37 ℃、120 r/min下培養(yǎng)至對數(shù)初期，OD600nm為0.2。取4 mL對數(shù)初期菌液與1 mL噬菌體上清液加入10 mL LB培養(yǎng)基中，對照組加入1 mL LB培養(yǎng)液，放置于37 ℃搖床內(nèi)培養(yǎng)，每隔1 h取出測OD600nm，共8 h，實驗進行三組重復(fù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗進行三組重復(fù)。本研究中所得數(shù)據(jù)在 Excel 2016中統(tǒng)計，采用SPSS（version 22.0）軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，p＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用GraphPad Prism 8.0對數(shù)據(jù)進行作圖，運用ANOVA進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮切蔬菜中假單胞菌的分離與鑒定

將9份鮮切蔬菜樣本稀釋涂布于假單胞菌（CFC）培養(yǎng)基上進行菌落培養(yǎng)，共培養(yǎng)出四種菌落形態(tài)明顯不同的菌株，分別為菌株A、菌株B、菌株C和菌株D。觀察其菌落和形態(tài)特征，在 CFC選擇培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)48 h，菌株A的菌落顏色為綠色，菌落表面有光澤，菌落形狀為扁平濕潤，不透明，邊緣輕微波狀（圖1a）；菌株B的菌落顏色為黃綠色，菌落表面有光澤，菌落形狀為粘稠濕潤，不透明，邊緣不完整（圖1b）；菌株C的菌落顏色為黃色，菌落表面有光澤，菌落形狀為圓形，半透明，稍凸起，邊緣完整光滑（圖1c）；菌株D的菌落顏色為黃色，菌落形狀為圓形，較透明，中心稍隆起，邊緣輕微波狀（圖1d）。

利用平板劃線法對鮮切蔬菜中的四種未知菌株進行分離純化，采用16S rRNA的PCR擴增和基因序列分析方法[27]將篩選得到的四種未知菌株以總DNA為模板PCR擴增后經(jīng)電泳檢測，電泳凝膠上顯示出明顯的條帶，假單胞菌DNA均大于2000 bp，其PCR擴增產(chǎn)物均為1500 bp（圖2）。PCR產(chǎn)物由上海生物工程公司測序，測得它們的 16S rRNA序列后用SnapGene數(shù)據(jù)庫進行序列比對。圖3～6為四種未知菌株的16S rRNA基因序列比對結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST同源性匹配的菌株，并用軟件MEGA-X中的Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

由系統(tǒng)發(fā)育進化樹結(jié)合菌落及形態(tài)特征可得：未知菌株A與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的DNA匹配率最高，BLAST同源性為99%。未知菌株B與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DNA匹配率最高，BLAST同源性為99%。未知菌株C與熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）DNA匹配率較高，BLAST同源性為99%。未知菌株D與湖南假單胞菌（Pseudomonas hunanensis）DNA匹配率最高，BLAST同源性為100%。

結(jié)果表明，在檢測的9份樣品中，共篩選得到2株銅綠假單胞菌、1株熒光假單胞菌和1株湖南假單胞菌。其中來自永輝超市和天生菜市場的三種鮮切蔬菜樣品中含有一種具有相同菌落形態(tài)和顏色的假單胞菌，來自新世紀(jì)超市的三種鮮切蔬菜樣本中均含有兩種不同菌落形態(tài)和顏色的假單胞菌，說明不同來源的鮮切蔬菜上的假單胞菌具有多樣性。

2.2 銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌致腐能力鑒定

將銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌經(jīng)純化后制成菌液，接種至滅菌鮮切蔬菜進行回接實驗，對比三種蔬菜組織結(jié)構(gòu)：苦菊最為細(xì)軟，葉片最薄，分叉最多，水分中等；生菜，葉片厚度中等，水分最多，葉片軟脆；紫甘藍(lán)葉片最厚，水分最少，葉片硬脆。苦菊樣品在第3 d均出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象，相同保存時間下，0.85%生理鹽水處理后的苦菊樣品腐敗程度最低，腐敗的葉片數(shù)量最少，未流出腐敗組織液。熒光假單胞菌回接后的苦菊樣品腐敗程度其次，腐敗的葉片數(shù)量其次，汁液較少。銅綠假單胞菌回接后的苦菊樣品腐敗程度最強，腐敗葉片數(shù)量最多，汁液較多，散發(fā)惡臭，致嘔（圖7）；生菜樣品則在第4 d有明顯腐敗現(xiàn)象，0.85%生理鹽水處理后的生菜樣品腐敗程度最低，腐敗的葉片數(shù)量最少，未流出腐敗組織液。熒光假單胞菌回接后的生菜樣品腐敗程度其次，腐敗的葉片數(shù)量其次，汁液較少。銅綠假單胞菌回接后的生菜樣品腐敗程度最強，腐敗葉片數(shù)量最多，汁液較多，散發(fā)惡臭，致嘔（圖8）；紫甘藍(lán)在第6 d出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象，0.85%生理鹽水處理后的紫甘藍(lán)樣品腐敗程度最低，腐敗的葉片數(shù)量最少，未流出腐敗組織液，葉片橫截面為白色。熒光假單胞菌回接后的紫甘藍(lán)樣品腐敗程度其次，腐敗的葉片數(shù)量其次，紫色汁液較少，葉片橫截面為灰色。銅綠假單胞菌回接后的紫甘藍(lán)樣品腐敗程度最強，腐敗葉片數(shù)量最多，紫色汁液較多，葉片橫截面為黃色，散發(fā)惡臭，致嘔（圖9）。當(dāng)苦菊大部分腐敗的時候，生菜才開始有明顯的腐敗現(xiàn)象，當(dāng)生菜大部分腐敗的時候，紫甘藍(lán)才開始有輕微腐敗現(xiàn)象。由此可知，銅綠假單胞菌的致腐能力比熒光假單胞菌強，且在同種假單胞菌影響下的鮮切蔬菜腐敗速度從快到慢為：苦菊、生菜、紫甘藍(lán)。

2.3 噬菌體的篩選分離

噬菌體的富集培養(yǎng)液與銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌作雙層平板時出現(xiàn)了噬菌斑，說明噬菌體富集培養(yǎng)液中有針對這兩株假單胞菌的噬菌體。反復(fù)挑單斑純化，獲得兩株較純的噬菌體，分別命名為vB_Pae_503-1和vB_Pfl_503-2。vB_Pae_503-1的噬菌斑邊緣整齊、清晰透亮（圖10a）；噬菌體vB_Pfl_503-2、的噬菌斑邊緣整齊、中間清晰透亮且周圍有暈圈（圖10b）。

2.4 噬菌體對銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌生長的抑制作用

為了評估噬菌體對宿主菌生長的抑制作用，使用噬菌體vB_Pae_503-1和vB_Pfl_503-2分別感染銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌，檢測兩種假單胞菌OD600nm的變化。從5 h開始，噬菌體vB_Pae_503-1和vB_Pfl_503-2對宿主菌的抑制作用都顯著增加。噬菌體vB_Pae_503-1從2 h開始抑制銅綠假單胞菌的生長并持續(xù)了6 h。銅綠假單胞菌的OD600nm在8 h時相比于對照組降低了0.42（圖11a）。噬菌體vB_Pfl_503-2從1 h開始抑制熒光假單胞菌的生長并持續(xù)了8 h。熒光假單胞菌的OD600nm在8 h時相比于對照組降低了0.38（圖 11b）；結(jié)果表明，噬菌體 vB_Pae_503-1和vB_Pfl_503-2可以有效地控制銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌的生長，顯示出良好的抑菌潛力。

3 結(jié)論

3.1 本研究對鮮切苦菊、生菜和紫甘藍(lán)中的假單胞菌進行分離鑒定，結(jié)合菌落形態(tài)、菌體特征觀察及16S rRNA基因序列分析方法，篩選得到2株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginonas）、1株熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）和1株湖南假單胞菌（Pseudomonas hunanensis）。將銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌回接到三種鮮切蔬菜中，證實了銅綠假單胞菌的致腐能力明顯比熒光假單胞菌強，并發(fā)現(xiàn)不同鮮切蔬菜的腐敗速度不一樣，腐敗速度由快到慢：苦菊、生菜、紫甘藍(lán)。

3.2 此外，本研究以分離鑒定的銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌為宿主，從環(huán)境水樣中篩選分離了噬菌體vB_Pae_503-1和 vB_Pfl_503-2，可以持續(xù)控制假單胞菌引起的腐敗，其具有開發(fā)為生物制劑控制假單胞菌感染的潛力，為控制鮮切蔬菜中的假單胞菌提供了新的策略。需要進一步研究本文分離鑒定的假單胞菌在各種條件下對鮮切蔬菜的致腐能力以及噬菌體vB_Pae_503-1和vB_Pfl_503-2的生物學(xué)特性，從而評估其在假單胞菌腐敗防治中的潛在應(yīng)用。