大腸桿菌O157:H7實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)試劑盒的組建及活菌檢測(cè)

魏婉晴，孔梁宇，胡瑞瑞，陸兆新，周立邦，孟凡強(qiáng)，別小妹

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095）

大腸桿菌（Escherichia coli）是一種條件致病菌，在一定條件下可以引起人和多種動(dòng)物發(fā)生胃腸道或尿道等多種局部組織器官感染。腸出血性大腸桿菌（EnterohemorrhagicE. coli，EHEC）是大腸桿菌的一個(gè)亞型，以O(shè)157:H7血清型為代表菌株[1]。感染大腸桿菌O157:H7可導(dǎo)致廣泛的臨床表現(xiàn)，包括無(wú)癥狀感染、輕度腹瀉或嚴(yán)重疾病，如出血性結(jié)腸炎和溶血尿毒癥綜合征等[2-4]。食品和水源中的該病原體的監(jiān)測(cè)是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[5,6]。目前檢測(cè)大腸桿菌O157:H7主要依據(jù)國(guó)標(biāo)GB 4789.36-2016[7]，雖準(zhǔn)確性高、結(jié)果可靠，但步驟繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、難以達(dá)到快速檢測(cè)目的。而且大腸桿菌O157:H7的最小感染劑量非常低[8]，因此更需要建立具有高靈敏度的、簡(jiǎn)單快速且可靠的檢測(cè)方法。

使用飽和熒光染料的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Quantitative real-time PCR，RT-PCR）可以通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)染料和雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出熒光信號(hào)的改變獲得高分辨熔解曲線(xiàn)（High-resolution melting curves，HRM）[9,10]，通過(guò)熔解溫度（Melting temperature, Tm）區(qū)分不同的靶基因[11,12]，同時(shí)還可以利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析，具有高通量、高靈敏度、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)[13,14]，廣泛應(yīng)用于食品、生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[15-18]。

同時(shí)，在實(shí)際檢測(cè)中，死菌的存在有可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果，在外界應(yīng)激條件下細(xì)菌有可能進(jìn)入一種可存活但不可培養(yǎng)（Viable but non-culturable，VBNC）狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，細(xì)菌可以長(zhǎng)時(shí)間存活并保持潛在毒性[19]，因此，對(duì)食品樣品中致病菌活菌部分的定量區(qū)分是非常關(guān)鍵的。疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）是對(duì)核酸具有高度結(jié)合能力的光敏染料，能夠穿透死亡細(xì)胞/膜損傷細(xì)胞的細(xì)胞膜插入核酸，在強(qiáng)光照射下與DNA 形成穩(wěn)定的共價(jià)碳氮鍵，不可逆地修飾DNA，從而阻止死菌細(xì)胞DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增[20,21]。PMAxx是PMA的升級(jí)版，作用方式與PMA相同，可以使活菌與死菌之間的擴(kuò)增差異增加 3～7個(gè)Ct值，在區(qū)分活菌和死菌方面更有效。

本研究旨在組建新型大腸桿菌 O157:H7 HRM-RT-PCR快速檢測(cè)試劑盒，探討試劑盒的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性及抗干擾能力，并通過(guò)人工污染樣品試驗(yàn)探究試劑盒的實(shí)際應(yīng)用能力。通過(guò)單因素變化試驗(yàn)對(duì)PMAxx處理體系中的曝光時(shí)間、暗孵育時(shí)間、PMAxx濃度進(jìn)行優(yōu)化，最后將PMAxx處理體系與HRM-RT-PCR檢測(cè)試劑盒相結(jié)合，進(jìn)一步構(gòu)建能夠有效地定量大腸桿菌O157: H7活菌的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株與試劑

實(shí)驗(yàn)菌株共計(jì)27株，其中大腸桿菌9株，包括7株 O157:H7血清型（其中 2 株為標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC 43889、CICC 21530，5株為實(shí)驗(yàn)室自篩菌株，分別為P247、P248、P254、P255、P256），2 株非 O157:H7 血清型（ATCC HG15、ATCC 18683）。非大腸桿菌18株，其中有腸炎沙門(mén)菌（CICC21482）、鼠傷寒沙門(mén)氏菌（CICC 21483）、阪崎克羅諾桿菌（CICC 21563、CICC 21560）、藤黃微球菌（CMCC 28001）、奇異變形桿菌（CMCC 49005）、短小芽孢桿菌（CMCC 63202）、蠟樣芽孢桿菌（CMCC 63301、CCTCC AB 204038、CCTCC AB 2010134）、單增李斯特菌（CICC 21662、CICC 21633）、金黃色葡萄球菌（CICC 26074、CICC 22942）、熒光假單胞菌（CICC 21620、ASI.55）、副溶血性弧菌（CICC 17802、CICC 21528），以上菌株分別購(gòu)自美國(guó)模式微生物保藏中心、中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心、中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心、中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

主要試劑：TaKaRa Ex Taq? Hot Start Version，寶生物工程（大連）有限公司；SYTOTM9綠色熒光核酸染料，Molecular Probes公司；Omega細(xì)菌DNA提取試劑盒，Archimedes公司；PMAxxTMdye，Biotium公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

T1300Ⅱ級(jí)生物安全柜、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀，賽默飛世爾科技公司；Centrifuge 5418R微量離心機(jī)，Eppendorf公司；Nanodrop-2000核酸濃度測(cè)定儀，基因有限公司；500 W鹵素?zé)?，衢州市柯城華源電子商行。

1.1.3 引物

本研究所用引物如表1所示。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HRM-RT-PCR試劑盒反應(yīng)體系及程序

大腸桿菌O157:H7 HRM-RT-PCR試劑盒反應(yīng)體系見(jiàn)表2，反應(yīng)體系擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性 30 s、60 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 30 s，循環(huán)數(shù)為30，熔解曲線(xiàn)升溫速度0.1 ℃/s。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系引物序列及參數(shù)Table 1 Sequences and parameters of the primers of the HRM-RT-PCR system

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系（20 μL/Test）Table 2 The reaction system for HRM-RT-PCR (20 μL/Test)

1.2.2 試劑盒的組裝

商品化試劑盒應(yīng)盡可能把各種反應(yīng)物一次性添加、分裝，確保試劑盒的準(zhǔn)確與簡(jiǎn)便。將兩對(duì)引物、10×Ex Taq Buffer、dNTP Mix混合為HRM-RT-PCR反應(yīng)預(yù)混液。Ex Taq HS酶、SYTOTM9綠色熒光核酸染料分別-20 ℃單獨(dú)保存。試劑盒的具體組成如表3所示。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒組成（48 T）Table 3 Components of the HRM-RT-PCR kit (48 Tests)

1.2.3 靈敏度試驗(yàn)

將大腸桿菌O157:H7標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液按照10倍倍比稀釋?zhuān)崛』蚪M，使用本研究組建的HRM-RT-PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，獲得試劑盒的最低檢測(cè)限。

1.2.4 特異性評(píng)價(jià)試驗(yàn)

煮沸法提取金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌等常見(jiàn)食源性致病菌基因組，應(yīng)用試劑盒進(jìn)行各菌種特異性驗(yàn)證。

1.2.5 試劑盒穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

1.2.5.1 重復(fù)性試驗(yàn)

為驗(yàn)證試劑盒在檢測(cè)同一目標(biāo)模板時(shí)的重復(fù)性以及檢測(cè)低濃度模板時(shí)擴(kuò)增是否穩(wěn)定，選取中、低濃度的大腸桿菌O157:H7菌液、基因組模板，分別使用試劑盒對(duì)同一濃度的陽(yáng)性核酸樣本進(jìn)行10次平行擴(kuò)增。分析比較各重復(fù)間Ct值的差異情況，對(duì)擴(kuò)增體系的重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.5.2 反復(fù)凍融試驗(yàn)

試劑盒中的酶、飽和熒光染料、引物等需要保存在-20 ℃低溫環(huán)境，生化試劑容易受環(huán)境溫度變化的影響，因此反復(fù)凍融容易使試劑盒失效，造成假陰性結(jié)果。將保存在-20 ℃試劑盒中的試劑取出，置于室溫至液體融化后再置于-20 ℃，如此反復(fù)凍融50次，每反復(fù)凍融5次用同一份標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證試劑盒的穩(wěn)定性。

1.2.5.3 模擬運(yùn)輸環(huán)境試驗(yàn)

模擬運(yùn)輸條件下溫度變化對(duì)試劑盒穩(wěn)定性的影響，首先將試劑盒在-20 ℃儲(chǔ)存5 d，模擬冷鏈運(yùn)輸，然后將試劑盒儲(chǔ)存在放置有冰袋的泡沫盒中，每隔12 h更換冰袋，每隔4 h測(cè)溫，模擬人工運(yùn)輸。每12 h應(yīng)用試劑盒檢測(cè)同一份基因組模板，共計(jì)檢測(cè)3 d，根據(jù)Ct值變化判斷運(yùn)輸環(huán)境對(duì)試劑盒的影響。

1.2.6 抗干擾試驗(yàn)

選取大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889作為目標(biāo)菌，副溶血性弧菌ATCC 17802、金黃色葡萄球菌CICC 26074、單增李斯特菌CICC 21662、蠟樣芽孢桿菌CCTCC AB 204038作為干擾菌。二次活化培養(yǎng)后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。將四種干擾菌按照10倍倍比稀釋9個(gè)梯度，1:1:1:1混合得到9組混合菌液，同時(shí)將目標(biāo)菌稀釋至3×103CFU/mL，與不同濃度梯度的混合菌液進(jìn)行1:1混合，采用水煮法提取混合菌液基因組，試劑盒檢測(cè)后觀測(cè)其對(duì)應(yīng)的Ct值及Tm值差異，判斷試劑盒在四種常見(jiàn)食源性致病菌干擾下對(duì)大腸桿菌O157:H7的檢測(cè)能力。

1.2.7 人工污染試驗(yàn)

使用大腸桿菌O157:H7污染食品樣品，驗(yàn)證試劑盒的實(shí)際應(yīng)用能力。取新鮮無(wú)菌牛奶4 mL 6份、生鮮牛肉10 g 6份，各取1份經(jīng)GB 4789.36-2016驗(yàn)證無(wú)大腸桿菌O157:H7污染后，將已知初始濃度的大腸桿菌O157:H7用無(wú)菌生理鹽水以10倍倍比進(jìn)行稀釋?zhuān)@得濃度分別為7.97×105CFU/mL～7.97×101CFU/mL的5份菌液，將每份菌液取1 mL分別添加到準(zhǔn)備好的牛奶及牛肉樣品中，均質(zhì)后獲得人工污染食品樣品，取1 mL人工污染牛奶樣品于1.5 mL離心管中，12000 r/min離心10 min[22]，棄上清、留下底部沉淀物，分別將牛奶樣品沉淀物、牛肉污染樣品轉(zhuǎn)置到有9 mL mEC+n肉湯的均質(zhì)袋中[7]，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1 min～2 min，菌濃度稀釋10倍，37 ℃增菌培養(yǎng)0 h、6 h、8 h后，分別取1 mL菌液提取基因組并采用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)分析擴(kuò)增曲線(xiàn)判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.8 PMAxx處理?xiàng)l件優(yōu)化

1.2.8.1 細(xì)菌培養(yǎng)及熱滅活菌的制備

將大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889培養(yǎng)至細(xì)胞懸液OD600≈1.0。吸取處于對(duì)數(shù)期的細(xì)菌培養(yǎng)液于離心管中，100 ℃水浴10 min，獲得熱滅活菌細(xì)胞懸液[23]。將10 μL的熱滅活細(xì)胞懸液置于TSA培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后觀察是否有菌落長(zhǎng)出。

1.2.8.2 曝光時(shí)間優(yōu)化

取500 μL活菌菌懸液及熱滅活菌菌懸液各7份，1份活菌菌懸液和熱滅活菌菌懸液為1組，向其中6組菌懸液中分別添加PMAxx充分混勻，使其終濃度為25 μmol/L。室溫避光孵育10 min后，將樣品置于冰上，在距光源20 cm、500 W鹵素?zé)粝?，分別均勻曝光0、5、7、9、11、13 min后，12000 r/min離心5 min，PBS清洗三次，所得沉淀加入100 μL無(wú)菌蒸餾水混勻，100 ℃煮沸10 min，4 ℃冷卻5 min，12000 r/min離心3 min，上清用作DNA模板。未經(jīng)PMAxx處理的1組為對(duì)照組。最后進(jìn)行HRM-RT-PCR試劑盒檢測(cè)，探究最優(yōu)曝光時(shí)間。

1.2.8.3 暗孵育時(shí)間優(yōu)化

前處理工作同1.2.8.2。蓋上鋁箔紙置于搖床暗孵育不同時(shí)間（分別為0、5、10、15、20、25 min）。樣品置于冰上、鹵素?zé)粝缕毓?1 min，DNA提取步驟同1.2.8.2。未經(jīng)PMAxx處理組為對(duì)照組。試劑盒擴(kuò)增后探究最佳暗孵育時(shí)間。

1.2.8.4 PMAxx濃度的優(yōu)化

取6組500 μL活菌菌懸液和熱滅活菌菌懸液，向其中分別添加不同濃度的PMAxx使其終濃度分別為0、10、30、50、70、90 μmol/L，充分混勻。室溫避光暗孵育20 min、鹵素?zé)粝缕毓?1 min，其后操作步驟同1.2.8.2。未經(jīng)PMAxx處理組為對(duì)照組。試劑盒擴(kuò)增后探究PMAxx最優(yōu)濃度。

1.2.9 PMAxx對(duì)與活/死細(xì)胞的選擇性

將活菌和熱滅活菌兩種菌懸液按照不同比例0%、5%、25%、50%、75%、100%進(jìn)行混合，每個(gè)比例混合菌液取500 μL各2份作為待測(cè)樣品，一份使用PMAxx處理，另一份不使用PMAxx處理作為對(duì)照組，試劑盒檢測(cè)后判斷PMAxx處理體系對(duì)與活/死細(xì)胞的選擇性。

1.2.10 大腸桿菌O157:H7 PMAxx-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

將大腸桿菌O157:H7菌液按照10倍倍比進(jìn)行稀釋?zhuān)?jīng)PMAxx處理體系處理后，分別提取基因組作為模板，使用本研究組建的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，建立PMAxx-qPCR活菌定量檢測(cè)技術(shù)。

1.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用IBM SPSS Statistics軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為三次測(cè)定平均值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD）呈現(xiàn)。多組間比較采用單因素ANOVA檢驗(yàn)，顯著水平p＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖表采用Microsoft Excel、GraphPad Prism軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 試劑盒結(jié)果判定

每反應(yīng)管中取HRM-RT-PCR預(yù)混液6 μL、飽和熒光染料 2 μL，Ex Taq HS 酶 0.1 μL，dd H2O 9.9 μL，并加入2 μL待測(cè)樣品基因組DNA。設(shè)置空白對(duì)照（dd H2O）、陽(yáng)性對(duì)照（大腸桿菌O157:H7 DNA）、陰性對(duì)照（沙門(mén)氏菌 DNA）[24]。根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)、熔解峰曲線(xiàn)判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如圖1所示，在30循環(huán)內(nèi)有擴(kuò)增曲線(xiàn)（即Ct值＜30）和熔解峰曲線(xiàn)（G1、G10的Tm值分別為79.1±0.5 ℃、83.6±0.5 ℃）為陽(yáng)性，判定為檢出，在 30循環(huán)內(nèi)無(wú)特異性擴(kuò)增曲線(xiàn)（即 Ct值為undetected）、無(wú)熔解峰曲線(xiàn)為陰性，判定為未檢出。

2.2 試劑盒靈敏度試驗(yàn)

初始濃度為8.4×107～8.4×100CFU/mL的大腸桿菌O157:H7菌懸液分別提取基因組作為梯度模板進(jìn)行靈敏度評(píng)價(jià)。如圖1a、1b所示，84 CFU/mL的大腸桿菌O157:H7菌懸液在30個(gè)循環(huán)內(nèi)仍有擴(kuò)增曲線(xiàn)（Ct值=29.403）和熔解峰曲線(xiàn)（79.1±0.5 ℃、83.6±0.5 ℃），即試劑盒最低檢測(cè)限為84 CFU/mL。

表4 試劑盒可重復(fù)性評(píng)價(jià)結(jié)果Table 4 Results of repeatability evaluation of the HRM-RT-PCR kit

2.3 試劑盒特異性評(píng)價(jià)

檢測(cè)結(jié)果特異性良好，試驗(yàn)中的9株大腸桿菌中，僅7株O157:H7血清型出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)及相應(yīng)的熔解峰曲線(xiàn)，2株非O157:H7血清型未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增；其他18株常見(jiàn)食源性致病菌檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.4 試劑盒穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

2.4.1 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果如表 4所示，因大腸桿菌O157:H7的實(shí)際污染劑量非常低，選取中、低濃度的菌液和基因組（1.02×104CFU/mL、1.02×102CFU/mL、3.99 ng/μL、3.99 pg/μL），使用試劑盒對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。同一模板的10次平行擴(kuò)增Ct值標(biāo)準(zhǔn)偏差SD值＜0.5，在可接受范圍之內(nèi)，說(shuō)明該試劑盒擴(kuò)增重復(fù)性好。

2.4.2 反復(fù)凍融對(duì)試劑盒的影響

在實(shí)際操作過(guò)程中，較大容積的 HRM-RT-PCR預(yù)混液通常不會(huì)一次性消耗完畢，在使用過(guò)程中會(huì)反復(fù)凍結(jié)與融化，使生化試劑效用降低。如表5所示，雖實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性差異但數(shù)值差異較小，Ct值相差約1.482個(gè)循環(huán)，本研究驗(yàn)證試劑盒經(jīng)過(guò)50次反復(fù)凍融后，仍能有效地檢測(cè)出大腸桿菌O157:H7。

表5 反復(fù)凍融對(duì)HRM-RT-PCR試劑盒的影響Table 5 Effects of repeated freeze-thaw cycles on the HRM-RT-PCR kit

2.4.3 運(yùn)輸環(huán)境對(duì)試劑盒的影響

試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，隨著時(shí)間推移，泡沫盒中的溫度開(kāi)始逐漸上升，冰袋的更換使得泡沫盒內(nèi)溫度起伏較大，在0.7～14.3 ℃溫度范圍內(nèi)波動(dòng)。8 d模擬運(yùn)輸實(shí)驗(yàn)后，該試劑盒仍可有效檢測(cè)出大腸桿菌O157:H7，24 h后Ct值無(wú)差異顯著性，72 h的Ct值與0 h相差約0.75個(gè)循環(huán)，表明短期運(yùn)輸對(duì)其無(wú)不良影響。

表6 大腸桿菌O157:H7人工污染試驗(yàn)試劑盒檢測(cè)結(jié)果Table 6 Detection results of artificial contamination with E. coli O157:H7

2.5 試劑盒抗干擾試驗(yàn)

平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果：大腸桿菌 O157:H7 ATCC 43889為3×108CFU/mL、副溶血性弧菌ATCC 17802為1.14×108CFU/mL、金黃色葡萄球菌CICC 26074為3.9×109CFU/mL、單增李斯特菌CICC 21662為8×106CFU/mL、蠟樣芽孢桿菌CCTCC AB 204038為7.3×107CFU/mL。如圖 3a，9組不同濃度梯度干擾菌的混合菌液，都能準(zhǔn)確地檢測(cè)出3×103CFU/mL的目標(biāo)菌大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889，擴(kuò)增曲線(xiàn)幾乎重疊；如圖3b，熔解峰曲線(xiàn)Tm值均在79.1±0.5 ℃、83.6±0.5 ℃范圍內(nèi)，試劑盒抗干擾性能良好。

2.6 人工污染試驗(yàn)

如表6所示，大腸桿菌O157:H7人工污染試驗(yàn)結(jié)束后，未增菌培養(yǎng)即可檢測(cè)到初始污染量為7.97×101CFU/mL的人工污染食品樣品，增菌培養(yǎng)至 6 h，7.97×100CFU/mL初始污染量的食品樣品可被檢測(cè)到，試劑盒實(shí)際應(yīng)用效果好。

2.7 PMAxx處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.7.1 PMAxx曝光時(shí)間優(yōu)化

接種熱滅活細(xì)胞懸液的平板培養(yǎng)后未有菌落長(zhǎng)出。PMAxx曝光時(shí)間的長(zhǎng)短影響其與DNA共價(jià)交聯(lián)的效果。如圖4，熱滅活菌檢測(cè)結(jié)果顯示，0～5 min時(shí)間范圍內(nèi)，Ct值迅速升高，這是由于PMAxx逐漸與死菌DNA相結(jié)合對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)生抑制；曝光5～9 min內(nèi)，Ct值在較小范圍內(nèi)波動(dòng)，說(shuō)明隨著曝光時(shí)間增加，殘留PMAxx的光解率升高，對(duì)死菌DNA擴(kuò)增的抑制作用不穩(wěn)定；9 min后PMAxx與死菌DNA結(jié)合逐漸穩(wěn)定，11 min時(shí)Ct值達(dá)到最高點(diǎn)，此時(shí)PMAxx處理熱滅活菌組與活菌組Ct值相差最大，即PMAxx對(duì)熱滅活菌DNA擴(kuò)增的抑制程度最大；使用PMAxx處理活菌菌懸液后，Ct值數(shù)值波動(dòng)較小，PMAxx對(duì)活菌DNA擴(kuò)增幾乎沒(méi)有影響，隨著曝光時(shí)間的增加，活菌菌懸液Ct值微小的降低可能是由于PMAxx光解，對(duì)活菌僅有的一點(diǎn)抑制作用也消失了。綜上，選擇11 min作為PMAxx處理的最優(yōu)曝光時(shí)間。

2.7.2 PMAxx暗孵育時(shí)間的優(yōu)化

如圖5，PMAxx不能進(jìn)入到活細(xì)胞內(nèi)與DNA分子結(jié)合，因此隨著暗孵育時(shí)間延長(zhǎng)，活菌擴(kuò)增的 Ct值折線(xiàn)變化平緩；使用PMAxx對(duì)熱滅活菌菌懸液進(jìn)行處理時(shí)，隨著暗孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，Ct值顯著增加，這是因?yàn)樵诎捣跤^(guò)程中，PMAxx與死菌DNA逐漸結(jié)合，對(duì)其擴(kuò)增的抑制作用增強(qiáng)，暗孵育 20 min后Ct值達(dá)到峰值，說(shuō)明此時(shí) PMAxx與熱滅活細(xì)胞的DNA最大程度相結(jié)合，有效抑制了死菌DNA的擴(kuò)增。因此，20 min確定為最佳暗孵育時(shí)間。

2.7.3 PMAxx濃度優(yōu)化

由圖6可知，活菌組Ct值在0、10、50、90 μmol/L PMAxx處理時(shí)無(wú)差異顯著性，總體來(lái)看折線(xiàn)平緩，Ct值基本不變，PMAxx濃度變化對(duì)活菌DNA的擴(kuò)增影響很??；而使用 PMAxx對(duì)熱滅活菌組進(jìn)行理時(shí)，其Ct值隨PMAxx質(zhì)量濃度增加顯著增大：70 μmol/L后隨著PMAxx濃度的增大Ct值不存在差異顯著性。當(dāng)質(zhì)量濃度為30 μmol/L時(shí)，PMAxx對(duì)熱滅活菌抑制作用達(dá)到最大，可最大限度地抑制死菌細(xì)胞DNA的擴(kuò)增。因此，選擇30 μmol/L作為PMAxx處理的最優(yōu)濃度。

2.8 PMAxx對(duì)與活/死細(xì)胞的選擇性

由圖7可知，當(dāng)PMAxx處理組活菌數(shù)為0%時(shí)，Ct值達(dá)到最高28.603，而未經(jīng)PMAxx處理的對(duì)照組樣本 Ct值為 12.225，說(shuō)明 PMAxx處理后熱滅活菌DNA擴(kuò)增受到顯著抑制。當(dāng)活菌比例逐漸上升，處理組Ct值逐漸下降，但仍明顯高于對(duì)照組，且對(duì)照組折線(xiàn)變化不大，說(shuō)明 PMAxx處理可對(duì)樣本中的死菌DNA擴(kuò)增進(jìn)行抑制而對(duì)活菌的抑制作用較小，使處理組可擴(kuò)增的DNA數(shù)量小于對(duì)照組，在一定程度上消除了因死菌DNA擴(kuò)增造成的信號(hào)干擾，降低了假陽(yáng)性結(jié)果產(chǎn)生的概率。隨著活菌比例的上升，ΔCt值逐漸減小，活菌數(shù)100%時(shí)處理組與對(duì)照組Ct值幾乎重合。綜上，PMAxx處理組結(jié)果更接近樣本中活菌真實(shí)的定量值，可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中活菌的準(zhǔn)確檢測(cè)。

表7 大腸桿菌O157:H7傳統(tǒng)靶點(diǎn)與自篩靶點(diǎn)對(duì)比Table 7 Comparison of traditional targets with self-screening targets of E. coli O157: H7

2.9 大腸桿菌O157:H7 PMAxx-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

如圖8，在濃度范圍3.4×107～3.4×102CFU/mL 內(nèi)Ct值與菌液濃度線(xiàn)性關(guān)系良好，R2為0.9895，建立起了一種大腸桿菌O157:H7活菌定量檢測(cè)的方法。

3 討論

HRM-RT-PCR試劑盒的準(zhǔn)確性受到酶活性、反應(yīng)體系中各組分濃度的差異等多種因素的影響，反應(yīng)體系中各組分含量、比例的微量差異都有可能造成較大的結(jié)果偏差，這就對(duì)加樣的精確性提出了更高的要求，因此，標(biāo)準(zhǔn)化加樣步驟成為組建檢測(cè)試劑盒必不可少的先決條件。試劑盒在商業(yè)化過(guò)程中應(yīng)盡可能簡(jiǎn)化操作步驟，將不同組分如Ex Taq酶緩沖液、dNTP Mix、引物預(yù)先混合，減少加樣步驟，縮短檢測(cè)時(shí)間，在一定程度上有效消除加樣誤差，最大程度地保證了試劑盒操作的簡(jiǎn)便性與精確性。

使用HRM-RT-PCR檢測(cè)病原體，通常使用帶有高分辨熔解曲線(xiàn)分析的飽和熒光染料和多色熒光標(biāo)記的探針[14]，飽和熒光染料如SYBR Green、Eva Green和SYTO 9在HRM-RT-PCR中的使用，不僅大大優(yōu)化了其分辨率及檢出限，而且相對(duì)來(lái)說(shuō)比使用探針成本更低，并且可采用一種核酸染料同時(shí)對(duì)多種病原微生物或多種目標(biāo)基因同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。本研究使用的飽和熒光染料SYTO 9具有較好的生物兼容性和較高的熒光信號(hào)值；高濃度SYTO 9可以降低擴(kuò)增Ct值，從而降低檢出限，且不會(huì)影響PCR擴(kuò)增程序；在形成高分辨熔解曲線(xiàn)過(guò)程中分布均勻，進(jìn)一步提高熔解峰曲線(xiàn)的精確度。Singh等[25]采用飽和熒光染料 SYTO 9，對(duì)HRM-RT-PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，設(shè)計(jì)了一種低成本的多重RT-PCR檢測(cè)STEC的stx1、stx2基因和沙門(mén)氏菌的方法。

根據(jù)前期 Blast 比對(duì)及電泳實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)靶點(diǎn)檢測(cè)大腸桿菌 O157:H7血清型菌株時(shí)存在較多假陽(yáng)性，無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)該血清型。如表7所示，傳統(tǒng)靶點(diǎn)fliC、rfbE、rrsH不僅在大腸桿菌O157:H7菌株中有特異性擴(kuò)增，還在多株非大腸桿菌O157:H7菌株中出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，stx2靶點(diǎn)也會(huì)在少數(shù)非大腸桿菌O157:H7菌株擴(kuò)增中出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

本研究中發(fā)掘的特異性靶點(diǎn)G1是一種編碼假定蛋白的基因，假定蛋白質(zhì)是一種已經(jīng)預(yù)測(cè)到其存在的蛋白質(zhì)，通過(guò)當(dāng)前分子生物學(xué)技術(shù)難以預(yù)測(cè)該類(lèi)蛋白功能；G10編碼 GDP-L-巖藻糖合酶，這種酶屬于氧化還原酶家族，這種酶參與果糖和甘露糖代謝。經(jīng)驗(yàn)證，本研究中篩選的靶點(diǎn)具有較好的特異性，所選菌株中只有O157:H7血清型的大腸桿菌能擴(kuò)增出G1、G10基因，而非大腸桿菌O157:H7菌株均不能檢測(cè)到該靶點(diǎn)。

本研究組建試劑盒采用實(shí)驗(yàn)室自篩靶點(diǎn) G1、G10，因?yàn)橐话銌蝹€(gè)基因無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)O157:H7血清型，單個(gè)自篩靶點(diǎn)的檢測(cè)特異性雖有所提高，但仍存在個(gè)別漏檢現(xiàn)象，即僅有G1擴(kuò)增仍不能完全確定是該血清型。因此，本研究組建雙重檢測(cè)體系，引入另一個(gè)基因G10進(jìn)行輔助檢測(cè)，使得檢測(cè)特異性大幅度提高。

4 結(jié)論

本研究旨在組建新型大腸桿菌 O157:H7 HRM-RT-PCR快速檢測(cè)試劑盒。試劑盒使用實(shí)驗(yàn)室自篩靶點(diǎn)，特異性強(qiáng)，研究使用的27株菌株中，僅大腸桿菌O157:H7血清型檢測(cè)呈陽(yáng)性結(jié)果；采用飽和熒光染料SYTO 9，具有較高的熒光信號(hào)值，不僅進(jìn)一步提高了熔解峰曲線(xiàn)的精確度，同時(shí)降低了檢出限，最低可檢測(cè)到84 CFU/mL的大腸桿菌O157:H7。操作簡(jiǎn)便快捷，無(wú)需繁瑣的電泳操作；檢測(cè)結(jié)果精準(zhǔn)、快速。在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、反復(fù)凍融實(shí)驗(yàn)、模擬運(yùn)輸實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性；在四種其他種類(lèi)常見(jiàn)食源性致病菌同時(shí)存在的情況下能準(zhǔn)確檢測(cè)出大腸桿菌O157:H7，抗干擾能力強(qiáng)；最低可檢測(cè)到初始污染量為7.97×100CFU/mL的人工污染食品樣品，為大腸桿菌O157:H7的檢測(cè)提供了有價(jià)值的工具。最后，本研究進(jìn)一步將PMAxx與 HRM-RT-PCR檢測(cè)試劑盒相結(jié)合，用PMAxx處理活菌懸液后再提取基因組，可以去除死菌、VBNC狀態(tài)細(xì)菌等的存在對(duì)大腸桿菌O157:H7活菌檢測(cè)的干擾，降低假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)的可能性，進(jìn)一步建立了一種大腸桿菌O157:H7活菌定量檢測(cè)的方法。