外源硫化氫對氧化應激下銅綠假單胞菌生長和生物膜的調節(jié)作用

董晶晶，蔣秀婷，偶德馨，鄒艷艷，葉應旺

（合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽合肥 230000）

銅綠假單胞菌是一種革蘭氏陰性細菌，常見于飲用水、土壤、醫(yī)療器械表面，甚至動物、植物和其他生物的組織中[1-3]。在過去的100年中，銅綠假單胞菌已進化為最重要的人類病原體之一[4]。銅綠假單胞菌在呼吸道感染性疾病中最為常見，是引起呼吸相關肺炎和醫(yī)院感染的重要病原體[5]，在患有代謝疾病、血液病、惡性腫瘤和術后感染的患者中是高度敏感的病原體。在目前已知的病原菌中，銅綠假單胞菌的基因組最大，調節(jié)基因最多，耐藥機制異常復雜[6]。

H2S是繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后發(fā)現的第三種氣體信號分子[7]，能夠調節(jié)許多生理和病理過程，并與生物系統中的各種疾病相關[8,9]。雖然H2S已經被人們認識了幾個世紀，但它在細菌生理學中的作用仍是一個新的知識[10]。目前的研究表明H2S既有保護細菌免受氧化應激的作用，又有殺死細菌的功能[11]。Shatalin等人[12]于2011年提出H2S作為細菌對抗抗生素的一般防御機制：內源性H2S通過干擾 Fenton反應和刺激活性氧（ROS）清除酶來減少ROS的形成，從而促進抗生素耐藥性。這種機制適用于金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌和炭疽桿菌。然而，長期以來，H2S也被認為是有毒的，作為一種生長抑制分子，破壞DNA、破壞二硫鍵交聯使蛋白質變性、與輔基結合使金屬酶的氧化還原中心失活，并增強氧化應激[13]。最近，H2S已被證明對某些微生物具有細胞毒性作用[14-17]，Renieris等人[18]強調宿主衍生的H2S是對抗銅綠假單胞菌感染的一種新的保護機制：通過增強中性粒細胞的吞噬活性，以及抑制銅綠假單胞菌的細胞間通訊系統（QS系統），使其更容易被吞噬掉，從而保護宿主健康。付榴輝等人[19]表明H2S通過氧化損傷對大腸桿菌具有抗菌作用。

在本研究中，嘗試了解外源性H2S對氧化應激條件下銅綠假單胞菌的影響。通過存活率、細菌形態(tài)和生物膜的相關實驗，發(fā)現H2S會加劇H2O2對銅綠假單胞菌的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 菌株

1.1.1 實驗材料

菌株：銅綠假單胞菌的野生型菌株（WT）購于廣東省微生物培養(yǎng)中心。

主要試劑：Luria-Bertani（LB）肉湯培養(yǎng)基、平板計數培養(yǎng)基（PCA），北京奧博星生物技術有限責任公司；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物；0.9%氯化鈉注射液（生理鹽水），江蘇科倫藥業(yè)有限公司；磷鎢酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；丙三醇（分析純）、無水乙醇、結晶紫，國藥集團化學試劑有限公司；伴刀豆球蛋白A（FITC-Con A）、PI染料，美國sigma-aldrich公司。

1.1.2 主要儀器設備

DW-86L416G -80 ℃低溫保存箱，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；SHP-80生化培養(yǎng)箱，上海培因實驗儀器有限公司；JMY-100C恒溫搖床，上海久茂儀表有限公司；Infinite 200 Pro酶標儀，瑞士TECAN公司；JEM-1400flash LaB6透射電子顯微鏡，日本JEOL公司；熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡，德國卡爾蔡司；FV1000激光共聚焦掃描顯微鏡，日本OLYMPUS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌生長曲線的測定

吸取-80 ℃保存的野生型菌株PAO1于5 mL無菌LB肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，在溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上三區(qū)劃線進行分離純化，然后將培養(yǎng)皿倒置于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；從隔夜培養(yǎng)的溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上挑取單個菌落于5 mL無菌LB管中，在37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)18 h以獲得種子溶液；按1%的接種量將種子溶液接種至5 mL無菌LB和5 mL加入0.2 mmol/L NaHS的無菌LB中。然后，分別吸取200 μL培養(yǎng)物添加到96孔板中，每隔兩小時測量并紀錄600 nm處的光密度（OD）吸光值。

1.2.2 存活率

將菌株在LB和含有0.2 mmol/L NaHS的LB中培養(yǎng)，然后分別在0、1、2和2.5 mmol/L下進行H2O2壓力處理，在37 ℃、200 r/min下搖晃0.5 h、1 h和1.5 h。到達相應時間點后，用無菌生理鹽水梯度稀釋細菌溶液，然后在平板計數瓊脂培養(yǎng)基（PCA）溫度大約50 ℃時通過傾注倒平板。培養(yǎng)皿倒置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16 h~18 h。使用菌落計數法進行計數。每組實驗均進行三次。存活率（%）=（不同濃度H2O2下的菌落數/未經H2O2處理下的菌落數）×100%。

1.2.3 透射電子顯微鏡測細菌形態(tài)

將菌株分別培養(yǎng)在LB和含有0.2 mmol/L NaHS的LB中，然后在0、1、2和2.5 mmol/L下進行H2O2壓力處理 1 h。使用透射電子顯微鏡評估細菌細胞形態(tài)。操作步驟嚴格按照Wang等人[20]的描述執(zhí)行。

1.2.4 DAPI染色觀察DNA

將菌株分別培養(yǎng)在LB和含有0.2 mmol/L NaHS的LB中，然后在0、1、2和2.5 mmol/L下進行H2O2壓力處理1 h。無菌PBS清洗3次后收集沉淀。向沉淀中加入4%的多聚甲醛固定10 min，之后將沉淀重新懸浮于1 mL的無菌PBS中。將500 μL的DAPI（10μg/mL）染料和500 μL的菌液混合于黑暗中靜置10 min。再用無菌PBS離心洗滌樣品3次以防止DAPI殘留。樣品重新懸浮于無菌PBS中，滴加5 μL樣品于無菌載玻片上涂抹均勻，在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察。

1.2.5 生物膜

1.2.5.1 結晶紫

隔夜培養(yǎng)的細菌分別用LB肉湯培養(yǎng)基和含有0.2 mmol/L NaHS的 LB肉湯培養(yǎng)基稀釋至最終濃度1×106~2×106CFU/mL。將稀釋的菌液（2 μL）分別添加到198 μL無菌LB肉湯和含有1、2和2.5 mmol/L H2O2無菌LB肉湯的96孔板中。在培養(yǎng)到24 h、48 h和72 h后，小心地移除培養(yǎng)基，并用無菌水沖洗三次，以去除自由漂浮的細菌；在室溫下干燥1 h；用濃度為1%結晶紫對孔中的粘附細菌進行30 min的染色；用無菌水沖洗三次以去除多余的染劑。最后用33%的乙酸培養(yǎng)15 min，使結晶紫釋放。用酶標儀測量每個孔在570 nm處的OD值。每組實驗均進行三次。

1.2.5.2 掃描電子顯微鏡

將細胞爬片放入分別含有 1.98 mL LB、LB+1 mmol/L H2O2、LB+2 mmol/L H2O2和 LB+2.5 mmol/L H2O2的24孔板中。然后，吸取20 μL銅綠假單胞菌過夜培養(yǎng)物加入上述24孔板中，并將菌液與含有不同濃度H2O2的LB培養(yǎng)基混合，將孔板放置在37 ℃生化培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24、48和72 h。在H2O2激發(fā)之前添加0.2 mmol/L NaHS作為實驗組。在生物膜形成期間，每隔24 h用新鮮培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基。培養(yǎng)至相應時間的細胞爬片用PBS清洗以去除浮游細胞，之后浸在1 mL 2.5%戊二醛中固定，在4 ℃下固定24 h后，細胞爬片用50%、70%、80%、90%和100%的乙醇脫水（每種濃度 30 min），經過冷凍干燥、鍍金處理后，樣品制作完成，最后用掃描電子顯微鏡進行檢測觀察。

1.2.5.3 激光共聚焦顯微鏡

使用激光共聚焦顯微鏡可以檢測生物膜的存在。以與掃描電子顯微鏡檢測相同的方式制備細胞爬片。當細胞爬片在 37 ℃下培養(yǎng) 24、48和 72 h后，用FITC-Con A及PI染劑對細胞爬片上形成的細菌生物膜進行染色，然后通過CLSM進行觀察。

2 結果與討論

2.1 0.2 mmol/L NaHS對銅綠假單胞菌生長狀態(tài)的影響

圖1a為空白組菌株（未添加硫化氫）和實驗組菌株（添加0.2 mmol/L NaHS）在OD600下的生長曲線對照。一般來說，低濃度的H2S具有細胞保護作用，高濃度的H2S對微生物具有細胞毒性[12,21]。高濃度的硫化物通過抑制超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，阻礙大腸桿菌、黑曲霉、意大利青霉菌和鮑曼不動桿菌等細菌的生長以及與細胞防御氧化應激相關的天冬氨酸酶[17,19]。如圖1a所示，0.2 mmol/L NaHS對銅綠假單胞菌的生長狀態(tài)沒有顯著影響。因此，可以更好地比較兩組菌株在氧化應激下的情況。

2.2 氧化應激條件下NaHS對銅綠假單胞菌存活率的影響

圖 1b~d為對照組菌株（未添加硫化氫）和實驗組菌株（添加0.2 mmol/L NaHS）在氧化應激下（0、1、2和2.5 mmol/L H2O2）的存活率比較。H2O2是最常用的氧化劑，可在細菌中產生各種ROS，引起氧化應激并導致蛋白質、脂肪和DNA的損傷[22]，并且在某些條件下，對細菌細胞造成致命的殺傷[23-24]。如圖1b~d所示，細菌的存活率隨著時間的推移而降低；隨著 H2O2濃度的增加，銅綠假單胞菌的存活率顯著降低（p<0.01）：在處理時間分別為0.5、1和1.5 h時，當H2O2濃度為1 mmol/L和2 mmol/L時，實驗組的存活率均顯著低于對照組（p<0.01）；當時間為 1.5 h，H2O2濃度為2.5 mmol/L時，對照組和實驗組的存活率極低且無明顯的差異，有可能是長時間，高濃度的H2O2對細菌造成的氧化損傷過大，以致NaHS的存在對細菌的影響減少。特別值得注意的是，在各個時間段，實驗組的存活率均顯著低于對照組。與前人的實驗結果類似[19]，因此可以認為H2S會加劇H2O2對銅綠假單胞菌的殺傷作用。

2.3 氧化應激條件下NaHS對銅綠假單胞菌細胞形態(tài)的影響

圖2為對照組菌株（未添加硫化氫）和實驗組菌株（添加0.2 mmol/L NaHS）在氧化應激下（0、1、2和2.5 mmol/L H2O2）的細胞形態(tài)比較。在沒有氧化應激的情況下，兩組菌株的細胞沒有顯著差異，菌體細胞結構完整，均呈桿狀，表面光滑，一端有鞭毛。隨著H2O2濃度的增加，兩組菌株形態(tài)的改變逐漸加重，而且實驗組比對照組更嚴重。當H2O2濃度為1 mmol/L時，細菌皺縮，鞭毛消失，細胞表面聚集著顆粒狀物質，這可能是無機多磷酸鹽（polyP）[25]。polyP是具有氧化應激能力的生物聚合物，能夠防止氧化損傷、蛋白聚集，通過螯合金屬離子降低自由基濃度，以及調節(jié)不同細菌的一般應激反應途徑來提高細菌的氧化應激能力[26]。當H2O2濃度為2 mmol/L甚至2.5 mmol/L時，細菌開始破裂，可以觀察到胞質外流的現象。

2.4 氧化應激條件下 NaHS對銅綠假單胞菌DNA的影響

DAPI是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，和雙鏈DNA結合后可以產生比DAPI自身強20多倍的熒光，且核酸量越大，熒光強度越強[27]。如圖3所示，在沒有過氧化氫的壓力下，兩組的熒光亮度無明顯區(qū)別。隨著過氧化氫的濃度越來越大，實驗組的熒光強度明顯弱于對照組，即與對照組相比實驗組的核酸含量要明顯低，可能由于NaHS作用后銅綠假單胞菌細胞膜的通透性升高導致胞內核酸流失。

2.5 氧化應激條件下NaHS對銅綠假單胞菌生物膜的影響

生物膜是由微生物在自產基質的保護下形成的，通常附著在表面。在食品加工環(huán)境中，生物膜通過腐敗和致病菌的傳播危及產品安全[28]。細菌生物膜過去20年中在治療傳染病方面認識到的一個新的臨床問題。與對標準抗生素治療反應相對較好的浮游細菌引起的感染相比，生物膜形成細菌往往會引起慢性感染[29]。Walsh等[30]發(fā)現，二級過硫傳感器BigR會影響生物膜相關基因的表達。

在結晶紫實驗中，如圖4所示，兩種狀態(tài)的菌株在24 h形成的生物膜量最少，在48 h達到最大生物膜量。在沒有氧化應激的情況下，兩組菌株的生物膜形成量相似。隨著 H2O2濃度增加到 1 mmol/L和 2 mmol/L時，生物膜形成顯著減少，值得注意的是，實驗組菌株的生物膜形成少于對照組菌株，由此推斷H2S增強了H2O2對銅綠假單胞菌的損傷。此外，可以看到2.5 mmol/L H2O2對銅綠假單胞菌造成致命的傷害，幾乎不能形成生物膜。細菌生物膜的形成涉及到從未成熟到成熟結構的轉變，包括可逆粘附、不可逆粘附、微菌落形成、成熟和分散[31]。在本研究中，通過掃描電鏡重點觀察了銅綠假單胞菌在細胞爬片上形成的不同階段。如圖5所示，在培養(yǎng)24 h時，生物膜沒有很好地形成，并且在細胞爬片上觀察到許多浮游細菌。培養(yǎng)48 h后，觀察到細菌聚集成一團，具有成熟的空間結構。在培養(yǎng)72 h后，生物膜結構發(fā)生改變，生物膜分散。值得注意的是，隨著 H2O2濃度的逐漸升高，銅綠假單胞菌生物膜逐漸減少。在相同 H2O2濃度下，與對照組相比，實驗組的菌株形成的生物膜更少。在H2O2濃度為2.5 mmol/L時，菌株基本上沒有形成生物膜，只有少數浮游細菌在細胞爬片上。激光共聚焦圖像（如圖6所示）顯示生物膜的形成過程，在24、48、72 h的培養(yǎng)時間里，生物膜的厚度呈現先增加再減少的趨勢，并且圖片中紅色代表的死菌數量逐漸增加。同時，隨著 H2O2濃度的增加，生物膜形成能力逐漸降低且死菌的數量相應增加。在 2.5 mmol/L H2O2的處理條件下，在各個時間點，幾乎都不形成生物膜，僅存少量散落的細菌。

3 結論

本實驗以銅綠假單胞菌為研究對象，分別從存活率、細胞形態(tài)、生物膜等方面探討外源硫化氫對氧化應激的作用。結果表明0.2 mmol/L NaHS能顯著降低銅綠假單胞菌在氧化應激脅迫下的存活率和生物膜的形成，加重細胞形態(tài)的損傷和DNA的外滲。以上研究表明0.2 mmol/L NaHS能增強H2O2對銅綠假單胞菌的殺傷作用，為銅綠假單胞菌的防控提供新的思路。關于NaHS能增強H2O2對銅綠假單胞菌的殺傷作用的具體機制需要進行更深一步的研究。