改性蒙脫石消減黃曲霉毒素B1的研究進展

韓露露，程玲，楊祥龍，毛勁*，盛峰，張奇，李培武

（1.中國農業(yè)科學院油料作物研究所，湖北武漢 430062）（2.湖北大學生命科學學院，湖北武漢 430062）

真菌毒素是由真菌產生的有毒次生代謝產物，廣泛存在于霉變的食品、農產品和飼料中。全球每年約有25%的糧食油料作物受到不同程度的污染，對食品、農產品和經濟貿易造成巨大的損失[1]。真菌毒素中最常見、危害最大的一類毒素為黃曲霉毒素，它們具有類似的結構，均為二氫呋喃香豆素的衍生物。研究表明，黃曲霉菌在 10 ℃～40 ℃范圍內均可產生黃曲霉毒素，最適產毒溫度為 20 ℃～35 ℃[2]。我國一些地區(qū)處于亞熱帶氣候區(qū)域，高溫高濕的環(huán)境使得糧油受黃曲霉毒素污染更為嚴重。徐文靜等[3]對中國8省738份市售食用植物油中黃曲霉毒素污染狀況進行調查，發(fā)現食用植物油樣品中黃曲霉毒素總含量為 0.06～221.00 μg/kg，平均含量為 19.30 μg/kg。黃曲霉毒素包括黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2，其中B1毒性最強[4]。黃曲霉毒素不僅嚴重威脅產業(yè)和經濟貿易的發(fā)展，還影響整個食物鏈，因此，如何高效消減黃曲霉毒素成為研究熱點和難點。

常見的消減黃曲霉毒素方法包括化學法、生物法和物理法等?；瘜W法包括臭氧降解、有機酸降解和氨化脫毒法等，通常使用酸、堿、氧化劑等與黃曲霉毒素反應，破壞黃曲霉毒素的結構，使其轉化為無毒或毒性更小的物質[5,6]；生物法大多利用生物降解技術去除黃曲霉毒素或降低其毒性，主要有微生物降解和生物酶降解[7]；物理法包括吸附、高溫、輻射和超聲降解等。吸附法是目前研究和應用較多的方法，常用吸附材料包括活性炭、生物活性物質和鋁硅酸鹽如蒙脫石、沸石等。天然蒙脫石具有較為疏松的孔隙結構，擁有較好的穩(wěn)定性和離子交換能力，具有一定的吸附毒素的性能，但其在實際應用中仍存在效率不高、選擇性差等問題，而通過各種改性方法能有效提高其吸附消減性能。因此，本文主要綜述了改性蒙脫石吸附消減黃曲霉毒素B1的研究進展。

1 黃曲霉毒素B1的毒性及吸附消減方法

1.1 黃曲霉毒素B1的毒性

黃曲霉毒素B1（AFB1）是黃曲霉、寄生曲霉等真菌產生的具有香豆素和雙呋喃環(huán)結構的毒性次級代謝產物[8]，是迄今為止發(fā)現的理化性質最穩(wěn)定的真菌毒素之一，被國際癌癥研究機構列入Ⅰ類致癌物[9]。研究表明，AFB1具有三個毒性位點，其中呋喃環(huán)上的位點是導致基因突變和引發(fā)癌癥的功能性基團，是AFB1毒性強的原因[10]，也導致其具有很強的致畸性、致突變性與致癌性，主要影響人類及牲畜生長發(fā)育，破壞肝臟系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)[11,12]，造成氧化損傷，并引發(fā)腫瘤等嚴重疾病[13]。糧油作物如花生、玉米、稻米及其產品等極易受AFB1污染，它們是很多食品和飼料的原料，也是食用植物油的主要來源。為避免AFB1污染進入食物鏈對人或動物造成毒害，開展綠色高效的黃曲霉毒素消減具有重要的意義，目前利用吸附劑脫除黃曲霉毒素污染是最常用的方法之一。

1.2 常用的AFB1吸附劑

1.2.1 活性炭

活性炭是由木屑、蔗渣、谷殼等經過碳化后，再通過物理或化學活化處理而成的物質，是最早的吸附材料之一[14]?；钚蕴繐碛卸栊员砻?，吸附作用完全依靠色散力，對非極性有機物有較強的吸附性，能吸附AFB1等多種真菌毒素。最早Decker等[15]提出活性炭對AFB1具有吸附作用，其研究發(fā)現在體外中性pH值條件下，活性炭能夠吸附AFB1并形成穩(wěn)定的化合物，將飼料中的黃曲霉毒素有效的脫除。Edrington等[16]發(fā)現活性炭可以減輕雞飼料中 AFB1的毒害作用。陳金定等[17]利用WY1、WY2活性炭測定其對玉米毛油中AFB1的脫除率，結果顯示在吸附溫度100 ℃、吸附時間25 min、活性炭添加量0.2%條件下，兩種材料分別將毛油中AFB1從39.28 μg/kg降至18.09、17.86 μg/kg，達到國標限量指標；當兩種活性炭材料添加量為2%時，玉米毛油中AFB1的脫除率分別可達94.35%和95.72%，其中WY2活性炭將玉米毛油中AFB1降至歐盟限量標準。但由于活性炭可能存在選擇性差的問題，在吸附霉菌毒素的同時也會吸附其他營養(yǎng)物質[18]，因此在實際應用中受到了限制。

1.2.2 生物活性物質

生物吸附劑主要是利用失活微生物細胞表面結合食品中的各種霉菌毒素[19]。吸附過程是在帶有活菌的培養(yǎng)液中進行，菌體與 AFB1通過非共價方式結合形成復合體，從而降低微生物菌體自身的吸附能力，最終與 AFB1一起排出體外，達到降低毒素危害的目的[20]。目前研究的生物吸附劑包括酵母細胞壁、乳酸菌和植物纖維等。1999年Nagendra[21]發(fā)現雙歧桿菌和乳酸菌能分別與 AFB1反應形成穩(wěn)定復合物，有效的吸附 AFB1。朱新貴等[22]選用枯草芽孢桿菌、乳酸菌和醋酸菌降解 AFB1，研究結果表明材料均可大幅度降解AFB1，降解率分別為89%、88%、81%。酵母細胞壁是一種具有多吸附位點的生物吸附劑，可通過氫鍵、離子鍵和疏水作用力等對 AFB1產生吸附作用，并且添加用量少、不影響機體對礦物質的吸收、對環(huán)境不造成影響，研究較為廣泛。錢潘攀等[23]研究制備了一種雙效型細胞壁提取物，主要功能可抑制黃曲霉孢子萌發(fā)并且具有吸附毒素能力，研究結果表明制備的提取物對黃曲霉毒素的吸附能力達到了2.5 μg/mg。Liew等[24]對干酪乳桿菌Shirota在體內與體外與AFB1的結合效率進行了評價，發(fā)現熱處理后的細胞與 AFB1最大結合效率為81%。微生物吸附具有安全性高、特異性強等優(yōu)點，但其可能受到外界環(huán)境影響條件較多[25]，成本較高是目前亟需解決的關鍵問題。

1.2.3 鋁硅酸鹽

鋁硅酸鹽是研究較多的真菌毒素吸附劑，它由硅氧四面體和鋁氧八面體通過共用氧連結而成，具有不飽和負電荷及陽離子交換能力，因此可用于捕獲、吸附和固定真菌毒素，有效降低其毒性[26]，尤其是對擁有極性基團的毒素，如 AFB1。天然鋁硅酸鹽類礦物質，如蒙脫石、沸石等含量豐富、分布廣泛且無生物毒性，可作為毒素脫除吸附劑大規(guī)模使用，早在1978年就有研究證實了硅鋁酸鹽類礦物質在體外條件下能夠很好地吸附 AFB1[27]。張春華等[28]在花生油中添加0.5%的膨潤土后，發(fā)現油中AFB1含量明顯降低，含量從12.5 μg/kg降低到1 μg/kg以內。鋁硅酸鹽中蒙脫石擁有一定的陽離子交換容量和吸附能力，也可用于消減AFB1。研究表明，高嶺石與伊利石對AFB1也有一定的吸附效果，但效率均低于蒙脫石[29]。表1為活性炭、生物活性物質及鋁硅酸鹽類物質吸附 AFB1效果的對比，可發(fā)現天然蒙脫石吸附能力優(yōu)于其他材料，但為了進一步提高其吸附性能，可通過物理、化學等改性方法優(yōu)化其吸附容量和選擇性。

表1 不同類型吸附劑吸毒黃曲霉毒素B1效果對比Table 1 Comparison of different adsorbents for AFB1 removal

2 蒙脫石的結構與吸附機制

2.1 蒙脫石的結構

蒙脫石（montmorillonite）是一種顆粒極小的鋁硅酸鹽粘土礦，又名微晶高嶺石，主要成分為 SiO2和Al2O3[36]，性質穩(wěn)定，耐酸耐堿耐高溫[37]，具有強烈的吸水性、膨脹性和分散性，其結構間存在大量可交換離子，因而擁有良好的陽離子交換性能和吸附能力。蒙脫石晶體類似三明治結構（如圖1所示），兩層Si-O四面體中間夾一層 Al-O八面體，三個片層之間通過共價鍵相連接，每個片層的厚度約為1 nm[38]，其層間存在一定量的負電荷，為保持晶體結構的穩(wěn)定性，負電荷會吸引周圍的陽離子靠近。蒙脫石對多種真菌毒素都有吸附作用，可吸附脫除 AFB1、玉米赤霉烯酮等并與之結合形成不同強度的絡合物[39]，但是對嘔吐毒素這種極性弱的真菌毒素吸附性較差。

2.2 蒙脫石的吸附機制

大量研究證明蒙脫石具備吸附 AFB1的性能，對其吸附機制也取得了一些進展。對于蒙脫石的吸附脫毒機理，通常認為是它與 AFB1結合形成穩(wěn)定的化合物，減少毒素在腸道中的吸收，從而降低 AFB1對機體的毒害作用[41]。Magnoli等[42]研究證實，蒙脫石對AFB1的吸附與其孔徑大小無關，但與其結構及其表面靜電吸附作用密切相關。AFB1分子中十分重要的反應位點是的雙羰基氧，而其余的2個呋喃氧則對吸附反應的貢獻較小[43]。Phillips等人[44]研究了水合鋁硅酸鈉粘土吸附AFB1的機理，他們認為材料對AFB1的吸附為選擇性吸附過程，可能涉及到AFB1的β二羰基體系，即通過金屬離子在層狀鋁硅酸鹽粘土表面和夾層內螯合進行吸附。Grant等[45]研究了蒙脫石對 AFB1的吸附過程得出結論，由于蒙脫石層間存在大量陽離子，在含水的條件下會與其他無機或有機陽離子發(fā)生置換，因此吸附后在粘土的層間區(qū)域存在顯著比例的AFB1。Deng等[46]研究結果表明，蒙脫石與AFB1之間的主要通過離子-偶極子相互作用以及羰基氧的配位作用進行結合從而達到吸附脫除，且在潮濕條件下，羰基與可交換陽離子之間的氫鍵是主要的結合力。Wang等[47]研究認為蒙脫石層間可交換陽離子通過離子-偶極相互作用以及有機碳鏈通過疏水相互作用共同吸附AFB1，對弱極性真菌毒素ZEN的吸附為疏水相互作用，如圖2所示。

3 蒙脫石的改性及其吸附性能

天然蒙脫石在吸附 AFB1的過程中，可能存在解吸反應，導致 AFB1重新暴露危害生命健康；并且天然蒙脫石在吸附 AFB1時層間的陽離子大多表現出親水性，因此降低了對 AFB1的吸附率。吸附劑表面靜電力的強弱決定其吸附能力的強弱[48]，為提高蒙脫石的吸附性能和選擇性，眾多學者對蒙脫石進行了改性相關研究，研究表明天然蒙脫石具有較大的比表面積，其外表面積大約只有10～50 m2/g，但內表面積很大，理論上內表面積可達600～800 m2/g[49]，通過合適的改性后，其有效吸附面積能夠顯著擴大。目前，常見改性方法包括無機改性與有機改性，主要利用蒙脫石層間域和表面的可改造性，將不同類型的無機陽離子、有機陽離子或中性分子與其表面或層間的基團結合，增加其對有機物的親和性[50]進而提高對AFB1的吸附效率。殷傳振等[51]分別使用鹽酸與氫氧化鈉改性蒙脫石，經吸附后發(fā)現酸改性蒙脫石的吸附效果更好，吸附率為 68.93%。姚志成等[52]使用改性蒙脫石吸附AFB1，吸附率達到 95.65%且形成了穩(wěn)定性較好的復合物。葉盛群等[53]測定了活性白土、凹凸棒、沸石、活性炭和改性蒙脫石5種吸附材料對菜籽油中AFB1的吸附作用，結果表明，在相同條件下改性蒙脫石對AFB1脫毒效果最好，脫毒率達到89.02%。目前研究較多的方法有酸活化改性、無機鹽離子改性與有機季銨鹽改性等。

3.1 無機改性

3.1.1 酸活化改性

酸活化改性是在一定條件下利用不同濃度的酸，如鹽酸、硫酸、硝酸等對蒙脫石表面進行改性，并去除影響蒙脫石活性的雜質[54,55]。蒙脫土片層間的Na、Mg、K、Ca等陽離子通過酸處理后，轉變?yōu)樗岬目扇苄喳}而溶出，削弱了片層間的結合力，從而使得片層間距增大，改性后蒙脫土的吸附能力和比表面積明顯增大[56]。酸活化改性蒙脫石大致分為三個步驟：1、Ca2+和H+交換；2、金屬離子(Fe2+、Fe3+、Al3+、Mg2+)從八面體片中溶解并去除，使蒙脫石表面及層間產生更多的負電荷；3、更多的水合氫離子進入層中以平衡負電荷并削弱層間力[57]。王磊等[58]以不同濃度的鹽酸、硝酸、硫酸和磷酸對膨潤土進行改性，研究發(fā)現，經10%的酸改性后，膨潤土結構均變得松散蓬松，層間孔隙變大，原來的層間作用力被削弱，吸附能力提高。黃貴秋等[59]用20%（W）的硝酸對Na-MMT進行酸活化改性，活化前 Na-MMT具有很低的比表面積（21 m2/g）、較小的孔體積（0.10 m2/g）以及較大的平均孔徑（19.0 nm），經活化后比表面積和孔體積均明顯增大，平均孔徑有不同程度下降，原因在于酸處理可使蒙脫石中一些被堵塞的孔隙疏通，同時八面體中的鋁會在酸性條件下被溶出[60]，從而形成了一定數量的微孔和介孔，進而增強了對 AFB1的吸附能力。但隨著酸處理強度的增加，酸活化蒙脫土的平均孔徑先減小后增大，原因在于酸強度增加到一定程度時，蒙脫土的 Al-O骨架以及層間結構遭到破壞。酸處理蒙脫石在去除重金屬和染料等工業(yè)污染物方面的應用已經有很多報道，但在真菌毒素吸附方面的研究很少。

3.1.2 無機鹽離子改性

無機鹽改性主要加入鈉鹽、鋅鹽、鎂鹽、銅鹽等改性劑，通過大半徑陽離子交換進入蒙脫石層間使結構間作用力減弱，同時使分散的蒙脫石單晶片形成層狀締合結構，改變了使蒙脫石在溶液中的分散狀態(tài)和性能，締合的片層之間形成較大的孔隙空間，使蒙脫石結構層間距增大、比表面積增大、離子交換能力和吸附能力得到顯著提高。王品[40]分別用氯化鈉、硫酸鈉和碳酸鈉三種鈉鹽表面活性劑對蒙脫石進行改性，并對改性后的蒙脫石結構和性能進行表征，其中熱重分析結果表明，鈉鹽成功插入到蒙脫土層間，改性后蒙脫土的熱穩(wěn)定性增強；對蒙脫土層間距的變化進行分析發(fā)現，改性后的蒙脫土平均層間距從0.99 nm分別增大到1.25、1.23、1.21 nm。王曉娟等[61]對蒙脫石原料進行載銅處理，處理后AFB1的吸附率顯著增加，從 82.15%提升至 95.26%，解吸率從 11.24%降至7.86%，同時蒙脫石與AFB1復合物的穩(wěn)定性也有所增強。張亞坤等[62]測定鈉化后蒙脫石對玉米皮中 AFB1的吸附率由14.08%增加到32.42%（p＜0.05）；張立陽等[63]研究發(fā)現，在毒素濃度為2.0 μg/mL的AFB1工作液中添加 0.5%（W/V）銅、鋅改性蒙脫石后，AFB1的吸附率從67.88%分別提升至71.86%和81.74%，載銅加鋅蒙脫石可將吸附率提升至86.38%，吸附率有顯著的提高。同時，有研究發(fā)現，使用適當的鈉鹽對蒙脫石改性會降低其層間距，原因在于改性后晶體結構變得蓬松，層間大分子雜質被鈉離子置換，提高了鈉化蒙脫石的純度，有利于后續(xù)進行有機改性[64]。

3.2 有機改性

一般來說，有機改性蒙脫石是由陽離子表面活性劑處理得到產物[65]。研究表明，陽離子表面活性劑的用量會影響其改性蒙脫石的機理。當活性劑的用量低于蒙脫石離子交換容量時，改性機理為離子交換作用；反之，不僅存在離子交換作用還有疏水相互作用[66]。目前使用最多的有機改性劑為長碳鏈烷基季銨鹽，在蒙脫石層間插入長碳鏈烷基后片層表面呈現疏水性，這不僅增加了改性蒙脫石與有機相的親合性，同時增大了蒙脫石的層間距使得聚合單體或大分子物質更易于插層到片層中[67]。馬文文等[68]研究發(fā)現，季銨鹽改性劑分子質量的大小與改性后蒙脫土的吸附效果密切相關，太大或太小均會影響材料的吸附效果，但其原因有待進一步研究。張立陽等[63]用十六烷基三甲基溴化銨、十八烷基三甲基氯化銨和十八烷基二甲基芐基氯化銨對天然蒙脫石進行改性，研究結果顯示隨著碳鏈長度的增加，不同有機試劑改性后的蒙脫石對AFB1的吸附率也隨之上升，其中十八烷基三甲基氯化銨對AFB1的吸附效果最佳，達到99.48%；對改性蒙脫石進行結構表征發(fā)現其顆粒松散，插層反應后層間距擴大，塊狀結構轉變?yōu)楣饣亩鄬咏Y構并且發(fā)現有錯落的孔隙結構，比表面積幾乎達到原先的五倍。陳英等[69]研究表明，十八烷基三甲基溴化銨能夠有效增加鈉-蒙脫石的晶面間距，在反應溫度為80 ℃，反應時間8 h，十八烷基三甲基溴化銨加入量為4 mmol的條件下能夠得到穩(wěn)定的有機改性蒙脫石。王高峰[65]分別使用單鏈十八烷基三甲基溴化銨與雙鏈十八烷基二甲基氯化銨改性蒙脫石，通過對比發(fā)現，雙鏈改性劑擁有較優(yōu)的層間距、含碳量、親油性，對 AFB1的吸附量也有顯著的提高。

酸活化改性、金屬鹽離子改性及有機季銨鹽改性方法均能在一定程度上提高蒙脫石對 AFB1的吸附性能，表2列舉了不同方法改性蒙脫石后的結構變化及吸附效果。酸活化改性是通過疏通蒙脫石層間孔隙來提高 AFB1的吸附效率，需要注意的是在改性過程中應選擇出適宜的酸濃度，否則酸濃度過高會導致蒙脫石結構坍塌反而降低吸附效率；由于蒙脫石具有親水性，利用金屬鹽離子進行改性，并不能完全將蒙脫石層間陽離子置換，金屬鹽離子改性劑提高蒙脫石的吸附效率可能存在局限性；有機季銨鹽改性在蒙脫石層間插入長碳鏈，增加了蒙脫石的層間域并提高了材料的疏水性，并且增加改性劑的碳鏈長度可有效提升對AFB1的吸附率，因此結合多種改性方法或許更有利于增強其吸附消減毒素的性能。

表2 不同方法改性蒙脫石的效果Table 2 Effect of modified montmorillonite by different methods

4 改性后的蒙脫石對營養(yǎng)物質及品質的影響

蒙脫石具有一定的離子交換能力，因此它不僅擁有吸附能力，同時也具有一定的催化活性。這些性質導致其在吸附 AFB1的同時還可能會吸附一些營養(yǎng)物質，降低油料、食品、農產品以及飼料的營養(yǎng)品質。楊威等[75]選用膨潤土（蒙脫石的主要成分）吸附花生油中 AFB1后，對花生油中營養(yǎng)物質含量進行檢測發(fā)現：吸附劑導致花生油中VE（維生素E）與甾醇含量降低，POV（過氧化值）含量增加，原因可能是吸附劑中的雜質降低了油脂的穩(wěn)定性，加快其氧化速度。馬文文等[68]用鈉離子改性蒙脫石與十八烷基三甲基氯化銨改性蒙脫石吸附花生油中 AFB1后，測定了吸附前后花生油的酸價，結果發(fā)現改性后酸價有顯著的下降，含量分別從0.85 mg/g降至0.61和0.41 mg/g。孫思遠等[76]發(fā)現十八烷基三甲基溴化銨改性蒙脫石與鈉離子改性蒙脫石均能提高食用油的亮度。天然蒙脫石往往會催化油脂中的游離脂肪酸等氧化、分解或聚合產生對人體有害的物質，改性后的蒙脫石能大大降低有害物質的產生，對油脂品質影響較小。

5 結論與展望

黃曲霉毒素嚴重威脅食品、農產品和飼料安全和產業(yè)高質量發(fā)展，如何高效且安全消減 AFB1具有重要意義。相比活性炭、生物活性物質等吸附劑，天然蒙脫石由于地表含量豐富，價格低廉，并且可通過離子-偶極子、羰基氧配位及靜電引力等方式吸附黃曲霉毒素，廣泛應用在飼料、食品等領域。然而，天然蒙脫石吸附選擇性并不理想，往往吸附毒素的同時可能也會對營養(yǎng)或品質造成影響。通過化學和物理等方法改性天然蒙脫石，可有效增強其吸附消減 AFB1的性能，酸活化改性是通過疏通蒙脫石層間孔隙來提高AFB1的吸附效率，但酸濃度過高會導致蒙脫石結構坍塌反而降低吸附效率；利用金屬鹽離子進行改性，并不能完全將蒙脫石層間陽離子置換，因此也可能存在局限性；而在蒙脫石層間插入長碳鏈有機季銨鹽，可增加蒙脫石的層間域并提高了材料的疏水性，可大幅度提升對 AFB1的吸附率，因此結合化學、有機等多種方法改性將更有利于增強其吸附消減毒素的性能。然而，目前其高選擇性吸附作用機制尚不明確；其基礎理論突破將為研制高效、高選擇和穩(wěn)定的改性蒙脫石材料和構建綠色、安全的黃曲霉毒素吸附消減方法提供科學依據，這將是黃曲霉毒素綠色控制領域發(fā)展的重要方向之一，將為保障食品、農產品和飼料安全和人民生命健康提供關鍵技術支撐。