小兒青翹顆粒對呼吸道病原菌的體外抑制作用研究

王榮花，鄭志慧，張雨茜,2，閔銳，王澤華，何樞衡，黃雁，張?jiān)u滸,2*

(1.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇省人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.億帆醫(yī)藥股份有限公司，浙江 杭州 310000)

近年來隨著抗生素類抗菌藥物在養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛濫用以及臨床的不規(guī)范使用，細(xì)菌耐藥已成為臨床治療細(xì)菌感染性疾病的世界難題。因此尋找高效低毒且能有效解決細(xì)菌耐藥性問題的抗菌藥物是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。中草藥作為我國特有的藥物資源，不僅具有藥源廣、價(jià)格低的特點(diǎn)，而且可以通過直接殺滅細(xì)菌菌體和調(diào)控機(jī)制免疫等多種途徑發(fā)揮綜合抗菌作用[1]。近年來研究表明多種中草藥和中藥復(fù)方不僅體外對多種細(xì)菌具有良好的抑菌效果，而且在臨床治療感染性疾病中顯現(xiàn)出良好的抗菌效果[1-6]。小兒青翹是一種臨床用于治療小兒呼吸道病毒感染的常用中成藥，對小兒呼吸道感染具有良好療效[7-10]，但有關(guān)該藥是否具有抗呼吸道病原菌效應(yīng)，迄今尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究首次對小兒青翹體外抗常見呼吸道病原菌的藥效作用進(jìn)行研究，以期為指導(dǎo)該藥臨床治療呼吸道病原菌感染提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株

臨床細(xì)菌株為2019年3月—2019年10月收集的臨床分離株，分別來自揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院和揚(yáng)州大學(xué)臨床中醫(yī)學(xué)院，標(biāo)準(zhǔn)株來自揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原教研室，所有菌株均經(jīng)生化與藥敏鑒定。

1.2 藥物

小兒青翹顆粒由億帆醫(yī)藥股份有限公司提供,批號:20190301；陽性藥青霉素和慶大霉素購自上海生工生物有限公司,批號分別為:A613460、A506614；藥敏紙片購自杭州微生物有限公司。

2 測試方法

2.1 微量測定法

按著NCCLS[11]中的抗菌藥物藥效學(xué)評價(jià)參考方法進(jìn)行操作和結(jié)果判定，對小兒青翹顆粒體外抗菌活性進(jìn)行評價(jià)，該方法是將小兒青翹顆粒做連續(xù)2倍稀釋，然后每孔加入適量的稀釋菌液，混勻后37 ℃培養(yǎng)24～48 h。同時(shí)設(shè)定不含待測化合物的溶媒對照，只含培養(yǎng)基的空白對照，以青霉素和慶大霉素為陽性藥。以空白對照為參照，比較不同藥物濃度的渾濁度，以抑制細(xì)菌生長的最低濃度作為小兒青翹顆粒對相應(yīng)菌株的MIC值；以殺死99.9%以上細(xì)菌的藥物濃度作為小兒青翹顆粒的MBC值。

2.2 平板測定法

將MH瓊脂培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至50 ℃左右時(shí)，加入小兒青翹顆粒、慶大霉素和青霉素，分別制成含20、10、5、2.5、1.25、0.625、3.13 mg/mL的小兒青翹和含100 μg/mL青霉素或慶大霉素的12孔瓊脂培養(yǎng)板，然后每板加入含1×103個(gè)CFU的菌液，涂勻后置37°C培養(yǎng)24～48 h。以空白對照孔細(xì)菌數(shù)為參照，以慶大霉素與青霉素為陽性藥，對比分析小兒青翹對鮑曼不動(dòng)桿菌敏感株與耐藥株的殺菌效應(yīng)。

2.3 殺菌量效曲線測定

將對數(shù)生長期的鮑曼不動(dòng)桿菌用生理鹽水稀釋成1×105個(gè)菌落/mL，然后分別加入青霉素、慶大霉素和小兒青翹顆粒，青霉素和慶大霉素濃度為100 μg/mL，小兒青翹顆粒濃度從100 μg/mL開始依次做2倍梯度稀釋，分別獲得終濃度為100，50，25，12.5，6.25，3.13，1.56，0.78，0.39 mg/mL的含藥試管，然后每試管加入1×105個(gè)細(xì)菌，37 ℃培養(yǎng)24 h后測定各處理組的活菌數(shù)。

2.4 殺菌時(shí)效曲線測定

將對數(shù)生長期的鮑曼不動(dòng)桿菌用生理鹽水稀釋成1×105個(gè)菌落/mL，然后分別加入青霉素、慶大霉素和小兒青翹顆粒，青霉素和慶大霉素濃度為100 μg/mL，小兒青翹顆粒濃度為20，10和5 mg/mL，然后每試管加入1×105個(gè)細(xì)菌，37°C培養(yǎng)2、4、6、8、12、24、48 h后，測定。

3 結(jié)果

3.1 小兒青翹顆粒對常見呼吸道病原菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測定結(jié)果

本研究采用微量法對小兒青翹體外抗呼吸道常見病原菌的效果進(jìn)行了研究，具體結(jié)果見表1。由表1可以看出，小兒青翹顆粒對肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和副流感嗜血桿菌的敏感菌和耐藥菌均有一定的抑制活性，其抑制上述臨床菌株的MIC(mg/mL)范圍分別為9.38～75、4.69～9.38、1.17～4.69和4.69～75，MBC(mg/mL)范圍分別為18.75～75、4.69～9.38、2.34～4.69和4.69～75。從上述MIC和MBC結(jié)果可以看出小兒青翹顆粒對常見呼吸道病原菌的抑菌效果依次為鮑曼不動(dòng)桿菌>肺炎克雷伯菌>肺炎鏈球菌>流感嗜血桿菌。

表1 小兒青翹顆?？咕Ч臏y試結(jié)果

3.2 小兒青翹顆粒對鮑曼不動(dòng)桿菌的量效殺菌曲線測定結(jié)果

本研究采用統(tǒng)一的菌液濃度(1.0×105CFU)，以陽性藥青霉素和慶大霉素(100 μg/mL)為對照，對小兒青翹顆粒100，50，25，12.5，6.25，3.13，1.56，0.78，0.39 mg/mL等9個(gè)濃度24 h內(nèi)是否具有殺滅鮑曼不動(dòng)桿菌的效應(yīng)進(jìn)行了觀察，結(jié)果如圖1和圖2所示。從圖1可以看出，藥物作用24 h后，小兒青翹顆粒具有劑量依賴性地抑制鮑曼不動(dòng)桿菌敏感菌株和耐藥菌株的生長，而陽性藥慶大霉素和青霉素僅能抑制各自敏感菌株的生長，對耐藥菌株基本無抑制作用。從圖2可以直觀看出，小兒青翹顆粒在5 mg/mL濃度條件下能完全抑制鮑曼不動(dòng)桿菌敏感株和耐藥株的生長，但從2.5 mg/mL濃度可以看出，小兒青翹顆粒抑制鮑曼不動(dòng)桿菌敏感株生長的效應(yīng)明顯優(yōu)于耐藥株。

圖1 小兒青翹顆粒對鮑曼不動(dòng)桿菌的量效殺菌曲線

圖2 小兒青翹顆粒對鮑曼不動(dòng)桿菌體外抗菌活性

3.3 小兒青翹顆粒對鮑曼不動(dòng)桿菌的時(shí)效殺菌曲線測定結(jié)果

以時(shí)間為x軸和以對應(yīng)菌落數(shù)的對數(shù)為y軸繪制小兒青翹顆粒對鮑曼不動(dòng)桿菌的時(shí)效殺菌曲線，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯?，小兒青翹顆粒在20、10和5 mg/mL 3個(gè)劑量條件下均可以時(shí)間依賴性地殺滅鮑曼不動(dòng)桿菌敏感菌株和耐藥菌株，且兩者無明顯差別，表明小兒青翹顆粒殺滅鮑曼不動(dòng)桿菌的效應(yīng)具有較好的廣譜性；隨著濃度的增加，殺滅細(xì)菌的時(shí)間縮短，表明隨著濃度增加小兒青翹顆粒的殺菌效率增強(qiáng)。而陽性藥青霉素與慶大霉素除對敏感菌株有較好的抑制作用外，對耐藥菌株基本無任何殺滅作用,見圖4。

圖3 小兒青翹顆粒對鮑曼不動(dòng)桿菌敏感菌株的時(shí)效殺菌曲線

圖4 小兒青翹顆粒對鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥菌株的時(shí)效殺菌曲線

4 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是當(dāng)前臨床最為嚴(yán)重的多重耐藥菌，醫(yī)院內(nèi)感染的死亡率高達(dá)35%，迄今尚無有效的治療藥物與治療策略[6]。因此，抗鮑曼不動(dòng)桿菌感染是當(dāng)前微生物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。中草藥活性成分多，藥理作用廣泛，在抗菌、抗病毒以及抗寄生蟲等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢?，F(xiàn)有大量文獻(xiàn)研究表明，中草藥如黃連、黃芩、黃柏和金銀花等對臨床常見的病原菌如大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌和鮑曼不動(dòng)桿菌均具有較好的抑制作用[1-6]。此外，多數(shù)中草藥不僅具有廣譜的抗菌活性，而且可以有效緩解細(xì)菌的耐藥性問題。

小兒青翹顆粒是一種小兒專用的純中藥復(fù)方制劑，以《溫病條辨》中經(jīng)典方“銀翹散”為基礎(chǔ)方，聯(lián)合“柴胡葛根湯”加減而成，具有疏風(fēng)清熱、解毒利咽，消腫止痛之功效。其組方為山銀花、連翹、粉葛、大青葉、山豆根、柴胡和甘草。方中山銀花主清熱解毒，連翹主辛涼解表，葛根主潤燥生津之效，大青葉與山豆根主清熱解毒，利咽消腫之功。現(xiàn)有研究表明方中山銀花、連翹、大青葉和山豆根均有廣譜抗菌作用，特別對肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌等病原菌有很好的抑制作用[2-5]。此外，該方還具有抗炎、解熱和鎮(zhèn)痛之效。因此，該方臨床常用于治療風(fēng)熱襲肺所致乳蛾，咽喉腫疼，喉核紅腫、扁桃體炎等上呼吸道感染[7-12]。但有關(guān)該方是否具有直接抑制呼吸道病原菌生長的作用迄今鮮有報(bào)道。

本研究選擇以臨床最易發(fā)生多重耐藥感染的肺炎鏈球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌和副流感嗜血桿菌為研究對象對臨床治療小兒呼吸道感染的小兒青翹顆粒的抗菌效果進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)小兒青翹顆粒具有較好的廣譜抑菌活性，能抑制包括肺炎鏈球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌和副流感嗜血桿菌等多種常見呼吸道病原菌的生長，且對青霉素與慶大霉素具有顯著抗性的耐藥菌也表現(xiàn)出較好的抑制作用，其中對鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制效果最為顯著。殺菌曲線結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)小兒青翹顆粒具有劑量依賴性與時(shí)間依賴性抑制鮑曼不動(dòng)桿菌生長的效應(yīng)。綜上所述，小兒青翹顆粒在體外具有較好的廣譜抗菌活性，其抗菌活性可能與其具有較強(qiáng)的直接殺菌活性有關(guān)。本研究不僅拓展了小兒青翹顆粒在臨床治療呼吸道感染方面的應(yīng)用，而且為該方劑的臨床推廣應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。