基于cAMP/cGMP、AQP4探究綜合性虛損癥模型的建立

吳雅晨，唐冰雪，段麗，胡萬福，張永萍，劉明，3*

(1.貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550002;3.貴州中醫(yī)藥大學 中藥、民族藥藥理作用及作用機制研究中心，貴州 貴陽 550025)

虛損癥是各臟腑虛衰導致的慢性疾病，臨床多表現(xiàn)為神疲乏力、面色萎黃、惡寒肢冷、眩暈耳鳴，與現(xiàn)代醫(yī)學中的亞健康有緊密的聯(lián)系。中醫(yī)學認為，虛損為人體正氣不足、氣血津液虧虛所致，治療則以扶正固本，使機體恢復正常的生理機能。鑒于目前臨床上虛損癥患者逐漸增加，但因個體的社會影響及倫理等方面很大程度上限制了虛損癥內(nèi)在作用機制的相關(guān)研究。因此要探尋傳統(tǒng)醫(yī)學通過扶正固本治療虛證的科學內(nèi)涵，借助動物模型來觀察虛損癥的現(xiàn)代實質(zhì)。氣虛、血虛、陰虛、陽虛是中醫(yī)學虛證的幾種證型，在前期科研人員也對氣虛動物模型(如利用煙熏、瀉下、勞累、饑餓、失血等形式復制)，血虛動物模型(如利用失血、溶血、化學損傷、輻射損傷等形式復制)，陽虛動物模型(如利用腎上腺皮質(zhì)激素類藥、雌激素、嘌呤類藥、游泳、飲食失調(diào)、瀉下等形式復制)，陰虛動物模型(如利用利血平、糖皮質(zhì)激素、甲狀腺激素、飲食不節(jié)、疲勞等形式復制)進行了探索[1-2]。但任何一種虛證模型都有各自的特征，且在日常飲食、生活環(huán)境等因素的疊加作用下患者往往呈現(xiàn)出氣血陰陽俱虛的生理狀態(tài)，故而在臨床上單純性的虛損癥并不常見。因此，本研究基于以往綜合性虛損證造模法的研究進展，進一步設計了動物實驗并觀察不同組別中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)/環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、水通道蛋白4(AQP4)變化，以期實驗模型更加貼切臨床虛損癥病人的各項生理狀態(tài)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級KM雄性成年小鼠36只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，小鼠購自重慶騰鑫生物科技有限公司，合格證號：SCXK(軍)2012-0011。實驗經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查批準，批號：17009018。小鼠購入后適應性喂養(yǎng)3 d，整個實驗期間均在室溫22～24 ℃，相對濕度55%～65%環(huán)境下，自然光照、自由飲水飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanine monophosphate，cGMP)試劑盒購于深圳子科生物科技有限公司；水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)抗體購于Abcam公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司；MinuteTM動物細胞/組織總蛋白提取試劑盒，購于北京英文特生物技術(shù)有限公司；微量BCA蛋白定量試劑盒，購于北京康為世紀生物科技有限公司；PVDF膜，購于Millipore公司。小鼠自主活動儀購于成都泰盟科技有限公司；酶標儀購于美國BIO-RAD公司；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購于美國BIO-RAD公司；電子顯微鏡購于日本奧林巴斯株式會社。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與造模

根據(jù)體質(zhì)量將36只KM小鼠隨機分成正常對照組、模型組A、模型組B，每組12只。中途如有動物死亡，則同步補充，保證每組12只動物。

模型組A：小鼠灌胃30%番瀉葉水浸液10 mL/kg及游泳15 min(水溫23～25 ℃)，連續(xù)3周，每周6 d，每天1次。并于造模第1天時，小鼠一次性尾尖放血0.3 mL。

模型組B：小鼠灌胃40%番瀉葉水浸液10 mL/kg及游泳25 min(水溫23～25 ℃)，連續(xù)3周，每周6 d，每天1次。并于造模第1天時，小鼠一次性尾尖放血0.4 mL。

1.3.2 體征檢測

每周第7天時觀察小鼠外觀狀態(tài)，記錄體質(zhì)量，測量體溫、自主活動及游泳力竭時間(記錄小鼠入水至力竭的時間。力竭標準為：水溫23～25 ℃，小鼠鼻部在水面上下浮動，最終至頭浸入水面以下5 s未能浮上來視作力竭，將小鼠撈出，擦干水，繼續(xù)飼養(yǎng))。

1.3.3 血漿cAMP、cGMP檢測

末次體征檢測結(jié)束后，麻醉小鼠，股靜脈取血，按照試劑盒說明書操作檢測血漿cAMP、cGMP含量。

1.3.4 臟器指數(shù)測定

小鼠取材，分別取出肝、心、脾、肺、腎、胸腺，稱重，計算臟器指數(shù)。

1.3.5 Western blot檢測腎臟AQP4蛋白

取腎臟，根據(jù)試劑盒說明，腎臟總蛋白提取后，BCA法蛋白定量。按試劑盒操作步驟制備濃度12%分離膠和濃度5%濃縮膠，80 V電壓電泳2 h后60 V電壓轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h后加Ⅰ抗，β-actinⅠ抗?jié)舛?∶6 000、AQP4Ⅰ抗1∶500，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜后加入Ⅱ抗1∶10 000，室溫孵育2 h，TBST沖洗3次，ECL顯影液顯影，Image J計算灰度值，進行比較。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 對體質(zhì)量的影響

正常對照組小鼠體質(zhì)量穩(wěn)步增長，模型組小鼠體質(zhì)量增長緩慢，造模2、3周時，模型組A、B小鼠體質(zhì)量均明顯低于正常對照組(P<0.01)，但模型組A、B之間無顯著差異，見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量測試結(jié)果

2.2 對自主活動的影響

正常對照組小鼠身形勻稱，活動自如，對外界刺激反應正常，皮毛濃密、色乳白有光澤，飲食、二便均正常。模型組小鼠造模1周后開始出現(xiàn)皮毛稀疏且暗淡無光澤，飲食減少，鼠尾冰冷，活動減少。造模2、3周時，模型組A、B小鼠自主活動次數(shù)顯著低于正常對照組(P<0.01，P<0.05)，但模型組A、B之間無明顯差異，見表2。

表2 各組小鼠自主活動測試結(jié)果次，n=12)

2.3 對體溫的影響

正常對照組小鼠體溫正常，模型組小鼠體溫有所降低。造模1周后，模型組B小鼠體溫明顯低于正常對照組(P<0.05)；造模2、3周時，模型組A、B小鼠體溫均顯著低于正常對照組(P<0.01)；且在造模3周時，模型組B明顯低于模型組A(P<0.05)，見表3。

表3 各組小鼠體溫測試結(jié)果

2.4 對游泳力竭時間的影響

正常對照組小鼠游泳力竭時間比較恒定在60 min左右，模型組小鼠游泳力竭時間明顯縮短，造模1、2、3周時，模型組A、B小鼠游泳力竭時間均明顯低于正常對照組(P<0.01)，但模型組A、B之間無顯著差異，見表4。

表4 各組小鼠游泳力竭時間測試結(jié)果

2.5 對臟器指數(shù)的影響

正常對照組小鼠臟器指數(shù)正常，模型組小鼠肝、脾、腎有所增大，胸腺萎縮。其中，模型組B小鼠的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)明顯高于正常對照組(P<0.05)，見表5。

表5 各組小鼠臟器指數(shù)測試結(jié)果

2.6 對血漿cAMP、cGMP含量的影響

正常對照組小鼠血漿cAMP/cGMP比值為0.38，模型組A、B小鼠血漿cAMP、cGMP含量均顯著高于正常對照組(P<0.01,P<0.05)，但模型組A、B之間無明顯差異，見表6。

表6 各組小鼠血漿cAMP、cGMP測試結(jié)果

2.7 對腎臟組織AQP4蛋白表達的影響

模型組A、B小鼠腎臟組織中AQP4蛋白表達明顯低于正常對照組(P<0.01)，見表7、圖1。

表7 各組小鼠腎臟組織AQP4蛋白測試結(jié)果

圖1 各組小鼠腎臟組織AQP4蛋白條帶

3 討論

規(guī)范化、標準化的建立動物模型是現(xiàn)代科學研究中醫(yī)藥成果的基本條件。氣虛、血虛、陰虛、陽虛是傳統(tǒng)醫(yī)學對虛損證劃分的不同證型，在中醫(yī)學的基礎研究中，動物模型也應有相應造模手段與之對應。以往的單純性虛損癥造模方法雖各有特點，但也有很多共同之處，因此，本研究從中選擇在各類虛證造模中使用頻繁的、重復性高的、容易操作的造模方法，混合在一起建立一種包羅氣虛、血虛、陰虛、陽虛的虛證動物模型，模擬臨床虛損證病人的生理病理狀態(tài)，力求所造之模型的各項指征更加挈合臨床中虛損患者的生理狀態(tài)。

在已有的氣虛動物模型方法中，瀉下、勞累及放血法有較多的應用[3-4]，血虛動物模型主要以失血法為主[5]，陽虛動物模型也多見瀉下與勞累結(jié)合[6]，陰虛動物模型也見勞累法[7]。因單一性虛損癥與綜合性虛損癥模型的實驗目的相反，前者是在單一虛損中縱向深入，所造之模型程度重，而后者是在綜合性虛損中廣泛覆蓋，所造之模型程度輕。因此，本研究從中選擇瀉下法、游泳勞累法、放血法并依據(jù)以往方式的中等程度進行混合造模，復制虛證小鼠模型。

cAMP與cGMP在細胞功能、代謝、信息傳遞中發(fā)揮了重要作用，且在正常的機體內(nèi)多呈現(xiàn)相互拮抗、最終導致動態(tài)平衡狀態(tài)的生理狀態(tài)[8]。這與中醫(yī)理論中的陰陽理論密切相關(guān)，甚至有不少學者將cAMP與cGMP作為陰陽的物質(zhì)基礎[9]，而AQP家族是大量遍布于肺、腸、胃等器官的重要蛋白，特別是AQP4對各個器官中水的運化及機體內(nèi)血液的盛衰有密切聯(lián)系[10-11]，因此目前常用cAMP和cGMP含量及AQP4蛋白表達觀察模型中陰陽氣血的變化。結(jié)合文獻資料[12]選擇從外觀行為、體質(zhì)量、體溫、自主活動、游泳力竭時間等指標觀察虛證小鼠的體征，并測定主要臟器指數(shù)、血漿cAMP與cGMP含量及腎臟AQP4蛋白表達，深入評價虛證小鼠的特征變化情況。

結(jié)果，通過連續(xù)3周的造模，模型組A、模型組B均出現(xiàn)顯著的虛證表現(xiàn)：小鼠皮毛稀少疏落且暗淡沒有光澤，食欲欠佳，鼠尾冰冷，運動量下降，有稀便；體質(zhì)量雖有所增長，但明顯受到抑制；體溫明顯降低；自主活動顯著減少，小鼠蜷縮不喜活動；游泳力竭的時長明顯縮短，小鼠抗應激能力降低，處于疲憊狀態(tài)。臟器指數(shù)顯示，除心、肺正常外，胸腺指數(shù)降低，雖沒有顯著性，但也表明小鼠的免疫功能下降；肝、脾、腎指數(shù)增加，出現(xiàn)對應的氣虛、血虛證變化。血漿cAMP、cGMP含量均明顯升高，表明陰虛證和陽虛證均出現(xiàn)[13-14]。小鼠腎臟組織中AQP4蛋白表達顯著降低，這和虛證動物相關(guān)的實驗研究報道一致[15-16]。在3周的造模過程中，造模1周時上述的虛證動物體征表現(xiàn)不明顯，隨著造模時間的延長，虛損證動物體征表現(xiàn)越來越明顯。造模2周時，可出現(xiàn)明顯的虛證體征表現(xiàn)，故可確定造模2周可復制出成功的虛證動物模型。

模型組A與模型組B的造模方法一樣，不同在于所使用的番瀉葉水浸液的濃度、游泳時間和放血量的不同。結(jié)果也基本相同,都是在造模2周后成功復制虛證動物模型，略有不同在于模型組B的損傷程度更為嚴重。

模型組A、模型組B均成功構(gòu)建了混合型的虛損證小鼠模型，且模型鼠的各項體征及AQP4等指標的變化均與對照有顯著的差異，能較大程度上反應出虛損癥患者的各種異常的生理狀態(tài)。后續(xù)課題組將持續(xù)關(guān)注國內(nèi)外中醫(yī)證候本質(zhì)相關(guān)課題的研究進展，并結(jié)合相關(guān)的動物及細胞實驗對本模型作持續(xù)性的改進與完善，力求為從事虛損癥的研究人員提供新的思路與方法。