天香丹對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究

辛錦鈺，張亞潔，古麗葛娜·薩吾爾，何歡，任珊，安冬青

(新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011)

1 材料與方法

1.1 藥品

天香丹顆粒(新疆華世丹藥業(yè)有限公司，批號(hào)：新藥制字Z20040820)；維生素C(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：A8100)；tBHP(上海麥克林生化科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：B802372)。

1.2 細(xì)胞株

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs，購于上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 試劑

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基購于美國(guó)ScienCell公司；胎牛血清、胰酶和雙抗均購于美國(guó)Gibco公司；PBS購于美國(guó)Hyclone公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購于北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒和微量還原型谷胱甘肽(GSH)測(cè)定試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號(hào)依次為：A001-3-2、A020-2、A006-2-1)；活性氧檢測(cè)試劑盒及細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒則購于碧云天生物技術(shù)有限公司(批號(hào)依次為：S0033、C0003)。

1.4 儀器

多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendrof公司)。

1.5 方法

1.5.1 HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)

用含有10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素-鏈霉素)和1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，每2～3 d傳代1次，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的活躍細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 tBHP誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激損傷模型的建立

合同簽訂后，按照誰承辦誰負(fù)責(zé)的原則，由合同承辦部門負(fù)責(zé)合同的實(shí)際履行，在履行中因我方過錯(cuò)引發(fā)法律糾紛，給公司造成經(jīng)濟(jì)損失的，應(yīng)追究承辦部門或相關(guān)人員的責(zé)任。合同歸口管理部門負(fù)責(zé)各部門合同履行的監(jiān)督、檢查與考核，并每半年定期對(duì)各部門合同履行情況進(jìn)行清查通報(bào)。

待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，用胰蛋白酶進(jìn)行消化后離心,用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于96孔板中，使每孔細(xì)胞數(shù)為1.5×104個(gè)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，加入含不同濃度tBHP的無血清培養(yǎng)液，藥物濃度分別為60 μmol/L、120 μmol/L、180 μmol/L、240 μmol/L，并設(shè)置對(duì)照組和空白組，其中對(duì)照組含有細(xì)胞和培養(yǎng)液，空白組只有培養(yǎng)液。作用24 h后各孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄去上清，再加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)溶液，使藍(lán)紫色甲臜充分溶解，酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞存活率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率(%)=[(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)]×100%。

1.5.3 天香丹對(duì)tBHP誘導(dǎo)的HUVECs存活率的影響

將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照藥組和天香丹低、中、高劑量組，按每孔1.5×104個(gè)將細(xì)胞接種于96孔板中，待貼壁后棄去培養(yǎng)液。對(duì)照組和模型組均加入無血清培養(yǎng)液，天香丹組加入含不同濃度天香丹的無血清培養(yǎng)液，其濃度分別為30 μg/mL、60 μg/mL、90 μg/mL，陽性對(duì)照藥組為50 μg/mL維生素C組，預(yù)處理12 h。棄去培養(yǎng)液，隨后加入240 μmol/L tBHP作用24 h。各孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄上清，再加入150 μL DMSO溶液使藍(lán)紫色甲臜溶解，于酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔A值，計(jì)算細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.4 細(xì)胞中LDH、SOD、GSH含量的測(cè)定

按每孔3.0×105個(gè)將細(xì)胞均勻接種于6孔板中，密切關(guān)注細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)棄去舊培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為對(duì)照孔、模型孔、陽性對(duì)照藥孔和天香丹低、中、高劑量孔，其中對(duì)照孔及模型孔加入2 mL無血清培養(yǎng)液，陽性對(duì)照藥孔加等體積50 μg/mL的維生素C，天香丹孔則各加入等體積濃度依次為30 μg/mL、60 μg/mL、90 μg/mL的天香丹培養(yǎng)液，預(yù)處理12 h后棄去培養(yǎng)液，加入240 μmol/L tBHP作用24h，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激后收集各組細(xì)胞，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作并測(cè)定各組細(xì)胞中LDH、SOD和GSH的含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.5 天香丹對(duì)tBHP誘導(dǎo)的HUVECs形態(tài)學(xué)的影響

按每孔3.0×105個(gè)將細(xì)胞均勻接種于6孔板中。待細(xì)胞密度達(dá)80%～90% 時(shí)棄去培養(yǎng)液，并按1.5.4方法給予細(xì)胞不同處理，后棄去舊培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液，將細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察各組形態(tài)學(xué)差異，并保存圖像。

1.5.6 Hoechst 33258熒光染色法檢測(cè)天香丹對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

制備細(xì)胞爬片，并按1.5.4方法給予細(xì)胞不同處理，后棄去培養(yǎng)液，潤(rùn)洗細(xì)胞并加入固定液固定20 min，棄去固定液，PBS洗滌固定液3次，每次3～5 min。隨后按每孔500 μL加入Hoechst 33258染色液染色5 min，清洗染色液3次，期間將抗熒光淬滅封片液滴加在載玻片上，待染色液清洗完全將貼有細(xì)胞的玻片翻蓋于載玻片上，確保細(xì)胞與封片液緊密接觸，將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察并隨機(jī)選擇3個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中凋亡所占細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算凋亡率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值。凋亡率(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/100)×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度tBHP對(duì)HUVECs存活率的影響

采用MTT法測(cè)定不同濃度tBHP對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果如表1所示，與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率與tBHP濃度呈負(fù)相關(guān)，120 μmol/L、180 μmol/L和240 μmol/L tBHP作用24 h后，能顯著降低細(xì)胞存活率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中240 μmol/L tBHP濃度細(xì)胞存活率為(50.79±0.53)%，接近50%，為建立氧化應(yīng)激模型的最佳作用濃度。

表1 不同濃度tBHP對(duì)HUVECs存活率的影響

2.2 天香丹對(duì)tBHP誘導(dǎo)的HUVECs存活率的影響

MTT法評(píng)價(jià)天香丹對(duì)tBHP誘導(dǎo)的HUVECs存活率的影響，結(jié)果如表2所示，模型組細(xì)胞存活率為(49.34±2.45)%，與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.05)；相較于模型組，陽性對(duì)照組和不同濃度天香丹預(yù)處理組的細(xì)胞存活率均有明顯升高(P<0.05)，表明天香丹對(duì)tBHP誘導(dǎo)的HUVECs氧化損傷具有抑制作用。

表2 不同濃度天香丹對(duì)tBHP誘導(dǎo)的HUVECs存活率的影響

2.3 天香丹對(duì)tBHP誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞內(nèi)LDH活性、SOD活力和GSH含量的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)tBHP誘導(dǎo)損傷后，細(xì)胞LDH的釋放量顯著上升(P<0.01)，SOD的活性和GSH的含量顯著下降(P<0.01)；與模型組相較，陽性藥組和天香丹預(yù)處理組LDH釋放量明顯下降，SOD的活性和GSH含量明顯上升，如表3所示。

表3 不同濃度天香丹對(duì)tBHP誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞內(nèi)LDH的活性、SOD活力和GSH含量的影響

2.4 天香丹對(duì)tBHP誘導(dǎo)的HUVECs形態(tài)學(xué)的影響

顯微鏡下觀察結(jié)果如圖1所示，模型組細(xì)胞在tBHP刺激下或皺縮或細(xì)胞破碎，同時(shí)因氧化應(yīng)激導(dǎo)致膜蛋白活性改變等因素，細(xì)胞貼壁不良，漂浮細(xì)胞較多；陽性對(duì)照組和天香丹低劑量組與模型組相比稍有好轉(zhuǎn)，皺縮細(xì)胞減少，貼壁細(xì)胞數(shù)量增加但形態(tài)較差；天香丹中劑量組和高劑量組較模型組差異則更為明顯，漂浮細(xì)胞明顯減少，貼壁細(xì)胞數(shù)量較多，尤以高劑量組為最，形態(tài)呈梭形或多邊形，彼此嵌合。提示維生素C和低、中、高劑量天香丹預(yù)處理后，均能有效改善tBHP誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞形態(tài)損傷。

注：A.對(duì)照組；B.模型組；C.陽性對(duì)照組；D.天香丹低劑量組；E.天香丹中劑量組；F.天香丹高劑量組。

2.5 Hoechst 33258熒光染色法檢測(cè)天香丹對(duì)tBHP誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞凋亡的影響

熒光顯微鏡下，染色結(jié)果如圖2所示：對(duì)照組細(xì)胞核形態(tài)多為光滑圓形或橢圓形，核著色程度均一且熒光強(qiáng)度較低，對(duì)應(yīng)細(xì)胞凋亡率維持在低水平(3.35±0.57)%；經(jīng)tBHP誘導(dǎo)損傷后，細(xì)胞貼壁不良，視野范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞核形態(tài)由橢圓形轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰?guī)則形，甚至出現(xiàn)核泄漏，胞核也因染色質(zhì)固縮而出現(xiàn)致密濃染，熒光由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)白色甚或亮白色，經(jīng)計(jì)算，凋亡率達(dá)到(40.62±1.78)%，較對(duì)照組明顯上升；陽性對(duì)照藥及天香丹預(yù)處理后，細(xì)胞核形態(tài)由不規(guī)則形逐漸轉(zhuǎn)為橢圓形，細(xì)胞凋亡受到不同程度的抑制，凋亡率分別降至(27.26±1.48)%、(27.43±1.44)%、(10.08±1.52)%、(5.08±1.06)%，與模型組相比差異明顯(P<0.01)。

注：A.對(duì)照組；B.模型組；C.陽性對(duì)照組；D.天香丹低劑量組；E.天香丹中劑量組；F.天香丹高劑量組。

3 討論

冠狀動(dòng)脈微循環(huán)是指由直徑300 μm以內(nèi)的微血管組成的供心臟血液流通的循環(huán)網(wǎng)，通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮剪切應(yīng)力、血管舒縮和物質(zhì)運(yùn)輸來保證局部血流與組織代謝供需相匹配[4]。研究顯示，當(dāng)微循環(huán)發(fā)生結(jié)構(gòu)或功能性障礙時(shí)，供需失衡會(huì)干擾心肌血流量的調(diào)控，對(duì)冠心病患者心肌灌注造成不利影響[5]。CMD的形成原因多樣，內(nèi)皮功能障礙是其中的主要因素之一，其特征是氧化應(yīng)激增加，NO生物利用度逐漸降低，進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。

氧化應(yīng)激是機(jī)體在遭受刺激時(shí)，體內(nèi)自由基成分包括活性氧(ROS)和活性氮(RNS)產(chǎn)生過多，氧化與抗氧化系統(tǒng)之間平衡失調(diào)的適應(yīng)性反應(yīng)。生理狀態(tài)下，一定濃度的氧自由基參與細(xì)胞的氧化還原調(diào)節(jié)和正常代謝功能，如促有絲分裂反應(yīng)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生等，過量則可通過酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)清除[2]。在冠心病心肌缺血缺氧等病理因素作用下，細(xì)胞ROS生成增加，高濃度ROS可對(duì)蛋白質(zhì)和DNA進(jìn)行不利修飾，引起生物活性改變，功能喪失，同時(shí)也可通過脂質(zhì)過氧化作用破壞細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)重排[6]。乳酸脫氫酶(LDH)是細(xì)胞損傷的判斷指標(biāo)，其水平反應(yīng)了細(xì)胞膜受損程度；超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)是機(jī)體重要的內(nèi)源性抗氧化因子，前者通過歧化方式將超氧化物轉(zhuǎn)化為H2O2，再經(jīng)由后者轉(zhuǎn)化為氧和水，從而發(fā)揮清除氧自由基，減輕氧化應(yīng)激損傷的作用[7]。tBHP是常見的體外氧化應(yīng)激模型誘導(dǎo)劑，可引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)并損傷DNA，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚或凋亡，相較H2O2具有穩(wěn)定，不易分解的優(yōu)點(diǎn)[8-9]，因此本研究采用tBHP作為誘導(dǎo)劑建立細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。研究結(jié)果顯示，HUVECs經(jīng)240 μmol/L tBHP作用24 h后，LDH釋放量顯著升高，而SOD的活性及GSH含量明顯降低，表明tBHP可有效誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。

根據(jù)冠脈微循環(huán)障礙的臨床特點(diǎn)，中醫(yī)將其歸為“胸痹”“脈痹”的范疇，治宜益氣活血、化瘀通絡(luò)[10]。天香丹由新塔花、丹參、降香和紅景天4味中藥配伍而成，既有益氣補(bǔ)虛之功，又奏和血通絡(luò)之效，可顯著改善冠心病患者心肌缺血缺氧癥狀。既往研究顯示，天香丹主藥新塔花總黃酮具有舒張血管、抗氧化應(yīng)激、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用[11-12]；降香可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)改善后負(fù)荷增加型心衰大鼠的心臟功能，提高心肌細(xì)胞存活率，其中的新黃酮成分還對(duì)缺氧復(fù)氧導(dǎo)致的細(xì)胞損傷具有明顯保護(hù)作用[13-14]。而本實(shí)驗(yàn)對(duì)受損細(xì)胞存活率和細(xì)胞中LDH、SOD、GSH的檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)過不同濃度天香丹及天然抗氧化劑維生素C預(yù)處理后，細(xì)胞存活率逐漸上升，SOD的活性和GSH含量較模型組提升明顯，LDH釋放量也有所減輕。提示我們，天香丹能通過增強(qiáng)細(xì)胞自由基清除力，有效遏制外源性氧化劑對(duì)HUVECs的損傷。

細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種程序性死亡方式，也是導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，影響內(nèi)皮功能的病理環(huán)節(jié)之一，氧化應(yīng)激是其重要誘導(dǎo)因素：一方面細(xì)胞內(nèi)ROS堆積可誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔開放，通過破壞細(xì)胞膜電位介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，另一方面ROS也可通過上調(diào)p53及p66shc的表達(dá),引起DNA損傷進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15-16]。細(xì)胞凋亡的發(fā)生并非朝發(fā)夕至，通過有效干預(yù)手段仍有部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡，保護(hù)細(xì)胞免于過度損傷的可能。Hoechst 33258是一種脫氧核糖核酸粘合劑，可與DNA相互結(jié)合，是目前常用細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法[17]。本研究對(duì)細(xì)胞核染色結(jié)果顯示，240 μmol/L tBHP作用24 h能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起染色質(zhì)固縮及核泄漏，而經(jīng)過維生素C及天香丹預(yù)處理后細(xì)胞凋亡率逐漸下降，天香丹高劑量組凋亡率與對(duì)照組相比更無明顯差異(P>0.05)，提示天香丹能部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡，且這種抑制凋亡的作用在一定范圍內(nèi)與濃度呈正相關(guān)。

綜上所述，天香丹能保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免于氧化損傷，而這種保護(hù)作用可能與抗氧化通路的激活，自由基清除力的增強(qiáng)及細(xì)胞凋亡的部分逆轉(zhuǎn)有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)為天香丹在CMD的預(yù)防和治療提供了一定的科學(xué)依據(jù)，但天香丹對(duì)HUVECs保護(hù)作用的分子機(jī)制仍待進(jìn)一步闡明。