逍遙散對抑郁大鼠海馬CA1區(qū)PI3K/AKT信號通路的調(diào)節(jié)作用研究

周雪明,尹雅靜,常卓,柳晨玥,鄧賀,梁碧月,譚曾德,隋方宇*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；3.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

抑郁癥是臨床常見的精神疾病之一，主要表現(xiàn)為長期情緒低落和快感缺失等癥狀，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)字，每年有近80萬抑郁癥患者死于自殺，抑郁癥已經(jīng)成為世界第三大疾病負(fù)擔(dān)，并預(yù)測2030年將成為世界第一大疾病負(fù)擔(dān)[1]。基于藏象理論中“肝主疏泄，調(diào)暢情志”的觀點(diǎn)，中醫(yī)學(xué)多從“肝”論治情志疾病，包括抑郁癥。逍遙散始載于《太平惠民和劑局方》，具有疏肝健脾之效，對情志疾病的治療具有顯著療效。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)逍遙散能降低抑郁癥大鼠海馬組織中的谷氨酸水平，而谷氨酸是介導(dǎo)大部分中樞神經(jīng)興奮性的傳導(dǎo)中樞[2]。N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)是一類離子型谷氨酸受體，研究表明NMDA受體所觸發(fā)的信號通路中，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路在介導(dǎo)突觸可塑性、參與神經(jīng)發(fā)生、損傷后修復(fù)等過程發(fā)揮重要作用[3]。本研究選用慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)法誘導(dǎo)建立抑郁大鼠模型，探討逍遙散對谷氨酸和PI3K/Akt信號通路的調(diào)節(jié)作用。

1 材料

1.1 動物

實(shí)驗(yàn)用SD雄性大鼠100只，體質(zhì)量(200±20)g，于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行飼養(yǎng)，溫度(20±1)℃，相對濕度(60±10)%，每日12 h光/暗周期，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動物均購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物合格證號SCXK(京)2016-0038。本實(shí)驗(yàn)已通過北京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(BUCM-4-2017051015-2015)。

1.2 藥物

逍遙散由柴胡、白芍、當(dāng)歸、炒白術(shù)、茯苓、炙甘草、薄荷、生姜組成，按照藥物比例5∶5∶5∶5∶5∶4∶1∶5進(jìn)行配比調(diào)制。藥物飲片購自北京同仁堂(毫州)飲片有限責(zé)任公司，由九芝堂股份有限公司按照《中國藥典2015年版》的流程進(jìn)行制備，放入4 ℃冰箱備用；鹽酸氟西汀分散片(百憂解，法國Lilly公司，批號9492AA)。

1.3 試劑

1.4 儀器

酶標(biāo)儀(Biotek，型號Epoch2)；實(shí)時熒光定量PCR儀(Bio-Red，型號CFX96)；梯度PCR儀(Bio-Red，型號T100)；大鼠腦切片模具(Zivic Instrument，BSRAS001-1)；凝膠成像儀(Bio-Red)等。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥

將100只雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，稱量后剔除體質(zhì)量增長速度緩慢、過快的大鼠，曠場實(shí)驗(yàn)后剔除過于安靜、活躍的大鼠，余下大鼠按照體質(zhì)量進(jìn)行標(biāo)號，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、逍遙散組和氟西汀組。除正常組外的各組進(jìn)行CUMS抑郁大鼠模型的制備：①24 h禁水，②24 h禁食，③45 ℃熱烘5 min，④24 h潮濕墊料，⑤45°籠具傾斜17 h，⑥17 h白噪聲，⑦24 h晝夜顛倒，⑧1 min夾尾，⑨3 h行為限制。上述刺激方式隨機(jī)于21 d內(nèi)每日選取1種，并連續(xù)2 d內(nèi)不采用相同的刺激方式。每日觀察大鼠的活動、進(jìn)食情況、對刺激的應(yīng)激反應(yīng)，為造模成功標(biāo)準(zhǔn)提供參考。造模成功后，不同組別予以不同給藥方案灌胃：逍遙散組(逍遙散生藥2.224 g·kg-1d-1)、氟西汀組(氟西汀生藥2 mg·kg-1·d-1)、模型組(與逍遙散組等體積雙蒸水)、正常組(與逍遙散組等體積雙蒸水)灌胃。連續(xù)3周灌胃后(給藥過程中仍進(jìn)行CUMS刺激，操作方法與上述造模方法相同)，通過體質(zhì)量檢測、行為學(xué)檢測(糖水偏嗜實(shí)驗(yàn)、曠場實(shí)驗(yàn))對各組大鼠進(jìn)行評估。

2.2 糖水偏嗜實(shí)驗(yàn)(SFT)

于造模前一天、造模成功后和給藥結(jié)束后進(jìn)行SFT。實(shí)驗(yàn)開始前72 h對大鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。第1日每籠放置2個外觀、體積相同并均裝有1%的蔗糖水的水瓶，第2日將其中一瓶糖水換為等體積雙蒸水。禁食、水24 h后給予每只大鼠相同外觀、體積的1%蔗糖水和雙蒸水，1 h后取走水瓶并稱重。根據(jù)公式“糖水偏嗜率(%)=糖水?dāng)z入量/(糖水?dāng)z入量+普通水?dāng)z入量)×100%”計(jì)算各組大鼠的糖水偏嗜率，可反映大鼠快感缺失的程度。

2.3 曠場實(shí)驗(yàn)(OFT)

于造模成功后、給藥結(jié)束后進(jìn)行OFT。將大鼠放置于一個正上方帶有高清攝像頭,體積為100 cm×100 cm×50 cm的黑色敞箱中，攝像頭可拍攝大鼠在曠場箱中自由探索5 min的軌跡視頻。每只大鼠探索結(jié)束后，用75%的乙醇清洗底部和四周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，視頻用Etho Vision 3.0軟件分析計(jì)算大鼠在中央?yún)^(qū)停留時間和總的運(yùn)動距離，可評估大鼠的行為活動。

2.4 體質(zhì)量檢測

于實(shí)驗(yàn)第0天(實(shí)驗(yàn)前)，實(shí)驗(yàn)1周、2周、3周(造模成功后)、4周、5周、6周(給藥結(jié)束后)分別對各組大鼠進(jìn)行稱體質(zhì)量并記錄。

2.5 攝食量測定

于實(shí)驗(yàn)開始后，監(jiān)測各組每日、每周(連續(xù)6周)的攝食量。每日攝食量=給予食量-剩余食量，每周攝食量=每周給予攝食量-每周剩余食量。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測海馬組織中NE、5-HT水平

行為學(xué)檢測結(jié)束后處死各組大鼠，留取海馬組織。將海馬組織塊清洗后加入PBS，使用超聲破碎儀將海馬組織勻漿，勻漿液離心(5 000 r/min，5 min)后留取上清液進(jìn)行檢測。NE 稀釋為400、200、100、50、25 pg/mL，5-HT稀釋為240、120、60、30、15 pg/mL。余步驟按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

根據(jù)相關(guān)參數(shù)繪制枯水期煤電機(jī)組需求曲線，其中橫軸代表非強(qiáng)制容量，縱軸代表非強(qiáng)制容量價格。根據(jù)相關(guān)參數(shù)確定A、B兩個點(diǎn)，然后A點(diǎn)與X軸平行畫一條線，B點(diǎn)與縱軸平行畫一條線，連接A、B即得出可靠性備用需求曲線如圖4所示。其中目標(biāo)容量水平在A點(diǎn)。其中A點(diǎn)為當(dāng)年枯水期煤電必開機(jī)組的容量和固定成本，B點(diǎn)為可用機(jī)組的容量和可用機(jī)組的維持成本。

2.7 比色法檢測大鼠海馬CA1區(qū)谷氨酸濃度

行為學(xué)檢測結(jié)束后處死各組大鼠，冰面取腦后用成年大鼠腦切片模具將腦組織切片(厚度1.0 mm)，在解剖顯微鏡下取海馬CA1區(qū)組織，凍存于-80 ℃低溫冰箱中。取15 mg海馬CA1區(qū)組織加入PBS，超聲裂解樣本后離心(14 000 r/min,10 min)取上清液，凍存于-80 ℃低溫冰箱中待測。配制600 μL 2.5 mmol/L谷氨酸預(yù)混合溶液Premix，稀釋后轉(zhuǎn)移至透明底的96孔板孔中。每孔加入不同工作液后，記OD值檢測，最后根據(jù)公式計(jì)算谷氨酸實(shí)際濃度。

2.8 實(shí)時定量PCR法(RT-qPCR)檢測NR2B、PI3K的mRNA水平

取適量海馬CA1區(qū)組織加入Trizol研磨后提取總 RNA，測定RNA濃度及純度后合成cDNA。以反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，40個循環(huán)進(jìn)行RT-PCR檢測，所得CT值采用2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2.9 蛋白免疫印跡法(Western blot)測定NR2B、PI3K、P-AKT、Akt的蛋白表達(dá)

取100 mg海馬CA1區(qū)組織加500 μL RIPA蛋白裂解液，用超聲破碎勻漿后離心(12 000 r/min，15 min)取上清液待測。以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速4 ℃離心15 min。留取總蛋白后根據(jù)BCA法檢測總蛋白的濃度，計(jì)算蛋白的上樣量。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜放入5% BSA的平皿中，室溫封閉2h。轉(zhuǎn)移至用5%脫脂奶粉稀釋的一抗PI3K(1∶3 000)、Akt(1∶1 000)、P-AKT(1∶4 000)、NR2B(1∶1 000)和β-actin(1∶5 000)多克隆抗體中，4 ℃過夜孵育。TBST清洗3次后將膜加入辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔的二抗(1∶5 000)，室溫2 h孵育。TBST洗3次，TBS洗1次。在ChemiDoc MP Imaging System成像儀中用高靈敏度化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)并拍照保存。用Image J 2.0軟件進(jìn)行各條帶灰度值分析，目標(biāo)蛋白的相對含量以目標(biāo)蛋白/β-actin蛋白灰度值的比值作為統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 逍遙散改善抑郁模型大鼠抑郁行為

3.1.1 曠場實(shí)驗(yàn)

6周CUMS造模和給藥后各組大鼠OFT實(shí)驗(yàn)運(yùn)動軌跡發(fā)生改變，見圖1。6周CUMS造模改變了大鼠在曠場實(shí)驗(yàn)的中央?yún)^(qū)停留時間和運(yùn)動總距離，見表2。模型組與正常組比較中央?yún)^(qū)停留時間減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。逍遙散組、氟西汀組大鼠在中央?yún)^(qū)停留時間多于模型組，和模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組大鼠運(yùn)動總距離短于正常組，和正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。逍遙散組、氟西汀組大鼠在中央?yún)^(qū)停留時間多于模型組，與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組大鼠OFT實(shí)驗(yàn)運(yùn)動軌跡圖

表2 各組大鼠中央?yún)^(qū)停留時間和運(yùn)動總距離

3.1.2 糖水消耗實(shí)驗(yàn)

第0、21和41日進(jìn)行了SPT，見表3。4組大鼠的基線蔗糖偏好率沒有顯著差異。CUMS造模3周后，模型組、逍遙散組、氟西汀組的大鼠蔗糖偏好率明顯低于正常組，各組與正常組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥3周后，糖水消耗實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠蔗糖偏好率低于正常組，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)過逍遙散、氟西汀3周的治療后，逍遙散組、氟西汀組大鼠的糖水消耗量高于模型組(P<0.05)。

表3 各組大鼠0、3、6周糖水消耗試驗(yàn)中糖水偏好

3.2 逍遙散增加抑郁模型大鼠的體質(zhì)量和攝食量

3.2.1 大鼠攝食量監(jiān)測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)初，各組間大鼠攝食量比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組大鼠第3周到第6周的攝食量均少于正常組，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。而逍遙散組、氟西汀組大鼠攝食量在造模前3周，與模型組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。藥物干預(yù)3周后，逍遙散組、氟西汀組大鼠攝食量較模型組增加，各組與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠攝食量變化

3.2.2 大鼠體質(zhì)量監(jiān)測結(jié)果

實(shí)驗(yàn)初，4組大鼠體質(zhì)量比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但整個應(yīng)激期，各組接受CUMS大鼠的體質(zhì)量均受到了影響，見表5。各組模型大鼠體質(zhì)量從第1周開始即低于正常組，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而治療3周后逍遙散組、氟西汀組大鼠體質(zhì)量與模型組比較均有明顯升高，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表5 各組大鼠體質(zhì)量變化

3.3 逍遙散對大鼠海馬5-HT和NE水平的作用

模型組大鼠海馬組織5-HT和NE的水平較正常組下降(P<0.05)，經(jīng)逍遙散、氟西汀治療了3周后，顯著逆轉(zhuǎn)了上述變化(P<0.05)。見表6。

表6 各組大鼠海馬5-HT、NE表達(dá)情況

3.4 逍遙散對大鼠海馬CA1區(qū)谷氨酸水平的作用

各組接受CUMS造模的大鼠海馬CA1區(qū)谷氨酸水平均有不同程度的升高，各組與正常組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。逍遙散、氟西汀組谷氨酸水平較模型組降低，顯著逆轉(zhuǎn)了上述變化(P<0.05)。與正常組相比，模型組大鼠海馬CA1區(qū)谷氨酸水平升高(P<0.05)。見表7。

表7 各組大鼠海馬CA1區(qū)谷氨酸水平

3.5 逍遙散對抑郁模型大鼠海馬CA1區(qū)NR2B表達(dá)的影響

RT-qPCR檢測NR2BmRNA水平。模型組大鼠海馬CA1區(qū)NR2B水平均低于正常組(P<0.05)。而逍遙散、氟西汀治療3周后，大鼠海馬CA1區(qū)NR2B水平與模型組比較顯著升高(P<0.05)。見表8。

Western blot檢測NR2B相對表達(dá)量。模型組大鼠海馬CA1區(qū)NR2B的陽性表達(dá)低于正常組(P<0.05)。經(jīng)過逍遙散、氟西汀治療3周后，抑郁模型大鼠海馬CA1區(qū)NR2B陽性表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表8和圖2。

表8 各組大鼠海馬CA1區(qū)NR2B的表達(dá)

圖2 NR2B蛋白表達(dá)

3.6 逍遙散對抑郁模型大鼠海馬CA1區(qū)PI3K/AKT通路的影響

3.6.1 逍遙散對抑郁模型大鼠海馬CA1區(qū)PI3K表達(dá)的影響

RT-qPCR檢測大鼠海馬CA1區(qū)PI3KmRNA水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組、大鼠海馬CA1區(qū)PI3KmRNA水平低于正常組(P<0.05)。經(jīng)過逍遙散、氟西汀治療3周后，大鼠海馬CA1區(qū)的PI3K水平明顯增高，與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表9。

Western blot檢測大鼠海馬CA1區(qū)PI3K蛋白相對表達(dá)量。模型組大鼠海馬CA1區(qū)PI3K的表達(dá)低于正常組(P<0.05)。逍遙散、氟西汀治療3周后，抑郁模型大鼠海馬CA1區(qū)PI3K表達(dá)明顯增加(P<0.05)。見表9和圖3。

表9 各組大鼠海馬CA1區(qū)PI3K的基因和蛋白表達(dá)水平

圖3 PI3K蛋白表達(dá)

3.6.2 逍遙散對抑郁模型大鼠海馬CA1區(qū)P-AKT表達(dá)的作用

Western Blot檢測結(jié)果顯示大鼠海馬CA1區(qū)P-AKT/Akt比值在模型組低于正常組(P<0.05)。逍遙散、氟西汀治療3周后，抑郁模型大鼠海馬P-AKT/Akt比值表達(dá)明顯增加(P<0.05)。見表10和圖4。

表10 各組大鼠海馬CA1區(qū)P-AKT/Akt的相對表達(dá)情況

圖4 P-AKT/Akt 蛋白表達(dá)

4 討論

抑郁癥屬于中醫(yī)“郁證”范疇，其癥狀表現(xiàn)與中醫(yī)學(xué)中癲狂、百合病、邪哭、臟躁、驚悸、奔豚氣等病癥的證候表現(xiàn)均有符合，長期以來也是中醫(yī)學(xué)治療的優(yōu)勢病種之一。中醫(yī)學(xué)對抑郁癥的治療多從“肝”論治，其理論基礎(chǔ)源于藏象理論中的“肝主疏泄”，其中“疏泄情志”是其重要的體現(xiàn)。而情志不暢反之又會使“肝失疏泄”，進(jìn)一步引起“肝郁乘脾”，從而出現(xiàn)肝郁脾虛的證候，故對于抑郁癥的治療應(yīng)在“疏肝”的基礎(chǔ)上，酌以“健脾”。逍遙散是從古至今治療“郁癥”的常用基礎(chǔ)方藥，全方由柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓、薄荷、甘草和生姜組成，以疏肝為主，兼以健脾養(yǎng)血，共奏疏肝解郁之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也不斷地證明其在抑郁癥治療方面的顯著療效[4-6]，本課題組在前期研究中也證實(shí)了逍遙散的體內(nèi)干預(yù)可顯著降低漢密爾頓抑郁量表(HAMD)及抑郁癥患者自評抑郁量表(SDS)得分[7]，本研究則在此基礎(chǔ)上采用國際公認(rèn)的CUMS方法構(gòu)建抑郁癥動物模型[8]，進(jìn)一步對逍遙散治療抑郁癥的作用機(jī)制進(jìn)行了深入探究。

抑郁癥的發(fā)生與神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，通過參與腦內(nèi)神經(jīng)突觸可塑性保護(hù)、恢復(fù)神經(jīng)營養(yǎng)因子及神經(jīng)遞質(zhì)功能等可能是探索抗抑郁治療效應(yīng)機(jī)制的重要方向[9]。在所有的腦區(qū)中，海馬CA1區(qū)對認(rèn)知和空間學(xué)習(xí)至關(guān)重要[10]，是參與記憶和情緒信息處理的關(guān)鍵腦區(qū)，對應(yīng)激反應(yīng)敏感且易損傷，且研究證實(shí)抑郁癥患者的海馬CA1區(qū)會出現(xiàn)損傷及退化，而這種損傷也更易引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，從而加重抑郁癥狀[11]。谷氨酸是介導(dǎo)大多數(shù)中樞興奮性神經(jīng)傳導(dǎo)的遞質(zhì)，腦內(nèi)神經(jīng)元中谷氨酸的合成、代謝和再攝取異常時介導(dǎo)的興奮性毒性會造成腦內(nèi)神經(jīng)元損傷，與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)[12-13]。NR2B作為NMDA家族中的一員，也是一種谷氨酸受體，對調(diào)控突觸可塑性和記憶功能具有重要作用[14]，NR2B的異常降低被證實(shí)與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)[15]，而經(jīng)過抗抑郁治療后NR2B也得到了顯著提高[16]。根據(jù)本研究結(jié)果，抑郁癥大鼠的海馬CAI區(qū)谷氨酸水平顯著高于正常大鼠(P<0.05)，而NR2B則出現(xiàn)了明顯的降低(P<0.05)，進(jìn)一步證實(shí)了與NR2B減少相關(guān)的谷氨酸積累可能是抑郁癥發(fā)生的重要機(jī)制，這也與Dong Jun等[17]人的研究結(jié)果相符合。通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，NR2B的改變會影響其下游的PI3K/Akt信號通路，參與了大部分的神經(jīng)元死亡事件[18]。PI3K/Akt是近年來在抑郁癥領(lǐng)域研究的重要信號通路，對于該信號通路的調(diào)控可通過抑制神經(jīng)元凋亡從而發(fā)揮抗抑郁作用，如二環(huán)類抗抑郁藥物文法拉辛通過作用于PI3K/Akt通路，可顯著改善大鼠的抑郁行為[19]。本研究結(jié)果中，抑郁癥大鼠海馬中PI3K、p-AKT的mRNA和蛋白表達(dá)較正常大鼠均有不同程度的降低(P<0.05)，提示該條信號通路受到抑制，而這也與其上游NR2B的異常降低相關(guān)。經(jīng)過逍遙散體內(nèi)干預(yù)后，抑郁癥大鼠海馬中NR2B、PI3K、p-AKT的水平均顯著提高(P<0.05)，且谷氨酸水平也出現(xiàn)了明顯降低(P<0.05)，這說明逍遙散可能通過干預(yù)NR2B調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路，從而改善谷氨酸升高引起的興奮性毒性，最終發(fā)揮抗抑郁的作用。

綜上所述，逍遙散可改善抑郁樣行為從而發(fā)揮抗抑郁作用，其機(jī)制可能與活化PI3K/Akt信號通路，進(jìn)一步發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用而實(shí)現(xiàn)的，但關(guān)于該方發(fā)揮主要抗抑郁作用的藥物以及全方的內(nèi)在抗抑郁機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。