SfHMGR在白背飛虱生殖調(diào)控中的功能分析

周 操, 楊熙彬, 龔明富, 楊 洪,3,*, 龍貴云,賈澤艷, 曾慶會, 金道超

(1.重慶師范大學生命科學學院，重慶 401331; 2.貴州大學昆蟲研究所, 貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部貴陽作物有害生物科學觀測試驗站, 貴陽 550025; 3.貴州大學煙草學院, 貴陽 550025)

保幼激素(juvenile hormone, JH)是昆蟲咽側體中合成的一種半萜類化合物，參與調(diào)控昆蟲的發(fā)育、變態(tài)和生殖等過程(Shelbyetal., 2007; Jindraetal., 2013; Royetal., 2018)。JH與保幼激素結合蛋白(juvenile hormone binding protein, JHBP)結合形成復合體，經(jīng)血液循環(huán)運送至特定組織或器官的細胞核后，與其核受體蛋白Met(methoprene-tolerant)結合，形成JH-Met復合體，在JH的作用下，Met再與另外一個bHLH-PAS家族蛋白Taiman(或者稱之為steroid receptor coactivator, SRC)形成二聚體，傳遞保幼激素信號，激活下游的轉(zhuǎn)錄因子Krüpple-homologue 1(Kr-h1)等基因的表達，最終調(diào)控昆蟲的發(fā)育、變態(tài)和生殖等過程(Kayukawaetal., 2017; Royetal., 2018)。

3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)是JH合成途徑中的上游蛋白，催化HMG-CoA還原成甲羥戊酸，再經(jīng)過法尼焦磷酸合成酶催化形成法尼焦磷酸(FPP)(Bellésetal., 2005; 李娟等, 2012)。該過程是JH和膽固醇/固醇類物質(zhì)生物合成共有的反應途徑(Bellésetal., 2005)。迄今為止，已在許多昆蟲物種中鑒定出HMGR同系物，包括華山松大小蠹Dendroctonusarmandi(Yuetal., 2015)、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(Gertleretal., 1988)、家蠶Bombyxmori(Kinjohetal., 2007)、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Wangetal., 2013)、小地老虎Agrotisipsilon(Duportetsetal., 2000)、太平洋折翅蠊Diplopterapunctata(Huangetal., 2015)、桔小實蠅Bactroceradorsalis(Yangetal., 2018)和德國小蠊Blattelagermanica(Martinez-Gonzalezetal., 1993)等。已有研究表明，HMGR參與了昆蟲的激素合成以及生長發(fā)育和繁殖的調(diào)控。例如：沉默桔小實蠅的BdHMGR基因表達后，能夠抑制雌蟲卵巢發(fā)育(Yangetal., 2018)；使用RNAi技術靶向沉默棉鈴蟲HaHMGR基因表達后，顯著抑制了雌蟲的產(chǎn)卵和HaVg基因的表達(Wangetal., 2013)；此外，干擾中華豆芫菁Epicautachinensis成蟲EcHMGR的表達可導致斑蝥素合成的顯著下降，而外源性JH可提高斑蝥素的產(chǎn)量(Lüetal., 2016)。

白背飛虱Sogatellafurcifera屬于典型的r對策的遷飛性害蟲，具有極強的繁殖力，易暴發(fā)成災(金劍雪等, 2017; Yangetal., 2020)，能夠通過若蟲、成蟲刺吸水稻汁液以及傳播南方水稻黑條矮縮病毒，嚴重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)(Zhouetal., 2008; Otuka, 2013; Wuetal., 2017)。目前對于該蟲的防治仍以化學防治為主，但長期大量地使用殺蟲劑致使其對多種殺蟲劑產(chǎn)生了嚴重的抗性(Alietal., 2019; Ruanetal., 2021; 張帥, 2021)。因此，尋找新的作用靶標，開發(fā)新的高效、安全的殺蟲劑對于該蟲的防治具有重要意義。生殖相關基因在昆蟲的繁殖與發(fā)育過程中起著至關重要的作用，本研究基于已公布的白背飛虱基因組(Wangetal., 2017)和轉(zhuǎn)錄組(Zhouetal., 2018)數(shù)據(jù)，鑒定出白背飛虱JH生物合成中的關鍵基因SfHMGR，采用RT-PCR技術對其序列進行驗證，使用RT-qPCR技術測定其時空表達特性，并通過RNAi技術靶向沉默SfHMGR后觀察雌蟲卵巢的發(fā)育情況、統(tǒng)計產(chǎn)卵量，測定JH生物合成下游基因和信號轉(zhuǎn)導相關基因及卵巢發(fā)育關鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平，研究其在白背飛虱生殖中的功能，為白背飛虱的綠色防控提供新的科學依據(jù)和作用靶標。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

白背飛虱種群于2013年采集自貴州省貴陽市花溪區(qū)水稻田(26°31.302″N, 106°62.294″E)，并在實驗室內(nèi)一直以不接觸任何農(nóng)藥的處于分蘗期的TN1水稻飼養(yǎng)至今(周操等, 2016)。飼養(yǎng)室內(nèi)的條件為：溫度25±1℃，相對濕度70%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 總RNA的提取及cDNA第1鏈的合成

收集1.1節(jié)白背飛虱樣品使用Bertin Precellys 24多功能樣品均質(zhì)器(Bertin Technologies，法國)進行研磨后，參照HP Total RNA Kit試劑盒(Omega，美國)說明書提取總RNA(Zhouetal., 2021)。將提取的總RNA參照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa, 日本)說明書合成RT-PCR擴增及RT-qPCR所需cDNA模板(Zhouetal., 2021)。

1.3 SfHMGR基因克隆

基于已發(fā)表的白背飛虱基因組(Wangetal., 2017)和轉(zhuǎn)錄組(Zhouetal., 2018)數(shù)據(jù)，通過查找注釋信息，初步獲得白背飛虱SfHMGR基因序列，并通過在線工具Blast進行相似性比對。經(jīng)進一步確認后，再利用Primer Premier 6.0軟件設計特異性引物(表1)，采用RT-PCR法對其準確性進行驗證。PCR反應體系(25 μL): 2×TSINGKE Master Mix(北京擎科生物科技有限公司，北京)12.5 μL, cDNA模板1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, ddH2O 9.5 mL。PCR擴增條件: 95℃ 3 min; 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 3 min, 共30個循環(huán); 最后72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測合格后，將擴增產(chǎn)物純化后進行TA克隆，并將克隆后的產(chǎn)物送往公司進行測序。

1.4 序列分析

使用ORF Finder(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析SfHMGR基因的ORF及其編碼的氨基酸序列；使用ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)預測編碼蛋白質(zhì)的氨基酸分子組成、相對分子質(zhì)量及等電點等理化性質(zhì)；使用PFAM(http:∥pfam.xfam.org/)預測SfHMGR基因的保守結構域；使用TMHMM(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白的跨膜結構域；使用SignalP-5.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析蛋白的信號肽；借助MEGA 7.0軟件使用鄰接法(neighbor-joining, NJ)構建HMGR的系統(tǒng)發(fā)育樹，重復運行1 000次。

1.5 SfHMGR基因時空表達分析

將初羽化的白背飛虱雌蟲和雄蟲配對后使用玻璃管單獨飼養(yǎng)，每天更換一次水稻苗。飼養(yǎng)過程中分別收集從1齡若蟲到成蟲13個時間點的樣品，分別為1-3齡若蟲、4齡第1-2天若蟲、5齡第1-3天若蟲、羽化后12 h雌成蟲、羽化后1-4 d雌成蟲。每個樣品包含15～30頭白背飛虱。在雌蟲羽化24 h后，在PBS中解剖白背飛虱的頭部(50頭)、腸道(100頭)、脂肪體(50頭)、卵巢(30頭)和體壁(100頭)。所有的樣品均設置3個生物學重復。將收集的樣品分別置于1.5 mL無RNA酶的離心管中，保存于-80℃冰箱中備用。

根據(jù)已驗證的SfHMGR序列設計特異性引物(表1)，采用RT-qPCR法測定SfHMGR基因在白背飛虱不同發(fā)育階段和不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平，以核糖體蛋白L9基因SfRPL9(GenBank登錄號: KM885285)和α微管蛋白基因SfTUB(GenBank登錄號: KP735521)為內(nèi)參基因(Zhouetal., 2020)。RT-qPCR反應體系: 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, iQTMSYBR?Green Supermix 10 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 7 μL。反應條件: 95℃ 2 min; 95℃ 30 s, 50℃ 30 s, 40個循環(huán); 同時在60～95℃進行溶解曲線分析。每個反應設置3次技術重復。

1.6 RNAi實驗

使用特異性引物(表1)通過PCR擴增SfHMGR基因片段，參照TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit試劑盒(Thermo，美國)說明書，以擴增所得的SfHMGR基因片段為模版合成雙鏈RNA(dsRNA)。用NanoDrop 2000核酸濃度分析儀(Thermo，美國)測定dsRNA濃度，并將其稀釋至1 000 ng/μL備用。采用相同的方法合成水母Aequoreavictoria的綠色熒光蛋白基因GFP(GenBank登錄號: CAA58789)的dsRNA。以羽化12 h以內(nèi)的白背飛虱雌成蟲作為供試昆蟲，使用IM-31微型注射器進行顯微注射，每頭試蟲注射0.1 μL，以注射等體積的dsGFP作為陰性對照(Zhouetal., 2021)。每處理設置3個生物學重復，每個重復注射100頭。注射完成后，將試蟲放入裝有新鮮水稻苗的試管中，置于溫度25±1℃、相對濕度70%±5%、光周期16L∶8D的人工氣候箱中飼養(yǎng)。在注射dsRNA 48 h后收集樣品，檢測目的基因的沉默效率。

表1 本研究所用引物

將注射后的1頭雌成蟲與2頭雄成蟲(排除雄蟲對交配的影響)進行配對，每個處理配對15對，設置3個生物學重復。配對飼養(yǎng)的白背飛虱每2 d換一次新鮮水稻，每天觀察一次初孵若蟲數(shù)，10 d后解剖換出的稻苗記錄尚未孵化的卵，直至雌成蟲死亡。統(tǒng)計雌蟲的產(chǎn)卵量，并在雌蟲注射dsRNA 6 d后，解剖并觀察各處理雌蟲個體的卵巢發(fā)育情況，并使用Nikon SMZ25體視顯微鏡進行拍照(Zhouetal., 2020)。同時，為進一步明確SfHMGR基因沉默后對白背飛虱生殖影響的機制，根據(jù)已報道的JH生物合成下游基因SfJHAMT(GenBank登錄號: MW014329)和SfFAMeT(GenBank登錄號: MW014330)、JH信號傳導相關基因SfMet(GenBank登錄號: MN229742)和SfKr-h1(GenBank登錄號: MN229741)以及卵巢發(fā)育關鍵基因SfVg(GenBank登錄號: MN296092)和SfVgR(GenBank登錄號: MN296093)，參考Zhou等(2021)設計RT-qPCR引物序列，使用1.5節(jié)中的反應體系和反應程序，測定其在SfHMGR基因沉默48 h后的轉(zhuǎn)錄水平。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用2-ΔΔCt法計算SfHMGR基因在不同發(fā)育階段和不同組織中的相對表達量，并用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。使用LSD法分析SfHMGR基因的在不同發(fā)育階段和不同組織中表達量的差異顯著性; RNAi相關實驗的差異顯著性采用Student氏獨立樣本t檢驗進行分析。

2 結果

2.1 SfHMGR基因克隆與序列分析

基于白背飛虱基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結合其注釋信息進行查找，并通過RT-PCR技術對其序列進行驗證，最終獲得的序列長度為2 800 bp，并將其命名為SfHMGR(GenBank登錄號: MW883397)。其中包含了一個完整的ORF，長2 724 bp，編碼907個氨基酸。推導的蛋白質(zhì)分子式為C4365H7019N1195O1300S60，預測的分子量為98.96 kD，理論等電點為6.15。保守結構域分析發(fā)現(xiàn)(圖1)，該蛋白含有典型的HMG-CoA還原酶的保守結構域(第466-872位氨基酸)，同時在C端包含3個HMG-CoA結合位點(第647-661, 803-810和857-870位氨基酸)。該蛋白在N端具有7個典型的跨膜結構域，符合典型的動物HMGR蛋白的結構特征。前33個氨基酸為信號肽，第33和34位氨基酸之間為剪切位點。

圖1 白背飛虱SfHMGR基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列

將白背飛虱SfHMGR基因所編碼的氨基酸序列進行BLAST比對分析，結果表明，SfHMGR與另外兩種稻飛虱——灰飛虱Laodelphaxstriatella和褐飛虱Nilaparvatalugens的HMGR具有最高的序列一致性，分別為92.40%和89.25%。系統(tǒng)發(fā)育樹表明(圖2)，白背飛虱SfHMGR氨基酸序列與同為稻飛虱的灰飛虱和褐飛虱的序列聚集在同一個分支上，具有較近的親緣關系，然后再與同為半翅目的溫帶臭蟲Cimexlectularius、茶翅蝽Halyomorphahalys的序列聚集在一起，形成半翅目的一個大分支，再與其他目昆蟲的序列依次聚集在一起。

圖2 鄰接法構建的基于氨基酸序列的白背飛虱SfHMGR與其他昆蟲HMGR的系統(tǒng)進化樹(1 000次重復)

2.2 SfHMGR基因的時空表達模式

SfHMGR在白背飛虱的各個發(fā)育階段均有表達，并且在4齡第2天若蟲以及初羽化(羽化后12 h和1 d)雌成蟲中具有最高的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)，且隨著羽化時間的延長，表達量呈下降趨勢(圖3: A)。SfHMGR在所測定的各個雌成蟲組織中均有一定的轉(zhuǎn)錄水平(圖3: B)，但在腸道中具有最高的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)，在脂肪體和卵巢中的表達量次之。

圖3 白背飛虱SfHMGR在不同發(fā)育階段(A)和雌成蟲不同組織(B)中的表達模式

2.3 SfHMGR基因功能

在注射SfHMGRdsRNA 48 h后SfHMGR的表達水平被顯著抑制(P<0.01)(圖4: A)，相比于對照組(dsGFP處理組)，其轉(zhuǎn)錄水平下降了70%。單雌產(chǎn)卵量顯著降低(P<0.01)，僅為對照組的39.6%(圖4: B)，表明SfHMGR基因的沉默會顯著抑制雌蟲的產(chǎn)卵。在注射SfHMGRdsRNA后6 d時，注射dsGFP處理中能夠清楚地觀察到香蕉形的成熟的卵母細胞，而在dsHMGR處理組中則沒有明顯的香蕉形的成熟卵母細胞出現(xiàn)(圖4: C)，表明沉默SfHMGR基因后能夠顯著影響白背飛虱卵巢的發(fā)育。

圖4 顯微注射dsRNA 48 h后白背飛虱體內(nèi)SfHMGR基因沉默效率(A)、單雌產(chǎn)卵量(B)及雌蟲卵巢發(fā)育(C)

為明確SfHMGR基因沉默后對白背飛虱生殖影響的機制，靶向沉默SfHMGR基因后測定了下游基因和生殖相關基因的轉(zhuǎn)錄水平。結果(圖5)表明，SfHMGR基因作為JH生物合成的上游基因，其轉(zhuǎn)錄水平被抑制后，會顯著抑制JH生物合成下游基因SfJHAMT和SfFAMeT(P<0.05)以及JH信號傳導相關基因SfKr-h1的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.01)；另外，SfHMGR基因的沉默，同樣也能夠顯著抑制SfVg(P<0.01)和SfVgR(P<0.05)的轉(zhuǎn)錄水平。

圖5 沉默白背飛虱SfHMGR后下游基因和生殖相關基因轉(zhuǎn)錄水平

3 討論

在本研究中，基于已公布的白背飛虱基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并結合RT-PCR技術，獲得了白背飛虱JH生物合成過程中的關鍵基因，根據(jù)保守結構域和相似性比對，將其命名為SfHMGR(GenBank登錄號: MW883397)。保守結構域分析發(fā)現(xiàn)，SfHMGR含有典型的HMG-CoA還原酶的保守結構域，同時在C端包含3個HMG-CoA結合位點(圖1)；序列相似性分析也發(fā)現(xiàn)，SfHMGR與同為半翅目的灰飛虱和褐飛虱HMGR氨基酸序列相似性最高。這與麥紅吸漿蟲Sitodiplosismosellana和桔小實蠅中的研究結果(Yangetal., 2018; 劉禹含等, 2019)一致，表明該基因在進化過程中的結構和功能高度保守。

眾所周知，昆蟲的變態(tài)發(fā)育受JH和蛻皮激素的共同調(diào)控(周樹堂等, 2012; 何倩毓等, 2017)。例如，在白蠟蟲Ericeruspela的研究中發(fā)現(xiàn)，JH在幼蟲中期具有最高的滴度，在末期呈現(xiàn)滴度逐漸降低的變化趨勢，出現(xiàn)較低值，這與20E滴度的變化趨勢(劉妮, 2018)恰恰相反。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，SfHMGR基因在白背飛虱的4齡和5齡若蟲中期具有較高的轉(zhuǎn)錄水平，這與先前發(fā)現(xiàn)的JH滴度在發(fā)育階段中期具有最高滴度的結果(劉妮, 2018)一致。在桔小實蠅中也發(fā)現(xiàn)，BdHMGR基因在蛹的發(fā)育中期具有較高的轉(zhuǎn)錄水平(Yangetal., 2018)。但遺憾的是，在本研究中并沒有觀察到蛻皮前SfHMGR基因轉(zhuǎn)錄水平的降低。導致這一結果的原因可能是在取樣過程中，著重關注的是SfHMGR基因在雌成蟲生殖過程中的作用，忽略了其在蛻皮前(4齡第3天若蟲和5齡第4天若蟲)樣品的獲取。在雌成蟲中，SfHMGR基因在其羽化后12 h和1 d時具有最高的轉(zhuǎn)錄水平(圖3: A)，這與先前發(fā)現(xiàn)白背飛虱SfVg轉(zhuǎn)錄水平在雌蟲羽化后呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(Zhouetal., 2020)相呼應。在太平洋折翅蠊雌蟲中也發(fā)現(xiàn)，DpHMGR基因的轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢與DpVg的變化趨勢一致(Huangetal., 2015)；同樣的結果在棉鈴蟲中也有發(fā)現(xiàn)(Wangetal., 2013)。這些研究結果表明，HMGR基因在昆蟲Vg合成及其卵巢發(fā)育過程中具有重要的作用。

HMGR是甲羥戊酸途徑中的關鍵基因，在昆蟲中甲羥戊酸途徑的主要功能是產(chǎn)生JH，單萜信息素和防御性分泌物等物質(zhì)，它們與昆蟲的生長、繁殖、化學交流和防御有關(Halletal., 2002; Hojoetal., 2012; Vranováetal., 2013)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，SfHMGR基因在白背飛虱雌成蟲腸道中具有最高的轉(zhuǎn)錄水平(圖3: B)，這與HMGR基因在黃粉蟲Tenebriomolitor和華山松大小蠹前中腸中高表達的結果(Yuetal., 2015)一致，出現(xiàn)這一結果的原因可能是由于腸道是信息素前體合成的關鍵部位。例如，使用原位雜交技術在耶氏松小蠹Dendroctonusjeffreyi和云杉松齒小蠹Ipspini中的研究發(fā)現(xiàn)，HMGR在前中腸的特化細胞中高度表達，而該細胞是從頭合成單萜類聚集信息素的重要部位(Nardietal., 2002)。另外，SfHMGR基因在脂肪體和卵巢中具有較高的轉(zhuǎn)錄水平，這與BdHMGR在桔小實蠅卵巢和脂肪體中高表達的結果(Yangetal., 2018)一致；同樣，在馬鈴薯甲蟲不同組織中的表達譜分析中也發(fā)現(xiàn)，LdHMGR在卵巢中具有最高的轉(zhuǎn)錄水平(Lietal., 2016)。卵巢是卵子發(fā)育的關鍵器官，而脂肪體是卵黃原蛋白合成的重要組織，SfHMGR在卵巢和脂肪體中均有較高的轉(zhuǎn)錄水平，暗示著SfHMGR在白背飛虱生殖過程中可能同樣具有重要作用。

JH生物合成是調(diào)節(jié)昆蟲發(fā)育、變態(tài)和繁殖的重要過程，主要包括甲羥戊酸合成途徑和異戊二烯分支途徑。HMGR是甲羥戊酸合成途徑中的關鍵酶，直接影響JH的生物合成(嵇保中等, 2007; 劉艷等, 2007)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，HMGR參與了昆蟲的生殖調(diào)控過程(Royetal., 2018)。例如：在桔小實蠅中發(fā)現(xiàn)，BdHMGR的敲除將顯著抑制卵巢的發(fā)育和雌蟲的產(chǎn)卵量。同樣，RNAi介導的棉鈴蟲蛹中HaHMGR基因的靶向沉默，顯著抑制了HaVg基因的轉(zhuǎn)錄水平及其雌蟲的產(chǎn)卵量(Wangetal., 2013)；在太平洋折翅蠊中也有同樣的發(fā)現(xiàn)(Yangetal., 2018)。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，SfHMGR沉默后將顯著抑制白背飛虱雌成蟲的產(chǎn)卵量和卵巢的發(fā)育(圖4)，并且顯著抑制了SfVg基因的轉(zhuǎn)錄水平(圖5)，這與沉默SfHMGR下游的SfJHAMT,SfFAMeT,SfMet和SfKr-h1基因的結果(Huetal., 2019a, 2019b, 2020; Zhouetal., 2021)相似。SfHMGR作為JH生物合成的上游關鍵基因，是否可以通過下游的這些相關基因來調(diào)控白背飛虱的生殖？為了明確這一問題，在靶向沉默SfHMGR基因后測定了這些基因的轉(zhuǎn)錄水平。結果發(fā)現(xiàn)，沉默SfHMGR基因后能夠顯著抑制SfJHAMT,SfFAMeT,SfKr-h1,SfVg和SfVgR基因的轉(zhuǎn)錄水平(圖5)，證明了先前猜測的正確性。另外，在太平洋折翅蠊中發(fā)現(xiàn)，同時沉默HMGR和JHAMT基因后，將顯著抑制JH生物合成下游相關基因的轉(zhuǎn)錄水平，降低JH生物合成的速率，并抑制脂肪體內(nèi)Vg的轉(zhuǎn)錄水平和雌蟲卵巢的發(fā)育(Huangetal., 2015)。在先前的研究中也發(fā)現(xiàn)，SfJHAMT和SfFAMeT基因被同時沉默后能夠顯著抑制卵巢的發(fā)育和雌蟲的產(chǎn)卵量，但是這種抑制作用能夠通過體外注射JH類似物烯蟲酯(methoprene)得到部分緩解(Zhouetal., 2021)。以上這些結果表明，HMGR通過影響JH生物合成過程及其JH的信號傳導來調(diào)控昆蟲體內(nèi)Vg的轉(zhuǎn)錄水平，進而影響昆蟲的卵巢發(fā)育和雌蟲的產(chǎn)卵量。