基于太平洋甲脅虱裂化線粒體基因組推測(cè)甲脅虱屬祖先線粒體核型

孫佳寧, 任天廣 , 陳 婷, 董文鴿,*

(1.大理大學(xué)病原與媒介生物研究所, 云南大理 671000; 2.大理大學(xué)護(hù)理學(xué)院, 云南大理 671000)

節(jié)肢動(dòng)物線粒體基因組是雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，大小約在15～20 kb之間，共有37個(gè)基因，包括22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)基因、13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因(protein-coding genes, PCGs)、2個(gè)核糖體RNA(rRNA)基因和1個(gè)非編碼區(qū)(又稱為控制區(qū)或AT富含區(qū))(Boore, 1999; Sharkey and Chapman, 2017)。吸虱昆蟲(chóng)的線粒體基因組發(fā)生裂化，形成多個(gè)線粒體微環(huán)染色體，這與絕大多數(shù)節(jié)肢動(dòng)物極其保守的單染色體線粒體基因組形成鮮明對(duì)比。迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)7科7屬14種吸虱的線粒體基因組研究發(fā)現(xiàn)節(jié)肢動(dòng)物典型的單染色體線粒體基因組在吸虱亞目(Anoplura)中發(fā)生了劇烈裂化現(xiàn)象，其線粒體微環(huán)染色體的數(shù)量以及每個(gè)線粒體微環(huán)染色體的基因結(jié)構(gòu)和基因排序彼此不同，甚至在同屬中親緣關(guān)系較近的物種間也存在差異(Songetal., 2014)。迄今為止，完成測(cè)定的14種吸虱線粒體基因組都因裂化而由9～20個(gè)線粒體微環(huán)染色體組成，每個(gè)線粒體微環(huán)染色體的大小為1.5～4 kb，有1～8個(gè)基因，且不同種間的裂化速度和裂化程度有很大差異(Shaoetal., 2009, 2012, 2017; Jiangetal., 2013; Dongetal., 2014a, 2014b; Songetal., 2014; Herdetal., 2015; Fuetal., 2020)。這些吸虱線粒體基因在線粒體微環(huán)染色體上的分布有很大差異，即使是同屬的物種，其線粒體基因組裂化模式也各不相同。

太平洋甲脅虱Hoplopleurapacifica隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)昆蟲(chóng)綱(Insecta)虱目(Phthiraptera)吸虱亞目(Anoplura)甲脅虱科(Hoplopleuridae)甲脅虱屬Hoplopleura，是我國(guó)云南黃胸鼠Rattustanezumi體表寄生的優(yōu)勢(shì)虱種(Guoetal., 2003)。甲脅虱屬全世界有136種，是吸虱亞目中物種數(shù)最豐富的一個(gè)屬(Durden and Musser, 1994)，我國(guó)有22種(金大雄, 1999)。迄今為止，甲脅虱屬中只有紅姬甲脅虱Hoplopleuraakanezumi和克氏甲脅虱Hoplopleurakitti的線粒體基因組被測(cè)定(Dongetal., 2014a)，但在這兩種甲脅虱中都未找到完整的37個(gè)基因，在紅姬甲脅虱只找到28個(gè)基因，有9個(gè)基因(nad1,nad3,nad5,trnF,trnG,trnH,trnL1,trnM和trnQ)未找到，而在克氏甲脅虱中只找到34個(gè)基因，有3個(gè)基因(nad5,trnF和trnH)未找到(Dongetal., 2014a)。

為了推測(cè)甲脅虱屬祖先線粒體核型，本研究測(cè)定了太平洋甲脅虱的線粒體基因組，并與迄今為止測(cè)序的另外2種甲脅虱(紅姬甲脅虱和克氏甲脅虱)的線粒體基因組進(jìn)行了比較，推測(cè)甲脅虱屬的祖先線粒體核型，以期進(jìn)一步了解吸虱亞目是如何進(jìn)化的。

1 材料與方法

1.1 太平洋甲脅虱與宿主采集

太平洋甲脅虱采自云南省金平縣黃胸鼠體表，采集地分為室內(nèi)(畜舍和人房)和室外(房周、灌叢、森林和耕地)兩種不同的生境，共采集標(biāo)本13頭(8頭雌成蟲(chóng)，5頭雄成蟲(chóng))，將采集的太平洋甲脅虱標(biāo)本置于盛有95%乙醇的EP小管內(nèi)，并放置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?，太平洋甲脅虱及其宿主黃胸鼠標(biāo)本均保存于大理大學(xué)病原與媒介生物研究所。

1.2 太平洋甲脅虱DNA的提取

將1.1節(jié)采集的標(biāo)本從盛有95%乙醇的EP小管內(nèi)取出，置于S8APO體視顯微鏡下鑒別太平洋甲脅虱種類和性別。太平洋甲脅虱的主要特征在于腹部背面第1列的2根剛毛比第2列的短；除側(cè)背片Ⅱ及側(cè)背片Ⅵ的腹側(cè)后葉突為尖狀外，其余節(jié)Ⅲ～Ⅵ的各后葉突均為葉片狀，后緣具較深的切刻。太平洋甲脅虱種類及性別的鑒定參考金大雄(1999年)編寫(xiě)的《中國(guó)吸虱的分類和檢索》。將采集到的全部13頭太平洋甲脅虱的標(biāo)本用刀片在錫箔紙上切碎并分別放入1.5 mL的EP管中，再用DNeasy Tissue Kit(QIAGEN)試劑盒提取每頭太平洋甲脅虱基因組DNA。

1.3 太平洋甲脅虱線粒體基因組測(cè)序與分析

以1.2節(jié)提取的基因組DNA為模板，參考吸虱亞目昆蟲(chóng)的通用引物(Shaoetal., 2017)(表1)，PCR擴(kuò)增太平洋甲脅虱的線粒體微環(huán)染色體rrnS和rrnL基因的短片段。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL): 正反向引物(20 μmol/L)各0.5 μL, 模板DNA 1 μL, dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2 μL, 10×Ex Taq Buffer(Mg+Plus)2.5 μL, Ex Taq(TaKaRa)0.25 μL, ddH2O 18.25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 1 min; 98℃ 10 s, 45～48℃ 30 s, 72℃ 2～3 min, 30～40個(gè)循環(huán); 72℃ 5 min。將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序，獲得rrnS和rrnL基因的部分序列。在rrnS和rrnL基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)正反向特異性引物(表1)，進(jìn)行Long-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出包含rrnS和rrnL基因的全長(zhǎng)或近乎全長(zhǎng)的大片段目的序列。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：正反向引物(20 μmol/L)各0.5 μL, MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL, dNTPs(各2.5 mmol/L)4 μL, 10×LA PCR BufferⅡ 2.5 μL, LA Taq(TaKaRa)(5 U/μL)0.5 μL, ddH2O 14.5 μL。反應(yīng)條件: 94℃ 1 min; 98℃ 10 s, 45～65℃ 30 s, 68℃ 1～4 min, 30～40個(gè)循環(huán); 72℃ 2～6 min。從rrnS和rrnL基因大片段目的序列中找出保守區(qū)序列后設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物(表1)擴(kuò)增出太平洋甲脅虱全部線粒體微環(huán)染色體，大小為690～1 773 bp，擴(kuò)增出的所有條帶，僅包含太平洋甲脅虱所有線粒體微環(huán)染色體的編碼區(qū)。特異性引物均通過(guò)OligoAnalyzer(https:∥sg.idtdna.com/site/account/login?returnurl=%2Fcalc%2Fanalyzer)網(wǎng)站設(shè)計(jì)。

表1 本研究所用的引物

擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)Wizard SV Gel and PCR Clean-up System(Promega)試劑盒純化后送至美吉生物公司用Illumina HiSeq X Ten Platform進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用Geneious 2020.2.2(Kearseetal., 2012)軟件組裝。tRNA基因用tRNAscan-SE(Lowe and Eddy, 1997)和ARWEN(Laslett and Canb?ck, 2008)查找，蛋白質(zhì)編碼基因和rRNA基因用BLAST(Gish and States, 1993; Altschuletal., 1997)查找。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

將本研究中獲得的太平洋甲脅虱的線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因序列與GenBank中7科7屬14種吸虱和外群象虱Haematomyzuselephantis的線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因序列結(jié)合構(gòu)建吸虱的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，8科8屬16種寄生虱(含外群象虱)共有的7個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因(atp6,atp8,cox1,cox3,nad4,nad6和nad4L)序列通過(guò)Geneious 2020.2.2軟件聯(lián)配后用于系統(tǒng)發(fā)育分析，其余蛋白質(zhì)編碼基因(cob,cox2,nad1,nad2,nad3和nad5)序列并不適用于以上所有物種，因此在我們的分析中排除。蛋白質(zhì)編碼基因序列在TranslatorX(Federicoetal., 2010)在線平臺(tái)(http:∥pc16141.mncn.csic.es/index_v4.html)用MAFFT算法基于氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)(Abascaletal., 2010)。使用IQ-TREE在線平臺(tái)(Nguyenetal., 2015)(http:∥iqtree.cibiv.univie.ac.at/)進(jìn)行最大似然法(maximum likelihood, ML)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建(Stamatakis, 2006)，使用MEGA X軟件構(gòu)建鄰接法(neighbor-joining, NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)節(jié)點(diǎn)支持率由自舉檢驗(yàn)值(bootstrap confidence level, BCL)進(jìn)行評(píng)估，共計(jì)檢測(cè)1 000次。

1.5 甲脅虱屬祖先線粒體核型推斷

用簡(jiǎn)約法(Shaoetal., 2017)，根據(jù)甲脅虱屬的3個(gè)物種太平洋甲脅虱、紅姬甲脅虱和克氏甲脅虱并結(jié)合其他12種吸虱和象虱的線粒體基因組序列推斷甲脅虱屬祖先線粒體核型。我們將線粒體核型特征繪制到基于線粒體基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上，以確定共同特征。我們推測(cè)一個(gè)線粒體微環(huán)染色體的核型特征是甲脅虱屬的祖先特征，必須滿足以下條件：1)其存在于至少1種甲脅虱中并且也存在于1個(gè)或多個(gè)不是甲脅虱屬的吸虱中；或2)在3種甲脅虱中同時(shí)存在。由于tRNA基因在染色體上的移位比蛋白質(zhì)編碼基因和rRNA基因更活躍，因此我們將tRNA基因與rRNA基因和蛋白質(zhì)編碼基因分開(kāi)考慮。若兩個(gè)或多個(gè)線粒體基因組基因排序特征相互沖突，則把變化最少的基因排序特征推測(cè)為祖先特征，而其他基因排序特征則被拒絕。

2 結(jié)果

2.1 太平洋甲脅虱線粒體基因組的結(jié)構(gòu)和基因組成

Illumina HiSeq X Ten Platform高通量測(cè)序獲得太平洋甲脅虱線粒體基因組的優(yōu)質(zhì)序列2 150 795 reads(雙端測(cè)序，序列讀長(zhǎng)250 bp)，組裝后獲得太平洋甲脅虱線粒體基因組，共找到29個(gè)基因，包括11個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因(atp6,atp8,cox1,cox3,nad1,nad2,nad3,nad4,nad4L,nad5和nad6)，16個(gè)tRNA基因以及2個(gè)rRNA基因(rrnL和rrnS)。這29個(gè)基因不均勻地分布于10個(gè)線粒體微環(huán)染色體上(表2和圖1)。每個(gè)線粒體微環(huán)染色體編碼區(qū)有1～5個(gè)基因，編碼區(qū)大小從C-nad6-W-L2的690 bp到H-nad5-F的1 773 bp。太平洋甲脅虱的10個(gè)線粒體微環(huán)染色體中有7個(gè)線粒體微環(huán)染色體具有1個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因或1個(gè)rRNA基因，其余的3個(gè)線粒體微環(huán)染色體各有2個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。16個(gè)tRNA基因分布在10個(gè)線粒體微環(huán)染色體上(nad2線粒體微環(huán)染色體和rrnS線粒體微環(huán)染色體沒(méi)有tRNA基因)，每個(gè)線粒體微環(huán)染色體有1～3個(gè)tRNA基因。太平洋甲脅虱現(xiàn)有的29個(gè)基因，每個(gè)基因僅在一個(gè)線粒體微環(huán)染色體上出現(xiàn)，即不同線粒體微環(huán)染色體之間沒(méi)有相同的基因。相對(duì)于非編碼區(qū)，除了trnQ和nad1基因外，所有基因的轉(zhuǎn)錄方向一致(圖1)。

圖1 太平洋甲脅虱裂化線粒體基因組

表2 太平洋甲脅虱線粒體微環(huán)染色體

2.2 同屬內(nèi)吸虱線粒體線粒體微環(huán)染色體組成差異

太平洋甲脅虱線粒體基因組裂化成10個(gè)線粒體微環(huán)染色體(未找到8個(gè)基因)，在不考慮未找到的基因的情況下，太平洋甲脅虱與克氏甲脅虱有9個(gè)線粒體微環(huán)染色體一樣，這9個(gè)線粒體微環(huán)染色體是：atp8-atp6-N,I-cox1,nad2,K-nad4,C-nad6-W-L2,rrnS,R-nad4L-P-cox3-A,Q-nad1-G-nad3和M-L1-rrnL-V(線粒體微環(huán)染色體用微環(huán)上的基因命名)。太平洋甲脅虱與紅姬甲脅虱只有6個(gè)線粒體微環(huán)染色體一樣，這6個(gè)線粒體微環(huán)染色體是：atp8-atp6-N,I-cox1,nad2,K-nad4,C-nad6-W-L2和rrnS。甲脅虱屬的這3種吸虱差異主要涉及trnT基因。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育

基于7科7屬15種吸虱的7個(gè)線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼基因序列構(gòu)建的ML樹(shù)(圖2)和NJ樹(shù)(圖3)，以象虱亞目(Rhynchophthirina)象虱的作為外群。除象虱外，其余寄生虱均為吸虱亞目。結(jié)果表明兩種方法構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)基本一致。進(jìn)化樹(shù)主要分為兩大支：一個(gè)大的進(jìn)化支包括甲脅虱科、多板虱科(Polyplacidae)、血虱科(Haematopinida)和微胸虱科(Microthoraciidae)，另一個(gè)大的進(jìn)化支包括虱科(Pediculidae)、陰虱科(Pthiridae)和猴虱科(Pedicinidae)。太平洋甲脅虱作為紅姬甲脅虱和克氏甲脅虱的姊妹群，bootstrap為100，紅姬甲脅虱與克氏甲脅虱關(guān)系更相近。甲脅虱科與多板虱科構(gòu)成姊妹群，ML樹(shù)中bootstrap為51，NJ樹(shù)中bootstrap為42。

圖2 最大似然法構(gòu)建的基于線粒體基因組7個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因序列的16種寄生虱的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 甲脅虱屬祖先線粒體核型的推測(cè)

根據(jù)太平洋甲脅虱(本研究)、紅姬甲脅虱和克氏甲脅虱，并結(jié)合其他12種吸虱和象虱的線粒體基因組數(shù)據(jù)推測(cè)甲脅虱屬祖先線粒體核型(圖4)。我們根據(jù)這些吸虱和象虱的線粒體基因組序列推斷出系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并繪制線粒體核型圖，將線粒體核型特征定位于系統(tǒng)發(fā)育圖上，以確定其共有特征(圖5和6)?？赏茰y(cè)出甲脅虱屬祖先線粒體核型由12個(gè)線粒體微環(huán)染色體組成，每個(gè)線粒體微環(huán)染色體由一個(gè)編碼區(qū)和一個(gè)非編碼區(qū)構(gòu)成，編碼區(qū)包含1～6個(gè)基因(圖4)。其中9個(gè)線粒體微環(huán)染色體編碼區(qū)包括1個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因或1個(gè)rRNA基因，其余3個(gè)線粒體微環(huán)染色體編碼區(qū)包括2個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，分別為atp6和atp8、cox3和nad4L以及nad1(nad1與其他基因的轉(zhuǎn)錄方向相反)和nad3。除trnT基因外，其余基因均可推測(cè)出其在祖先線粒體核型中的位置，trnT基因的位置可能在cox2基因的下游或在trnA基因的下游。trnT基因緊靠非編碼區(qū)的可能性較大，且其上游也有存在一小段非編碼區(qū)的可能。截至目前僅3種甲脅虱的線粒體基因組數(shù)據(jù)并不能確定trnT基因在甲脅虱屬祖先線粒體核型中的分布位置和排列方式，因此需要更多甲脅虱屬的物種以更準(zhǔn)確確定trnT基因位置。如果排除tRNA基因，這3種甲脅虱在12個(gè)線粒體微環(huán)染色體中蛋白質(zhì)編碼基因和rRNA基因的分布是相同的(圖1和4)。

圖4 推測(cè)的甲脅虱屬祖先線粒體核型

圖5 基于線粒體基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)推測(cè)的甲脅虱屬祖先線粒體核型(排除tRNA基因)

圖6 基于線粒體基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)推測(cè)的與蛋白質(zhì)編碼基因和rRNA基因相關(guān)的tRNA基因在甲脅虱屬祖先線粒體基因組中的位置

3 討論

本研究對(duì)太平洋甲脅虱線粒體基因組進(jìn)行測(cè)序與分析，共找到29個(gè)基因：16個(gè)tRNA基因，11個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因(atp6,atp8,cox1,cox3,nad1,nad2,nad3,nad4,nad4L,nad5和nad6)，以及2個(gè)rRNA基因(rrnL和rrnS)。29個(gè)基因不均勻地分布于10個(gè)線粒體微環(huán)染色體(表2; 圖1)。每個(gè)線粒體微環(huán)染色體的編碼區(qū)包含1～5個(gè)基因，編碼區(qū)大小在690～1 773 bp之間。有8個(gè)基因(cob,cox2,trnD,trnE,trnS1,trnS2,trnT和trnY)未找到，然而這8個(gè)基因在人虱、豬虱、馬虱、猴虱、黑猩猩虱、微胸虱和多板虱被發(fā)現(xiàn)，太平洋甲脅虱未找到的這8個(gè)基因在同屬的克氏甲脅虱剛好是這2個(gè)線粒體微環(huán)染色體：trnE-cob-trnS1-trnS2環(huán)和trnD-trnY-cox2-trnT環(huán)(Dongetal., 2014b)，這進(jìn)一步說(shuō)明甲脅虱屬至少裂化成12個(gè)線粒體微環(huán)染色體。故推測(cè)以上8個(gè)線粒體基因缺失的可能性較小，未發(fā)現(xiàn)的原因更傾向于引物設(shè)計(jì)不保守造成。太平洋甲脅虱的rrnS基因單獨(dú)存在一個(gè)微環(huán)染色體上，這是目前吸虱亞目中甲脅虱屬吸虱特有現(xiàn)象。

分別將血虱屬Haematopinus(3種)、虱屬Pediculus(3種)、多板虱屬Polyplax(2種)、猴虱屬Pedicinus(2種)和甲脅虱屬(3種)這5屬內(nèi)吸虱線粒體微環(huán)染色體的組成(Jiangetal., 2013; Songetal., 2014)進(jìn)行比較，我們發(fā)現(xiàn)血虱屬的豬血虱Haematopinussuis和野豬血虱Haematopinusapri線粒體微環(huán)染色體組成相同，而與同屬的驢血虱Haematopinusasini線粒體微環(huán)染色體的組成有較大差異，這種差異主要涉及4個(gè)基因：trnR,trnM,nad6和nad4L；虱屬的頭虱Pediculuscapitis和體虱Pediculushumanus線粒體微環(huán)染色體組成相同，但與同屬的黑猩猩虱Pediculusschaeffi線粒體微環(huán)染色體的組成有差異，這種差異主要涉及4個(gè)基因：trnE,trnM,trnN和trnS1(Shaoetal., 2012; Herdetal., 2015)；多板虱屬的棘多板虱Polyplaxspinulosa和亞洲多板虱Polyplaxasiatica線粒體微環(huán)染色體結(jié)構(gòu)組成差異較大，主要涉及8個(gè)基因：trnA,trnF,trnL1,trnL2,trnP,trnS1,trnS2和trnT(Dongetal., 2014b)；猴虱屬的鈍猴虱Pedicinusobtusus和紅疣紅虱Pedicinusbadii線粒體微環(huán)染色體結(jié)構(gòu)組成差異最大，主要涉及11個(gè)基因：trnA,trnC,trnD,trnG,trnI,trnS2,trnV,trnW,nad2,nad3和rrnS(Fuetal., 2020)。由于甲脅虱屬的克氏甲脅虱、紅姬甲脅虱和太平洋甲脅虱均未能獲得線粒體基因組全部基因，在不考慮未找到基因的情況下，甲脅虱屬吸虱線粒體微環(huán)染色體結(jié)構(gòu)組成差異僅表現(xiàn)在trnT基因。由此可以發(fā)現(xiàn)線粒體微環(huán)染色體組成差異體現(xiàn)在tRNA、與NADH脫氫酶亞基相關(guān)的蛋白質(zhì)編碼基因和rRNA基因，其中tRNA位置變化最為活躍，每屬之間線粒體微環(huán)染色體的組成差異均涉及tRNA。

結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育推測(cè)甲脅虱屬祖先線粒體核型(圖5和6)，甲脅虱屬祖先線粒體核型由12個(gè)線粒體微環(huán)染色體組成，每個(gè)線粒體微環(huán)染色體的編碼區(qū)由1～6個(gè)基因構(gòu)成(圖4)?？梢源_定大部分基因的位置，trnT基因的位置目前不能確定，其可能在cox2或者trnA基因的下游位置，但可確定trnT基因在非編碼區(qū)上游。將Fu等(2020)推測(cè)的宿主為靈長(zhǎng)類動(dòng)物吸虱的祖先線粒體核型(只能確定蛋白質(zhì)編碼基因和rRNA基因位置)與甲脅虱屬祖先線粒體核型對(duì)比發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)編碼基因和rRNA基因在線粒體微環(huán)染色體中的位置完全一致。而Shao等(2017)推測(cè)的吸虱祖先線粒體核型，只有nad6基因的位置不同，吸虱祖先線粒體核型nad6與cox2基因在同一個(gè)線粒體微環(huán)染色體中，而另外兩個(gè)祖先線粒體核型的nad6基因均單獨(dú)在一個(gè)線粒體微環(huán)染色體中。由此可見(jiàn)在即使裂化線粒體基因組中，蛋白質(zhì)編碼基因和rRNA基因的位置也很穩(wěn)定，tRNA基因流動(dòng)性很強(qiáng)。

這些寄生虱的線粒體核型，即線粒體微環(huán)染色體的數(shù)量、以及每個(gè)線粒體微環(huán)染色體的基因組成和基因排列彼此不同，甚至在同屬中親緣關(guān)系較近的物種之間也不相同，這與大多數(shù)動(dòng)物及其保守的單染色體線粒體基因組形成鮮明對(duì)比。本研究基于7科7屬15種吸虱的蛋白質(zhì)編碼基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)強(qiáng)烈支持吸虱亞目分為兩大進(jìn)化支，這與Light等(2010)根據(jù)18S rRNA，EF-1α和cox1基因推測(cè)49種吸虱的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系基本一致。在線粒體核型上的共有特征用簡(jiǎn)約法構(gòu)建甲脅虱屬的祖先線粒體核型。我們推測(cè)甲脅虱屬的祖先線粒體核型特征時(shí)，若兩個(gè)或多個(gè)線粒體基因組基因排序特征相互沖突，則把變化最少的基因排序特征推測(cè)為祖先特征，而其他基因排序特征則被拒絕。我們根據(jù)這些吸虱和象虱的線粒體基因組序列推斷出系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并繪制線粒體核型圖，將線粒體核型特征定位于系統(tǒng)發(fā)育圖上，以確定其共有特征(圖5和6)。吸虱中2種人虱(頭虱和體虱)、黑猩猩虱和嚙齒動(dòng)物體表寄生的5種吸虱(太平洋甲脅虱、紅姬甲脅虱、克氏甲脅虱、棘多板虱和亞洲多板虱)譜系中多次發(fā)生線粒體微環(huán)染色體的裂化，而2種豬虱(野豬虱和豬虱)和馬虱(驢血虱)譜系中線粒體微環(huán)染色體發(fā)生合并(Shaoetal., 2009, 2012, 2017; Jiangetal., 2013; Dongetal., 2014a, 2014b; Songetal., 2014; Herdetal., 2015)。線粒體微環(huán)染色體的裂化和合并共同創(chuàng)建了一個(gè)非常復(fù)雜動(dòng)態(tài)的線粒體基因組結(jié)構(gòu)。