五爪金龍兩種化感作用途徑釋放的化學(xué)成分分析及其效應(yīng)研究

陳金慧，馬慧燕，陳煜，何禾*

（1.海南大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，海南 ?？?570228；2.海南大學(xué)林學(xué)院，海南 海口5 70228；3.海南省農(nóng)林環(huán)境過程與生態(tài)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228）

外來植物入侵嚴(yán)重威脅全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)系統(tǒng)的完整性，給生態(tài)環(huán)境造成了巨大破壞［1］。一直以來關(guān)于外來植物入侵機(jī)制的研究從未停止，外來植物能在到達(dá)新環(huán)境后強(qiáng)烈抑制本地植物甚至形成群落單一優(yōu)勢種的原因仍是生態(tài)學(xué)的難題之一［2］。新武器假說（new weapons hypothesis）認(rèn)為，外來植物通過釋放化學(xué)物質(zhì)抑制本地植物的生長發(fā)育，從而增強(qiáng)在新生境的競爭能力，導(dǎo)致其成功入侵［3］。外來入侵植物通過淋溶、揮發(fā)、根系分泌及枯落物腐解等途徑向環(huán)境中釋放化學(xué)物質(zhì)并對其他植物產(chǎn)生直接或間接有害作用的過程被稱為化感作用［4］，且不同物種釋放的化感物質(zhì)不同。研究發(fā)現(xiàn)薇甘菊（Mikania micrantha）分泌的阿魏酸、豆甾醇、α-香樹酯醇達(dá)到一定濃度后能抑制蘿卜（Raphanus sativus）及水稻（Oryza sativa）等幼苗的根長和苗高。硬脂酸甲酯和棕櫚酸甲酯是南美蟛蜞菊（Sphagneticola trilobata）產(chǎn)生的最主要化感物質(zhì)，對玉米（Zea mays）、黃瓜（Cucumissativus）的胚根及胚芽生長產(chǎn)生明顯抑制［5-6］。深入了解某種外來植物的入侵機(jī)制，除關(guān)注其釋放化感物質(zhì)的種類外，還側(cè)重于比較不同途徑釋放化感物質(zhì)的差異，如勝紅薊（Ageratum conyzoides）和馬纓丹（Lantana camara）以揮發(fā)釋放為主［7-8］，而根系分泌則是鳳眼蓮（Halerpestes cymbalaria）化感物質(zhì)釋放的最主要渠道［9］，He等［10］已證明雨霧淋溶與枯落物分解才是尾葉桉（Eucalyptus urophylla）不可忽視的化感物質(zhì)釋放途徑。由此可見，明確外來植物通過不同途徑釋放的化感物質(zhì)種類及其各自的作用效果是深入了解其入侵機(jī)制的前提。

五爪金龍（Ipomoea cairica）為旋花科番薯屬多年生纏繞草質(zhì)藤本植物，作為廣泛分布于我國華南地區(qū)的入侵性外來植物，它給當(dāng)?shù)刈匀簧鷳B(tài)系統(tǒng)帶來了嚴(yán)重危害，也造成了巨大的社會經(jīng)濟(jì)損失［11］。為進(jìn)一步防控五爪金龍擴(kuò)散，其入侵能力與化感作用的關(guān)系已成為眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)。雖已有試驗(yàn)表明，五爪金龍浸提液對蘿卜、白菜（Brassica pekinensis）、芥菜（Brassica juncea）、生菜（Lactuca sativa）、水稻等多種作物種子萌發(fā)和幼苗生長具有明顯的抑制作用，且隨著濃度的增大，抑制作用增強(qiáng)［12-18］，但針對以淋溶水為代表的淋溶途徑與以揮發(fā)物為代表的揮發(fā)途徑釋放的化感物質(zhì)及其效應(yīng)研究鮮見報道。

為明確不同釋放途徑在五爪金龍化感效應(yīng)中所起的作用，并探討通過不同途徑釋放的主要化感物質(zhì)效果的差異，本研究首先通過模擬自然條件下五爪金龍揮發(fā)和淋溶兩種途徑的作用，比較兩者對受體植物萌發(fā)影響的差異。再采用頂空固相微萃取和樹脂洗脫法分別收集枝葉揮發(fā)物與淋溶水，以代表兩種途徑釋放的化合物，并經(jīng)氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀分離鑒定各自成分。接著根據(jù)定量得出兩種途徑釋放化合物中最主要成分的實(shí)際濃度，采用種子萌發(fā)法，評價不同物質(zhì)對受體種子萌發(fā)的影響。以鑒別不同途徑釋放的化感物質(zhì)具體成分，并探討不同化感物質(zhì)特別是某些關(guān)鍵化合物對五爪金龍化感作用貢獻(xiàn)的差異，從而通過五爪金龍對三葉鬼針草（Bidenspilosa）和生菜種子萌發(fā)的影響加深認(rèn)知化感作用與五爪金龍入侵過程的聯(lián)系，為治理其入侵危害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本試驗(yàn)選取生菜和三葉鬼針草作為受體植物，前者因發(fā)芽整齊且發(fā)芽率高，常被作為受體植物使用［19］，后者則是南方常見與五爪金龍伴生的雜草之一。五爪金龍采自?？谑薪紵o人管理的拋荒區(qū)域，該區(qū)域以五爪金龍為單優(yōu)物種，受體植物三葉鬼針草種子采自海南大學(xué)海甸校區(qū)校園內(nèi)。生菜種子購于江西省豐城種業(yè)有限公司。選取大小均一，飽滿度高的受體種子置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 淋溶水化學(xué)成分分析

為更好地了解在自然條件下通過雨霧淋溶途徑釋放化感物質(zhì)的情況，本研究參照Song等［20］的方法，在?？谑薪紵o人管理的拋荒區(qū)域選取以五爪金龍為單優(yōu)物種的樣地，于葉片下方隨機(jī)設(shè)置大小為1 m×1 m×0.3 m的PTFE采樣盒，緊鄰樣地外的空地上放置同樣大小采樣盒作為對照，盒內(nèi)容納水量與樣地所在區(qū)域降水量相當(dāng)。2016年10月-2017年1月期間每隔1～3 d或在暴雨后測定收集的淋溶液體積，并于每兩周將盒中收集的淋溶水取回實(shí)驗(yàn)室，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。整個試驗(yàn)期間共收集野外淋溶水358.26 L，取回的淋溶水先分別經(jīng)濾紙及水相濾膜（PALL，USA）過濾。層析柱內(nèi)裝填活化后的XAD-4樹脂（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA），后將浸提液以150 mL·h-1的流速通過層析柱，再用10倍柱體積量的1∶1∶2∶1石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水混合液對樹脂進(jìn)行洗脫，得到的洗脫液經(jīng)0.45μm PTFE膜（Pall，USA）過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Eyela，JPN）上濃縮蒸干。加入二氯甲烷溶解蒸干后的殘留物質(zhì)，并將溶液轉(zhuǎn)移至試管。在殘余干物質(zhì)中加入500μL乙腈和500μL衍生化試劑（99%BSTFA+1%TMCS），70℃下反應(yīng)1 h。待溶液冷卻后經(jīng)0.45μm的PTFE膜過濾后裝入樣品瓶，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS，Agilent7890B-5975C）對五爪金龍淋溶水成分進(jìn)行分離與鑒定。色譜條件：彈性石英毛細(xì)管柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）；進(jìn)樣量1μL；不分流；進(jìn)樣口溫度250℃；升溫程序從50℃開始，以8℃·min-1的速度升溫到70℃，保持2 min，然后以5℃·min-1的速度升溫到90℃，保持3 min，最后以8℃·min-1的速度升溫到220℃；載氣（He）流速為1 mL·min-1；離子源為EI源；電離電壓為70 eV；離子源溫度為230℃；質(zhì)量掃描范圍為50～550 amu。

1.3 揮發(fā)物化學(xué)成分分析

為更好模擬野外條件下葉片揮發(fā)情況，根據(jù)野外調(diào)查已知本區(qū)域五爪金龍群落葉片密度7.5 kg·m-3，故稱取7.5 g五爪金龍葉片置于1000 mL錐形瓶中，用封口膜將瓶口密封，將裝有65μm PDMS/DVB萃取頭的SPME裝置插入錐形瓶于室溫下進(jìn)行吸附，整個過程持續(xù)30 min。每個樣品吸附3次，重復(fù)上述過程3次。每次萃取后將萃取頭置于250℃的GC進(jìn)樣口中熱處理3 min以除去表面殘留。另取同體積空白玻璃瓶作為對照，進(jìn)行相同操作。

采樣結(jié)束后，將SPME采樣針插入GC-MS進(jìn)樣口解析5 min，對五爪金龍葉片揮發(fā)物進(jìn)行分離與鑒定。除分流比5∶1以及柱升溫程序變?yōu)槌跏紲囟?0℃，以8℃·min-1的速度升溫到160℃，保持2 min，之后以5℃·min-1的速度升溫到240℃，其余檢測條件與淋溶水樣品測定相同。

1.4 模擬揮發(fā)與淋溶途徑作用的生物測定

30粒生菜或三葉鬼針草種子均勻放置在鋪有2層定性濾紙的密封瓶（3.5 cm×3.5 cm×12.5 cm）中，每個瓶中分別加入僅經(jīng)過濾的野外采集淋溶水及對照組雨水4 mL，每處理設(shè)置5個重復(fù)。將培養(yǎng)瓶置于人工氣候箱中，以相對濕度70%，溫度為25℃，光照12 h，黑暗12 h培養(yǎng)。試驗(yàn)開始后每隔24 h觀察一次，并適當(dāng)添加水分保持盒內(nèi)濕潤，以胚根突破種皮視為萌發(fā)，每日記錄發(fā)芽種子數(shù)量。

按照1.3中葉片與容器體積比，在15 L的密封培養(yǎng)盒底部放置新鮮五爪金龍葉片600 g，對照培養(yǎng)盒底部不放任何東西。將不加蓋的培養(yǎng)皿放在培養(yǎng)盒中部的隔板上，并在培養(yǎng)皿底部鋪兩層經(jīng)適量蒸餾水潤濕后的濾紙，每皿放30粒受體植物種子。用封口膜纏繞瓶口保證密封徹底，每處理設(shè)置5個重復(fù)。放置于相對濕度為70%，溫度為25℃的人工氣候箱中，每日光照12 h，黑暗12 h。試驗(yàn)開始后每隔24 h觀察1次，以胚根突破種皮視為萌發(fā)，每日記錄發(fā)芽種子的數(shù)量。培養(yǎng)皿中定時補(bǔ)充蒸餾水保濕。6 d后統(tǒng)計發(fā)芽率和發(fā)芽速率。

1.5 主要成分的生物測定

采用標(biāo)準(zhǔn)品對1.2結(jié)果中相對含量超過5%的待測物質(zhì)進(jìn)行外標(biāo)定量，再根據(jù)野外條件下收集的淋溶液總體積，得到其實(shí)際濃度。待測物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品溶于適量蒸餾水中，得到與其實(shí)際濃度一致的化感物質(zhì)溶液。將4 mL化感物質(zhì)溶液滴入鋪有2層定性濾紙的瓶（3.5 cm×3.5 cm×12.5 cm）中，30粒生菜或三葉鬼針草種子均勻放置，將培養(yǎng)瓶置于人工氣候箱中，以相對濕度為70%，溫度為25℃，光照12 h，黑暗12 h培養(yǎng)，每種處理設(shè)置5個重復(fù)。試驗(yàn)開始后每隔24 h觀察1次，并適當(dāng)添加化感物質(zhì)溶液保持盒內(nèi)濕潤，以胚根突破種皮視為萌發(fā)，每日記錄發(fā)芽種子數(shù)量。

采用標(biāo)準(zhǔn)品對1.3結(jié)果中相對含量超過5%的待測物質(zhì)進(jìn)行外標(biāo)定量，再根據(jù)收集氣態(tài)化合物容器總體積計算其實(shí)際釋放濃度。根據(jù)其實(shí)際濃度進(jìn)行生物測定，先將30粒生菜或三葉鬼針草種子均勻放置在鋪有2層定性濾紙的瓶（3.5 cm×3.5 cm×12.5 cm）中，添加4 mL蒸餾水，濾紙中間放置一個敞口的PTFE小盒，盒中滴入適量待測物質(zhì)純品后迅速將瓶蓋蓋嚴(yán)，使物質(zhì)均勻散開，最終瓶內(nèi)物質(zhì)揮發(fā)后的濃度與實(shí)際釋放濃度一致。瓶口用封口膜纏繞以保證培養(yǎng)瓶密封徹底，每處理設(shè)置5個重復(fù)。放置于相對濕度70%，溫度為25℃的人工氣候箱中，每日光照12 h，黑暗12 h。試驗(yàn)開始后每隔24 h觀察一次，以胚根突破種皮視為萌發(fā)，每日記錄發(fā)芽種子的數(shù)量。培養(yǎng)皿中定時補(bǔ)充蒸餾水保濕。6 d后統(tǒng)計發(fā)芽率和發(fā)芽速率。

1.6 數(shù)據(jù)分析

發(fā)芽率（%）=最終發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

以修改后的Timson指數(shù)（T）表征發(fā)芽速率［21］：，第t天發(fā)芽率；t，第t天），Timson指數(shù)越大，發(fā)芽速率越快。

由Agilent chemstation軟件分析GC-MS數(shù)據(jù)，通過儀器自帶的NIST 2013標(biāo)準(zhǔn)譜庫對物質(zhì)進(jìn)行初步定性，再應(yīng)用科瓦茨保留指數(shù)（Kovats’retention index，RI）輔助定性。在前兩種方法基礎(chǔ)上，部分物質(zhì)還采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性。采用峰面積計算得出物質(zhì)相對含量。采用外標(biāo)法對氣態(tài)樣品及液體進(jìn)樣進(jìn)行定量，將標(biāo)準(zhǔn)品制成不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在與樣品相同的條件下檢測，形成不同物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在此基礎(chǔ)上對樣品中物質(zhì)進(jìn)行定量。

所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，重復(fù)測量方差分析和顯著性檢驗(yàn)；采用Sigmaplot 10.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 淋溶與揮發(fā)途徑的生物測定

圖1所示為第6天發(fā)芽率，結(jié)果表明五爪金龍枝葉淋溶水顯著抑制了兩受體植物種子發(fā)芽率，其處理組三葉鬼針草和生菜種子發(fā)芽率分別為55.6%和82.2%，比對照組分別降低31.4%和14.0%；五爪金龍葉片揮發(fā)物處理后的三葉鬼針草和生菜種子發(fā)芽率分別為33.3%和70.0%，比對照組降低了59.2%和25.8%，兩者都受到了顯著抑制作用。

圖1 五爪金龍淋溶水（A）和揮發(fā)物（B）對三葉鬼針草和生菜種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of rain leachates and volatiles from I.cairica on the germination percentage of the seeds of B.pilosa and L.sativa

五爪金龍枝葉淋溶水和葉片揮發(fā)物總體延緩兩種受體植物種子的發(fā)芽速率。經(jīng)淋溶水處理后三葉鬼針草種子發(fā)芽速率從第3天開始極顯著降低，生菜種子則從第2天開始極顯著降低（P<0.01），經(jīng)揮發(fā)物處理后，三葉鬼針草和生菜種子發(fā)芽速率分別從第2天和第1天開始極顯著降低（P<0.01）。無論對照組還是處理組，兩種受體植物發(fā)芽速率均隨天數(shù)的增加而不斷增大且同一處理下生菜發(fā)芽速率高于三葉鬼針草（圖2）。

圖2 五爪金龍淋溶水（A、B）和揮發(fā)物（C、D）對三葉鬼針草種子（A、C）和生菜種子（B、D）發(fā)芽速率的影響Fig.2 Effects of r ain leachates（A，B）and volatiles（C，D）fr om I.cairica on germination r ate of the seeds of B.pilosa（A，C）and L.sativa（B，D）

2.2 淋溶水與揮發(fā)物成分分析

五爪金龍枝葉淋溶水的檢出成分總含量達(dá)99.95%（表1），其中酸類占比84.48%。酸類成分中肉桂酸的相對含量最高，達(dá)39.21%，此外，酸類成分還包括琥珀酸（15.15%），丙酸（11.12%），月桂酸（9.38%）等9種；淋溶水混合物中共檢出4種酯類，相對含量占3.28%，以苯甲酸2-甲基苯基酯（1.67%）為代表；烷烴類共有6種，相對含量為8.98%；淋溶水中還檢測出醇類、酚類和烯類物質(zhì)各1種。五爪金龍枝葉淋溶水中相對含量較高的4種檢出成分（肉桂酸，琥珀酸，丙酸，月桂酸）的絕對濃度分別為378.59，263.17，175.62和166.73μg·L-1。

表1 五爪金龍淋溶水成分分析Table 1 Chemicals compounds of the r ain leachates from I.cairica

五爪金龍葉片揮發(fā)物中共分離鑒定出18種萜烯類化合物（表2），總相對含量達(dá)96.12%，其中石竹烯（28.17%），β-羅勒烯（16.59%），α-蒎烯（13.65%）和β-柏木烯（9.43%）的相對含量較高，其絕對濃度分別為3.62，1.86，1.77和1.20μg·L-1。其余含量大于1%的物質(zhì)有11種，包括大根香葉烯（4.63%），α-古巴烯（3.08%）等。

表2 五爪金龍揮發(fā)物成分分析Table 2 Chemicals of the volatiles from I.cairica leaves

2.3 淋溶水主要成分生物測定

與對照組相比，經(jīng)肉桂酸和月桂酸處理后的三葉鬼針草和生菜種子發(fā)芽率顯著降低（P<0.05）且肉桂酸和月桂酸對兩種受體植物種子發(fā)芽率的抑制作用無明顯差異，但丙酸和琥珀酸處理組則未對受體植物種子發(fā)芽率產(chǎn)生明顯影響。肉桂酸處理組三葉鬼針草和生菜種子發(fā)芽率分別為46.7%和83.3%，較對照組降低了43.9%和15.3%，月桂酸處理組三葉鬼針草和生菜種子發(fā)芽率則分別為47.8%和84.4%，較對照組降低了41.5%和14.3%（圖3）。

圖3 五爪金龍淋溶水4種主要成分對三葉鬼針草和生菜種子發(fā)芽率的影響Fig.3 Effects of main components of rain leachates fr om I.cairica on the ger mination rate of B.pilosa and L.sativa seeds

如表3所示，肉桂酸、丙酸、月桂酸總體抑制三葉鬼針草種子發(fā)芽速率，琥珀酸在第4和5天對三葉鬼針草發(fā)芽速率有促進(jìn)作用。肉桂酸、丙酸、月桂酸3個處理組的三葉鬼針草種子發(fā)芽速率在第3天開始顯著低于對照組（P<0.05），肉桂酸和月桂酸處理對發(fā)芽速率的抑制作用無顯著差異且均明顯強(qiáng)于丙酸；琥珀酸處理組則在第4和5天發(fā)芽速率顯著高于對照組（P<0.05）。肉桂酸和月桂酸處理組第1天即開始顯著抑制生菜種子發(fā)芽速率（P<0.05），且抑制作用無明顯差異，琥珀酸和丙酸對生菜種子發(fā)芽速率作用不明顯。不同處理組兩種受體植物發(fā)芽速率均隨天數(shù)增加而不斷上升。

表3 五爪金龍淋溶水主要成分對三葉鬼針草和生菜種子Timson指數(shù)的影響Table 3 Effects of main components of r ain leachates from I.cairica on Timson index of the seeds of B.pilosa and L.sativa

2.4 揮發(fā)物主要成分生物測定

4種通過揮發(fā)途徑釋放的成分對兩種受體植物種子第6天發(fā)芽率的影響不同。生菜發(fā)芽率無顯著變化，三葉鬼針草經(jīng)β-柏木烯和石竹烯處理后發(fā)芽率分別為53.3%和46.7%，較對照組顯著降低，另外兩種物質(zhì)α-蒎烯和β-羅勒烯對三葉鬼針草發(fā)芽率則無顯著影響（圖4）。

圖4 五爪金龍揮發(fā)物主要成分對三葉鬼針草和生菜種子發(fā)芽率的影響Fig.4 Effects of main components of volatiles from I.cairica on the germination rate of B.pilosa and L.sativa seeds

α-蒎烯和β-羅勒烯對三葉鬼針草和生菜發(fā)芽速率無顯著影響，β-柏木烯和石竹烯前中期顯著降低生菜發(fā)芽速率，自第3天開始顯著降低三葉鬼針草發(fā)芽速率，二者的抑制作用無顯著差異。不同處理組兩受體植物發(fā)芽速率均隨天數(shù)增加而不斷上升（表4）。

表4 五爪金龍揮發(fā)物主要成分對三葉鬼針草和生菜種子Timson指數(shù)的影響Table 4 Effects of main components of volatiles fr om I.cairica on Timson index of the seeds of B.pilosa and L.sativa

3 討論

3.1 兩種化感物質(zhì)釋放途徑作用效果

外來植物入侵機(jī)制是生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)，越來越多的研究表明，產(chǎn)生化感物質(zhì)作為“新武器”抑制本地植物生長發(fā)育促進(jìn)了外來植物形成群落單一優(yōu)勢種［1］，而揮發(fā)與淋溶是外來植物不可忽視的釋放化感物質(zhì)重要途徑［22-23］。許多試驗(yàn)通過浸提液模擬自然淋 溶，如 李 澳 然 等［24］發(fā) 現(xiàn) 意 大 利 蒼 耳（Xanthium strumarium）根、莖、葉和果實(shí)的水浸提液均極顯著降低了油葵（Helianthus annuus）種子的萌發(fā)指數(shù)。關(guān)于植物揮發(fā)物的研究發(fā)現(xiàn)高等植物可通過莖、葉、花等地上部向外界釋放揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)而影響其他植物生長發(fā)育，如土荊芥（Dysphania ambrosioides）揮發(fā)物具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，使得蠶豆（Vicia faba），花生（Arachis hypogaea），蕎麥（Fagopyrum esculentum）等多種作物保衛(wèi)細(xì)胞產(chǎn)生核固縮、核降解、核錯位等現(xiàn)象并危害作物的生長發(fā)育［25］；勝紅薊莖葉揮發(fā)物對稗草（Echinochloa crusgalli），黑麥草（Lolium perenne）和三葉鬼針草的根長、苗高和鮮質(zhì)量均有抑制作用［26］。本研究結(jié)果表明五爪金龍揮發(fā)和淋溶兩種作用途徑可顯著抑制受體植物種子萌發(fā)，這與前人對外來入侵植物淋溶和揮發(fā)兩種化感作用途徑的研究具有一致性。

許多植物通過多種作用途徑發(fā)揮化感作用，如黃花蒿（Artemisia annua）通過揮發(fā)和地上部淋溶共同作用向外界釋放化感物質(zhì)［27］，節(jié)裂角茴香（Hypecoum leptocarpum）通過地上部揮發(fā)和土壤殘體分解對黃瓜、蘿卜、油菜（Brassica campetris）、小麥（Triticum aestivum）種子萌發(fā)和幼苗根長產(chǎn)生抑制作用［28］；但不同植物可能有不同的主要化感作用途徑，如勝紅薊和馬纓丹以揮發(fā)作為化感物質(zhì)進(jìn)入周圍環(huán)境的主要途徑［7-8］，窿 緣 桉（Eucalyptus exsert）和 尾 葉 桉（Eucalyptusurophylla）葉片中水溶性的化感物質(zhì)通過淋溶途徑產(chǎn)生較強(qiáng)的化感作用［3］，造成此種差異的原因可能有兩方面，一方面是植物自身產(chǎn)生的主要化感物質(zhì)不同，其釋放途徑不同，有研究結(jié)果表明具有較強(qiáng)化感活性的酚酸類物質(zhì)進(jìn)入環(huán)境的主要方式之一是雨霧淋溶［29］，而萜類物質(zhì)在高等植物中多以揮發(fā)物形式存在［30］；另一方面是所處環(huán)境不同，植物釋放化感物質(zhì)途徑也不同，研究發(fā)現(xiàn)豚草（Ambrosia artemisiifolia）在降水較多時以淋溶為主要化感作用途徑，在干旱高溫條件下則主要通過揮發(fā)向周圍環(huán)境釋放化感物質(zhì)［31］。通過對五爪金龍的研究可發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)和淋溶兩種途徑都能抑制受體植物的生長發(fā)育，在自然界這兩種途徑可共同作用，這與黃花蒿具有一致性，但不同化感作用途徑的效果和影響程度以及它們之間相互關(guān)系仍需進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

3.2 不同類型化感物質(zhì)效應(yīng)的差異

Rice［4］將高等植物化感物質(zhì)分為含氮化合物類、萜類、酚類、聚合物類和香豆素類等，其中酚酸類和萜類化合物較為常見［23］。有學(xué)者指出酚酸類物質(zhì)能改變細(xì)胞膜的透性，影響細(xì)胞對養(yǎng)分和水分的吸收［32-33］，還能通過影響關(guān)鍵酶類，干預(yù)光合作用等抑制種子萌發(fā)和幼苗生長，例如咖啡酸、綠原酸和兒茶酚能通過抑制磷酸化酶進(jìn)而抑制種子萌發(fā)［34］；苜蓿（Medicago sativa）幼苗的根莖長在酚酸作用下會變短小［35］；大豆（Glycine max）種子萌發(fā)，葉綠素積累，幼苗根莖長及鮮干重都受酚酸不同程度地抑制［36］。肉桂酸作為一類典型酚酸類物質(zhì)，其單一施用會對生菜幼苗根莖長等生長指標(biāo)產(chǎn)生明顯的抑制作用，高濃度溶液會使根尖細(xì)胞失去活力［37］，肉桂酸的施用還會降低西瓜（Citrulluslanatus）細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）活性［38］，目前關(guān)于月桂酸化感作用的研究報道很少，本研究結(jié)果表明其對三葉鬼針草和生菜種子萌發(fā)有明顯的抑制作用。本研究在淋溶水中檢測出較多以肉桂酸和月桂酸為代表的酚酸類物質(zhì)，其對三葉鬼針草和生菜種子萌發(fā)有明顯的抑制作用，與前人研究結(jié)果一致。

已有研究證明倍半萜是一類具有很強(qiáng)化感作用的萜類物質(zhì)［39］，南美蟛蜞菊中分離出的倍半萜內(nèi)酯可影響花生種子酶活性，降低其呼吸速率［30］，并對蘿卜、番茄（Lycopersicon esculentum）等作物幼苗生長具有抑制作用［40］，張曉芳［41］發(fā)現(xiàn)β-石竹烯對苘麻（Abutilon theophrasti）根長的抑制率可達(dá)30.6%；目前對β-柏木烯化感作用的相關(guān)研究較少，本研究結(jié)果表明其對受體植物有明顯抑制作用。五爪金龍揮發(fā)物能顯著抑制三葉鬼針草和生菜種子萌發(fā)，其中起顯著抑制作用的物質(zhì)是倍半萜類物質(zhì)β-柏木烯和石竹烯，可能是因?yàn)槠淠軐?xì)胞膜功能和代謝過程產(chǎn)生影響，進(jìn)而對受體植物起作用。

自然界中一種植物能合成多種化學(xué)物質(zhì)，這些物質(zhì)通過拮抗、加和、協(xié)同等方式共同發(fā)揮作用［39］。多種萜類物質(zhì)共同施用對稗草的抑制率高于單種萜類物質(zhì)施用［42］；酚酸類物質(zhì)中，肉桂酸和苯甲酸共同施用對大豆種子的發(fā)芽率、胚根伸長率和胚根干重的抑制作用強(qiáng)于單一物質(zhì)施用［43］；此外肉桂酸和香草酸［41］，β-石竹烯和香芹烯等也具有協(xié)同作用［44］。五爪金龍通過不同途徑產(chǎn)生的不同萜類物質(zhì)和酚酸類物質(zhì)是否存在上述的各種共同作用方式，有待進(jìn)一步研究。

3.3 化感作用模擬的準(zhǔn)確性

適當(dāng)選擇生物測定指標(biāo)是評價化感作用的關(guān)鍵因素。種子萌發(fā)對物種天然更新十分重要［45］，其變化會影響受體植物在群落中的多度及競爭力［46］，因此選取發(fā)芽率作為評價植物化感作用敏感性指標(biāo)［47］是化感作用生物測定的主要方法之一。此外發(fā)芽速率的降低會嚴(yán)重影響該植物在生態(tài)系統(tǒng)中的競爭能力［46］，僅以發(fā)芽率為測定指標(biāo)并不能很好地應(yīng)對種子延遲發(fā)芽的狀況［48］，故本研究將發(fā)芽速率作為衡量化感作用強(qiáng)弱的另一指標(biāo)，結(jié)果與前人研究具有一致性［46］，五爪金龍兩種作用途徑對兩種受體植物發(fā)芽率和發(fā)芽速率均有抑制作用。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)不同外來植物的化感作用對受體具有選擇性［49］。前人研究發(fā)現(xiàn)外來入侵植物加拿大一枝黃花（Solidago canadensis）根部浸提液能顯著抑制雞眼草（Kummerow ia striata）種子萌發(fā)，但對蘿卜、生菜種子萌發(fā)的影響不顯著［50］；薇甘菊水浸液對黃瓜幼苗的生長有明顯抑制作用，對菜心（Brassica rapavar.chinensis）幼苗則有促進(jìn)作用［41］。五爪金龍通過揮發(fā)釋放的物質(zhì)對兩種受體植物的萌發(fā)影響不同，葉片通過揮發(fā)途徑對三葉鬼針草發(fā)芽率的抑制作用強(qiáng)于生菜，推測此現(xiàn)象與萜類物質(zhì)受體選擇性有關(guān)；五爪金龍淋溶水對生菜種子發(fā)芽率的抑制作用弱于三葉鬼針草，可推測酚酸類物質(zhì)對受體植物也具有選擇性。五爪金龍釋放的不同類型的化感物質(zhì)對受體植物作用的強(qiáng)弱可反映其對受體植物強(qiáng)烈的選擇性。

供體植物和受體植物生長期不同，化感作用效果不同。研究表明，加拿大蓬（Conyza canadensis）在主莖旺盛生長時期對白菜、蘿卜等種子萌發(fā)和幼苗生長的化感作用強(qiáng)于其他時期，其水浸液對玉米不同生長發(fā)育時期的化感作用強(qiáng)弱排列順序?yàn)椋河酌缙?吐絲期>灌漿期>成熟期>種子［51］；萌發(fā)階段刺蒼耳（Xanthium spinosum）水浸液對小白菜（Brassica chinensis）、萵苣（Lactuca sativa）、黑麥草的抑制作用在刺蒼耳幼苗時期最強(qiáng)［52］。本試驗(yàn)選取五爪金龍作為供體植物，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其對兩種受體植物種子萌發(fā)均有明顯的抑制作用，五爪金龍?jiān)诓煌L時期的化感作用是否不同有待進(jìn)一步研究證明。

研究表明，植物化感作用具有濃度效應(yīng)，即隨著化感物質(zhì)濃度增加，化感作用強(qiáng)度不斷增加［7］。外來植物自然條件下產(chǎn)生化感物質(zhì)的濃度與實(shí)驗(yàn)室設(shè)置的濃度不同，因而化感作用可能也不同，這一點(diǎn)可能導(dǎo)致研究結(jié)果與真實(shí)情況產(chǎn)生偏差。本試驗(yàn)收集了自然狀態(tài)下五爪金龍的淋溶水和揮發(fā)物，且后期采用五爪金龍淋溶水和揮發(fā)物中具體物質(zhì)絕對濃度進(jìn)行生物測定，試驗(yàn)結(jié)果能較好模擬自然條件下五爪金龍對生菜和三葉鬼針草的化感作用，此外，還能初步確定化感作用較強(qiáng)的具體物質(zhì)。據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可推測在自然界中，五爪金龍通過雨霧淋溶會攜帶酚酸類等化感物質(zhì)進(jìn)入環(huán)境，同時其葉片產(chǎn)生的萜類氣態(tài)揮發(fā)物不僅會直接作用于本地植物，也會經(jīng)雨水溶解進(jìn)入土壤二次影響本地植物的生長和發(fā)育。五爪金龍能產(chǎn)生石竹烯等萜類和肉桂酸等酚酸類化感物質(zhì)，這可能是其抑制海南本地植物生長發(fā)育的重要原因。這與前人發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum）產(chǎn)生萜類揮發(fā)物抑制杉木（Cunninghamia lanceolata）種子發(fā)芽，加拿大蓬產(chǎn)生酚酸類物質(zhì)抑制萵苣種子萌發(fā)和幼苗生長［53-54］等研究一致。因此在五爪金龍防治過程中不僅要對其進(jìn)行殺滅，還要注意殘體移除，避免化感物質(zhì)以揮發(fā)或雨水沖洗再次影響其他植物。現(xiàn)有的試驗(yàn)還無法確定其他化感作用途徑的效果，也無法判斷其他入侵機(jī)制在其成功占領(lǐng)新生境中的影響程度，以及這些化感物質(zhì)中具體起作用的成分仍都有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步證明。

4 結(jié)論

五爪金龍揮發(fā)與淋溶兩種作用途徑可明顯降低三葉鬼針草和生菜種子的發(fā)芽率，總體延緩兩種受體植物發(fā)芽速率。通過對兩種作用途徑產(chǎn)生的化感物質(zhì)進(jìn)行定性與定量研究發(fā)現(xiàn)，五爪金龍淋溶水中的優(yōu)勢成分是肉桂酸、丙酸、琥珀酸和月桂酸，其中肉桂酸和月桂酸對兩種受體植物發(fā)芽率與發(fā)芽速率的抑制作用更明顯，所以這兩種物質(zhì)是五爪金龍通過淋溶釋放的主要化感物質(zhì)；作為五爪金龍揮發(fā)物主要成分，α-蒎烯、β-羅勒烯、β-柏木烯和石竹烯中，β-柏木烯和石竹烯能顯著降低三葉鬼針草發(fā)芽率，且對兩種受體植物發(fā)芽速率有延緩作用，但α-蒎烯，β-羅勒烯對其無明顯影響，可見與其他成分相比，β-柏木烯和石竹烯是五爪金龍揮發(fā)途徑的主要作用物質(zhì)。