紫花苜蓿葉片和根系膜脂過氧化及C、N特征對水分和N添加的響應(yīng)

白婕，臧真鳳，劉叢，昝看卓，龍明秀，王可珍，屈洋，何樹斌*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，陜西 咸陽 712100；2.寶雞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，陜西 岐山 722400）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是一種多年生豆科牧草，具有營養(yǎng)價值高、產(chǎn)量高、固氮肥田等特點［1］。紫花苜蓿的高產(chǎn)對水分的需求較為旺盛，在干旱半干旱地區(qū)，水分是制約紫花苜蓿生產(chǎn)的重要因素之一［2］。干旱脅迫下，紫花苜蓿細胞膜脂過氧化，丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量升高［3］，凈光合速率降低［4］、生物量減少［5］、營養(yǎng)價值降低［6］、碳（carbon，C）、氮（nitrogen，N）代謝受到抑制［7］；與此同時，紫花苜蓿調(diào)整根冠比［8］，啟動滲透調(diào)節(jié)和抗氧化機制［3］等，增強其在干旱脅迫下的適應(yīng)能力。然而，N肥管理是一項提高植物抗逆能力的重要措施［9］。研究表明，一定濃度外源N肥的投入能夠緩解干旱脅迫［5］和鹽脅迫［10-11］對紫花苜蓿的不利影響，可提高其在逆境脅迫下的生產(chǎn)能力。增加土壤中無機N的有效性調(diào)節(jié)了豆科植物的N營養(yǎng)，優(yōu)化生物固N與無機N吸收的兼容性，是促進其在逆境脅迫下生長能力的重要機制之一［12］。

根系是紫花苜蓿儲存營養(yǎng)物質(zhì)［13］，感知土壤水分匱缺和營養(yǎng)物質(zhì)有效性的重要器官，在適應(yīng)干旱脅迫的過程中發(fā)揮著重要作用［14］。由于根系在研究中取樣較為困難，對多年生飼草根系的研究還相對不足。紫花苜蓿根系是否受干旱脅迫的影響［5，8］，目前也沒有較為一致的研究結(jié)論。此外，葉片和根系分別處于地上和地下不同環(huán)境，其物理、化學(xué)屬性及時間和空間上資源獲取策略也存在差異［15］。紫花苜蓿葉片和根系膜脂過氧化程度及C、N狀態(tài)響應(yīng)水分脅迫和外源N的添加是否具有較為一致的規(guī)律，目前也鮮有報道。因此，本研究以紫花苜蓿為研究對象，研究紫花苜蓿葉片和根系細胞膜完整性、C、N含量、C/N、穩(wěn)定性同位素C（δ13C）和穩(wěn)定性同位素N（δ15N）對不同水分和外源N添加的響應(yīng)規(guī)律，以期為全面掌握紫花苜蓿各器官對水分和外源N添加的響應(yīng)策略，為我國旱作農(nóng)業(yè)區(qū)制定精準的紫花苜蓿水肥管理制度提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用紫花苜蓿金皇后（M.sativacv.Golden Empress）為供試品種，種子來自寧夏綠地草業(yè)科技有限公司。飽滿均一的紫花苜蓿種子經(jīng)95%酒精滅菌5 min，經(jīng)蒸餾水漂洗干凈后，置于墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中并在4℃的培養(yǎng)箱萌發(fā)7 d。選擇生長均一且健康的幼苗移栽到裝有土壤的花盆中（14 cm×16 cm×22 cm），每盆定苗一株。土壤取自農(nóng)田土壤耕作層，在裝盆之前，過2 mm篩以去除石塊及雜質(zhì)。土壤養(yǎng)分如下：全C 13.5 g·kg-1，總N 1.26 g·kg-1，全磷0.8 g·kg-1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2018年3-7月在西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院溫室內(nèi)進行。試驗設(shè)土壤水分處理和外源N添加兩個因素。土壤水分處理設(shè)水分脅迫處理（water stress，WS）（35%±5%）田間持水量（field water capacity，F(xiàn)WC）和充分灌溉且未漬水（well-watered，WW）（70%±5%）FWC兩個梯度［16］，每個水分處理下設(shè)置3個不同濃度的N添加梯度［17］：0、5和10 mmol·L-1（Nn、Nm和Nh）。移栽49 d后采用稱重法每隔2 d控制不同水分梯度下的土壤含水量，同時以尿素（CH4N2O）為原料（含N量為46%）進行外源N的添加。每處理15盆植物，共計90盆紫花苜蓿。

1.3 測定指標及方法

處理28 d后將各處理清洗干凈的紫花苜蓿帶回實驗室。一部分樣品，用吸水紙擦干凈后先于105℃的烘箱中殺青10 min后，在80℃的烘箱內(nèi)烘干24 h至恒重，并用研缽等將干燥的葉片和根磨成粉末，保存在低溫冰箱中待測C、N營養(yǎng)物質(zhì)和穩(wěn)定性同位素δ13C和δ15N；另一部分樣品用液N固定后迅速保存在-80℃超低溫冰箱中用于MDA的測定。參照李合生［18］的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）比色法測定MDA含量。有機碳用重鉻酸鉀外加熱法測定［19］。全氮在待測樣品經(jīng)H2SO4-H2O2消煮后，用AA 3連續(xù)流動分析儀測定［20］。C、N同位素（δ13C和δ15N）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所分析測試中心采用ATC-185穩(wěn)定性同位素質(zhì)譜儀測定［21］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行整理，使用SPSS 25.0進行雙因素方差分析（two-way ANOVA），并使用Origin 2021繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分和外源N添加對紫花苜蓿葉片和根系中MDA含量的影響

總體來看，水分和N添加對紫花苜蓿葉片MDA有顯著影響（P<0.01），但對根系MDA的影響不顯著（P>0.05）（圖1）。在Nn和Nm處理下，水分脅迫顯著提高了葉片MDA的含量（P<0.05），但在Nh處理下差異不顯著（P>0.05）。而在根系中，在Nn和Nm處理下，MDA對水分的響應(yīng)規(guī)律與葉片相反。與Nn相比，Nm和Nh有提高紫花苜蓿葉片和根系MDA含量的趨勢，但差異不顯著（P>0.05）。

圖1 水分和外源N添加對葉片和根系中MDA含量的影響Fig.1 MDA content in leaves and r oots subjected to water and exogenous nitr ogen addition

2.2 水分和外源N添加對紫花苜蓿葉片和根系C、N含量及C/N的影響

各處理下，葉片N含量在30～35 mg·g-1之間波動，根系N含量在15～20 mg·g-1之間波動，葉片N含量明顯高于根系（圖2）。水分對紫花苜蓿葉片和根系的C含量沒有顯著影響。相比水分對紫花苜蓿葉片和根系N含量的影響，外源N添加對紫花苜蓿葉片和根系N的影響更為顯著。在WS處理下，與Nn和Nm相比，Nh顯著提高了紫花苜蓿根系N含量（P<0.05）。在WW處理下，Nh處理顯著提高了葉片N含量（P<0.05），但在WS處理下差異不顯著（P>0.05）。根系N含量對水分和外源N添加的響應(yīng)與葉片相反。在相同外源N添加下，WS處理顯著提高了根系N含量（P<0.05）。水分對葉片的C/N影響差異不顯著，但是WS處理明顯降低了根系的C/N，特別是在Nn和Nh處理下差異顯著（P<0.05）。在WS處理下，與Nn和Nh相比，Nm處理顯著提高了根系C/N（P<0.05）。

圖2 水分和外源N添加對葉片和根系C、N含量及C/N的影響Fig.2 Carbon，nitrogen content and C/N in leaves and roots subjected to water and exogenous nitrogen addition

2.3 水分和外源N添加對紫花苜蓿葉片和根系δ13C和δ15N的影響

如圖3所示，紫花苜蓿葉片和根系的δ13C分別在-31～-29與-28～-25之間波動，δ15N均在-1～-4之間波動。在WW和WS處理下，隨著外源N的添加，紫花苜蓿葉片和根系δ15N均顯著降低（P<0.05）。在WW處理下，外源N添加顯著增加了根系和葉片δ13C，但在WS處理下無顯著影響。在相同的氮添加水平下，WS提高了葉片δ15N（P<0.05）、葉片δ13C（P>0.05）和根系δ13C（P<0.05），但卻降低了根系δ15N（P>0.05）。

圖3 水分和外源N添加對葉片和根系δ13C和δ15N的影響Fig.3 δ13C andδ15N in leaves and roots subjected to water and exogenous nitrogen addition

3 討論與結(jié)論

丙二醛是逆境脅迫下細胞膜多不飽和脂肪酸分解的產(chǎn)物，其含量的高低代表植物受到傷害程度的大?。?2］。本研究中水分脅迫下紫花苜蓿葉片膜脂過氧化，丙二醛含量增加，這與他人對紫花苜蓿的研究結(jié)果一致［3，23］。N是影響和調(diào)解植物抗逆性的重要環(huán)境因子［9］。研究表明，一定濃度的外源N投入能夠緩解鹽脅迫和干旱脅迫對紫花苜蓿生長的影響［5，11］，提高其生產(chǎn)能力。然而，本研究中外源N的施入并沒有緩解紫花苜蓿葉片和根系中膜脂過氧化的程度，這意味著N素對紫花苜蓿逆境脅迫的緩解作用受脅迫程度、物種抗逆性、植物生長階段及N肥種類等的影響［11］。

本研究中水分脅迫和外源N的添加并沒有顯著影響紫花苜蓿葉片C含量，這可能與供試品種的抗旱能力有一定關(guān)系。此外，紫花苜蓿根系內(nèi)儲存大量的碳水化合物，這些營養(yǎng)物質(zhì)可通過韌皮部轉(zhuǎn)移到其他器官，調(diào)整了葉片中光合產(chǎn)物的降解和轉(zhuǎn)運等［24］。值得注意的是，本研究中外源N的添加提高了水分脅迫下紫花苜蓿根系的C含量。這可能有兩方面的原因：首先，在逆境脅迫或營養(yǎng)匱乏時一定濃度外源N的添加增加了紫花苜蓿根系蔗糖的含量，優(yōu)化了根系形態(tài)并提高了根系營養(yǎng)物質(zhì)的獲取能力［5］。其次，外源N的添加在一定程度上抑制了紫花苜蓿的生物固氮能力，降低了根瘤形態(tài)建成及生物固氮對光合產(chǎn)物C的消耗，故更多的光合產(chǎn)物C被轉(zhuǎn)運到紫花苜蓿根系［25］。紫花苜蓿葉片天冬酰胺N代謝酶活性對水分脅迫是較為敏感的［7］，紫花苜蓿葉片的N代謝也易受到水分脅迫的抑制。然而，本研究中水分脅迫沒有改變紫花苜蓿葉片N含量，但增加了紫花苜蓿根系的N含量。這是因為根系首先接收到來自水分脅迫的信號，繼而啟動一系列抗旱響應(yīng)機制，例如調(diào)整了營養(yǎng)物質(zhì)的分配策略等［26］，根系會優(yōu)先成為N庫，谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸和色氨酸等含量隨之增加，從而提高了根系細胞維持細胞水分的能力［7］。與預(yù)期相反的是，水分脅迫下并沒有降低紫花苜蓿葉片N的濃度，但增加了在水分充足條件下紫花苜蓿葉片氮的濃度。這說明此時紫花苜蓿生物固氮和礦化N之間達到了平衡［27］。外源N的添加增加了紫花苜蓿N的積累這個觀點是有局限性的，受到水分狀態(tài)、植物器官［5］及生長年齡等的影響［28］。外源N的添加可緩解根瘤受到的來自水分脅迫的傷害，并促進了脯氨酸、抗氧化酶類物質(zhì)等的合成［29］。這是本研究中高濃度N的添加提高水分脅迫下紫花苜蓿根系N含量的潛在原因。然而，N的添加并沒有改變水分充足情況下根系N的含量，這說明苜蓿根系N的積累受到源庫關(guān)系的影響［17，30］，且水分狀態(tài)能夠調(diào)整紫花苜蓿N的吸收和轉(zhuǎn)運策略對外源N添加的響應(yīng)。

植物器官的結(jié)構(gòu)功能和生理特征的差異，是影響其計量學(xué)特征的重要原因［31］。本研究中紫花苜蓿根系C/N較葉片更高，且對水分和外源N添加更為敏感。水分是調(diào)控植物C/N的另外一個重要因素。但在本研究中水分脅迫沒有改變?nèi)~片的C/N，降低了紫花苜蓿根系C/N。這可能是由于水分脅迫下植物分解貯藏碳水化合物，并通過木質(zhì)部向根系轉(zhuǎn)運［32］，用于合成脂類增強其根系在逆境脅迫下獲取限制性資源的能力［33］。研究表明，干旱脅迫下一定濃度外源N的添加增加了紫花苜蓿根系氨基酸的合成，提高了紫花苜蓿根系的C/N［5］，本研究結(jié)果與此是一致的。此外，本研究中水分脅迫下外源N的添加對根系C/N計量比的影響比在充分供水情況下更為敏感，這與其他的一些研究結(jié)果是一致的［34］。然而，植物的C/N對環(huán)境因子的響應(yīng)受植物的生長階段、碳氮同化策略［35］、營養(yǎng)物質(zhì)添加速率和季節(jié)［32］及多年生牧草年齡和茬次等因素的影響［36］。因此，進一步的研究應(yīng)深入闡明紫花苜蓿C/N對水、N添加的響應(yīng)策略，為紫花苜蓿草地的水肥管理策略提供理論依據(jù)。

植物不同器官具有同位素分餾效益［37］、光合C同化的途徑及其轉(zhuǎn)運策略［38］、含N量不同等特點［39］，故植物葉片和根系δ13C和δ15N存在明顯的差異。本研究中水分脅迫下植物分解貯藏在葉片中的能量物質(zhì)，通過木質(zhì)部向根系轉(zhuǎn)運了更多的C［32］，這可能是水分脅迫下紫花苜蓿根系δ13C增加的潛在原因。本研究中充分供水條件下葉片的δ15N較水分脅迫更低，這是因為隨著水分的改善，N被移動作為了植物能夠吸收到的主要N，所以植物δ15N降低［40］。有關(guān)水分脅迫降低了同一外源N添加水平下的根系δ15N，而且隨著外源氮水平的增加根系δ15N降低，這可能是水分脅迫降低了土壤氮的有效性，限制了生物固氮功能［41］。但這個結(jié)果與另外一些增加外源N的有效性，增強了土壤N的轉(zhuǎn)化速率，導(dǎo)致葉片積累更多的δ15N的結(jié)果是相反的［35，42］。然而，植物N同位素的變化受到土壤硝化、植物吸收特性（如時間和吸收類型）和菌根侵染率等的影響［30］。根據(jù)紫花苜蓿C、N同位素響應(yīng)水肥的變化規(guī)律應(yīng)進一步關(guān)注共生微生物如根瘤菌和菌根真菌對其的調(diào)控。

總之，水分脅迫加劇了供試紫花苜蓿葉片膜脂過氧化，但根系細胞膜對水分脅迫和N添加表現(xiàn)出了較強的穩(wěn)定性，且外源N并沒有緩解水分脅迫下紫花苜蓿膜脂過氧化的程度。紫花苜蓿葉片C、N含量對水分和外源N添加的響應(yīng)也較為保守，但外源N的添加增加了根系中C、N含量，且增加程度受土壤水分的調(diào)節(jié)。紫花苜蓿因根系和葉片結(jié)構(gòu)功能和生理特征的差異，根系C/N較葉片更高，根系δ13C明顯高于葉片，根系各參數(shù)較葉片對水分和外源N添加更為敏感。