日糧精料水平和蛋氨酸鉻添加對(duì)灘羊瘤胃發(fā)酵特性、細(xì)菌和脂肪酸組成的影響

金亞東，趙海霞，桂瑞麒，馬青，周玉香*

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002）

共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是亞油酸的同分異構(gòu)體，是一類含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸（亞油酸）異構(gòu)體混合物。常見的CLA為C18：2 cis-9 trans-11和C18：2 trans-10 cis-12，其中C18：2 cis-9 trans-11在所有共軛亞油酸中的比例最高，達(dá)87%左右［1］。共軛亞油酸作為一種新興的營(yíng)養(yǎng)素，具有抗癌、預(yù)防心血管疾病和糖尿病等作用。與其他動(dòng)物產(chǎn)品相比，反芻動(dòng)物產(chǎn)品（肉和奶）中CLA含量較高［2］。CLA在反芻動(dòng)物體內(nèi)的合成主要通過兩個(gè)途徑，一是在瘤胃生物加氫化過程中作為C18：2n6和C18：3n3氫化的中間體產(chǎn)生，二是組織內(nèi)的反式異油酸（trans vaccenic acid，TVA，trans-11 C18：1）在硬脂酰輔酶A去飽和酶（stearyl coenzyme A dehydrogenase-1，SCD）的作用下合成c9t11CLA，這是內(nèi)源合成CLA的重要機(jī)制。研究表明，CLA內(nèi)源途徑合成主要與瘤胃內(nèi)的TVA含量有關(guān)。此外，暫無報(bào)道顯示組織內(nèi)的C18：2 trans-10 cis-12合成與SCD酶之間存在相互關(guān)系，但組織內(nèi)和奶中C18：2 trans-10 cis-12的合成與瘤胃中C18：2 trans-10之間存在一定的聯(lián)系。溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）和蛋白溶解梭菌（Butyrivibrio proteoclasticus）是參與瘤胃內(nèi)C18不飽和脂肪酸氫化的主要細(xì)菌，此外其他細(xì)菌如白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）、黃色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）以及埃式巨型球菌（Megasphaera elsdenii）等也在瘤胃不飽和脂肪酸的氫化過程中起一定的作用［3-4］。

研究表明，放牧或飼喂低精料日糧的羊只的肌肉中含有較高的CLA［5-6］。此外，大量的體外研究也表明，高精料日糧或者低瘤胃pH對(duì)發(fā)酵液中CLA和TVA的濃度，以及相關(guān)氫化細(xì)菌生長(zhǎng)具有一定的抑制［3-4］。而關(guān)于體內(nèi)試驗(yàn)條件下，日糧精料水平對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)CLA和TVA，以及相關(guān)氫化細(xì)菌生長(zhǎng)的影響的研究報(bào)道則較少。Wang等［7］和Xu等［8］的研究表明，當(dāng)羊只日糧精料水平高于60%時(shí)會(huì)對(duì)羊只胃腸道健康產(chǎn)生一定的威脅。過高的精料水平會(huì)引起瘤胃pH降低，對(duì)瘤胃內(nèi)相關(guān)微生物的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生不利影響［9-10］，最終導(dǎo)致組織內(nèi)CLA含量的降低。鉻是人和動(dòng)物所必需的微量元素，與其他價(jià)態(tài)的鉻相比，三價(jià)態(tài)鉻的安全性及穩(wěn)定性相對(duì)較高，并且與無機(jī)鉻相比，有機(jī)鉻的吸收利用效率更高。蛋氨酸鉻（chromium methionine，Cr-Met）作為有機(jī)鉻的一種，由于其與蛋氨酸螯合，可借助蛋氨酸鉻的吸收途徑進(jìn)入機(jī)體，因此其吸收效率高于其他有機(jī)鉻。在單胃動(dòng)物上的研究也表明，日糧鉻的添加對(duì)提高動(dòng)物機(jī)體組織CLA的含量具有積極的作用［11］。之前的研究表明，動(dòng)物的小腸是鉻的主要吸收部位，其在瘤胃內(nèi)的吸收效率極低［12-13］。這意味著鉻的添加可能并不會(huì)對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。因此，日糧鉻添加對(duì)反芻動(dòng)物，尤其是瘤胃方面的研究鮮有報(bào)道。然而，Dallago等［14］的研究表明，添加0.375 mg·d-1（按元素含量計(jì)）的鉻顯著降低羔羊瘤胃內(nèi)原蟲的數(shù)量，而0.250和0.500 mg·d-1的添加量對(duì)瘤胃原蟲的數(shù)量則沒有顯著影響。這表明，即使鉻在瘤胃內(nèi)的吸收效率極低，但適量的Cr添加也有可能影響到反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)相關(guān)微生物的活動(dòng)。并且相關(guān)報(bào)道表明，鉻可作為CLA合成過程中的催化劑，增加CLA的合成效率［15-16］。據(jù)此，本研究以低精料（low concentrate，LC）日糧為對(duì)照組，選擇精料水平低于60%的日糧作為試驗(yàn)組日糧，觀察其對(duì)灘羊瘤胃發(fā)酵特性，瘤胃脂肪酸組成和相關(guān)氫化細(xì)菌的DNA豐度是否有不利影響，并且在高精料（high-concentrate，HC）日糧中添加Cr-Met，觀察其對(duì)以上指標(biāo)是否有積極的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2019年6-9月在寧夏回族自治區(qū)吳忠市寧鑫生態(tài)牧場(chǎng)進(jìn)行。選取體重相近［（21.00±1.23）kg］、健康狀況良好的5月齡灘羊公羔40只，隨機(jī)分配到4個(gè)試驗(yàn)組，每組10只。LC組飼喂精粗比為35∶65的全混合飼糧，日糧中不添加Cr-Met；HC組飼喂精粗比為55∶45的全混合飼糧，日糧中不添加Cr-Met；HCM組和HCH組均飼喂精粗比為55∶45的全混合飼糧，Cr-Met的添加量分別為0.75和1.50 g·d-1·只-1。試驗(yàn)周期80 d，預(yù)飼期15 d，正試期65 d。參考《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 816-2004）［17］配制飼糧，試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)開始前對(duì)圈舍進(jìn)行消毒，對(duì)所有羊只進(jìn)行體內(nèi)和體外驅(qū)蟲，并按照牧場(chǎng)相關(guān)防疫程序?qū)ρ蛑蛔⑸湟呙?。每日飼喂兩次?7：00和17：00）全混合飼糧，自由飲水。Cr-Met由金寶（中國(guó)）動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)科技有限公司饋贈(zèng)（鉻≥1000 mg·kg-1，純度99%，蛋氨酸含量≥0.9%），并以膠囊的形式于每日晨飼前單獨(dú)口服投喂。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrition levels of diet（DM basis）

1.2 瘤胃液采集與前處理

試驗(yàn)第65天在每組選擇5只平均體重相近的羊只，晨飼后3 h利用瘤胃液采集器（科立博，武漢，中國(guó)）通過口腔采集瘤胃液（約50 mL）。在每次樣品采集前和結(jié)束后用溫水（約39.0℃）對(duì)采集器內(nèi)部和外部進(jìn)行清洗，并棄去最開始采集到的瘤胃液。在每份瘤胃液中取1.8 mL，用無菌無酶的2 mL凍存管進(jìn)行分裝，并用液氮速凍，隨后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存，備測(cè)相關(guān)細(xì)菌的DNA豐度。在樣品收集結(jié)束后立即用便攜式瘤胃p H計(jì)檢測(cè)瘤胃液p H值。隨后，用潔凈無菌的4層紗布對(duì)剩余的瘤胃液過濾，將過濾后的液體分為4份：取5 mL濾液與1 mL 250 g·L-1（W/V）偏磷酸混合均勻，-20℃保存，備測(cè)瘤胃揮發(fā)性脂肪酸。另取5 mL瘤胃液加入1 mL 20 g·L-1（W/V）H2SO4混合均勻，-20℃保存，備測(cè)瘤胃氨態(tài)氮（ammoniacal nitrogen，NH3-N）濃度。第3份約5 mL，-20℃保存，備測(cè)瘤胃微生物蛋白（microbial protein，MCP）含量。剩余瘤胃液-20℃保存，備測(cè)瘤胃脂肪酸組成。

1.3 樣品檢測(cè)方法

1.3.1 MCP、NH3-N和VFA的檢測(cè) 參照王加啟［18］的方法，用分光光度計(jì)檢測(cè)瘤胃NH3-N濃度。利用氣相色譜儀（安捷倫，GC7890，美國(guó)）檢測(cè)瘤胃脂肪酸，具體步驟參照王加啟［18］和武曉東［19］的方法。MCP用考馬斯亮藍(lán)比色法進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟參照Makkar等［20］的方法。

1.3.2 瘤胃相關(guān)細(xì)菌定量分析 用糞便基因組提取試劑盒（DP328）對(duì)瘤胃液樣品中的總基因組DNA進(jìn)行提取，具體方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。樣品DNA提取成功后，用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)總DNA的濃度和純度（OD260/280和OD260/230），用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA的質(zhì)量。然后將總DNA于-20℃冰箱中保存，直到進(jìn)行熒光定量PCR分析。以瘤胃內(nèi)總菌（general bacteria，GB）DNA作為內(nèi)參基因，利用相對(duì)定量法對(duì)選擇的細(xì)菌進(jìn)行定量，具體計(jì)算公式如下：目標(biāo)菌(總菌16SrDNA含量，%)=2-(目標(biāo)菌CT值-瘤胃總菌CT值)。

待測(cè)細(xì)菌引物參照Fuentes等［4］，Gudla等［3］和Stevenson等［21］設(shè)計(jì)，具體信息見表2，引物由上海生工合成。用BIO-RAD熒光定量PCR儀（CFX Connect，美國(guó)）和CFX Manager軟件對(duì)ButyrivibrioSA、ButyrivibrioVA、R.albus、R.flavefaciens、B.proteoclasticus、Anaerovibrio lipolytica和M.elsdenii的DNA豐度進(jìn)行熒光定量PCR分析，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為25μL，包括12.5μL的SYBR?Green Master Mix（YEASEN，中國(guó)），1μL的PCR正向引物（10μmol），1μL的PCR反向引物（10μmol），1μL DNA模板和9.5μL的dd H2O。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸20 s，在延伸期收集熒光信號(hào)。全部樣品檢測(cè)均設(shè)置一個(gè)去離子水代替模板的陰性對(duì)照。

表2 熒光定量PCR引物Table 2 Pr imer s used for real-time PCR quantification

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件中的one-way ANOVA方法對(duì)4個(gè)試驗(yàn)組以及HC和LC組的各指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性分析；用GLM程序中的不相關(guān)比較法（orthogonal contrast）對(duì)高精料條件下各指標(biāo)隨Cr-Met添加水平增加的線性（linear，L）和二次函數(shù)（quadratic，Q）變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P<0.05作為判斷差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧精料水平和Cr-Met添加對(duì)灘羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表3可知，HC、HCM和HCH組灘羊瘤胃液p H值均顯著低于LC組，HC、HCH組乙酸/丙酸也均顯著低于LC組（P<0.05）；與LC組相比，HC組灘羊瘤胃MCP、丙酸和戊酸濃度顯著升高（P<0.05）。高精料日糧中添加Cr-Met對(duì)瘤胃p H、NH3-N、MCP和揮發(fā)性脂肪酸組成均無顯著影響（P>0.05）。與HC組相比，HCM組灘羊瘤胃內(nèi)乙酸/丙酸顯著升高（P<0.05），但與其他組間無顯著差異（P>0.05）。

表3 日糧精料水平和Cr-Met添加對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 3 Effects of dietary concentrate level and Cr-Met supplementation on rumen fermentation parameter

2.2 日糧精料水平和Cr-Met添加對(duì)灘羊瘤胃細(xì)菌DNA相對(duì)豐度的影響

由表4可知，與LC組相比，HC組灘羊瘤胃液中反式油酸溶纖維丁酸弧菌和黃色瘤胃球菌的DNA豐度顯著降低（P<0.05），但解脂厭氧弧桿菌的DNA豐度卻顯著增加（P<0.05）。高精料日糧條件下，灘羊瘤胃液中硬脂酸溶纖維丁酸弧菌、反式油酸溶纖維丁酸弧菌、蛋白溶解梭菌和解脂厭氧弧桿菌的DNA豐度隨Cr-Met劑量的增加而線性降低（P<0.05），但黃色瘤胃球菌的DNA豐度則線性升高（P<0.05）。

2.3 日糧精料水平和Cr-Met添加對(duì)灘羊瘤胃脂肪酸組成的影響

由表5可知，與LC組相比，HC組灘羊瘤胃液中C18：1、t9 C18：1、t11 C18：1、trans C18：1、c9t11 CLA、t10c12 CLA、C18：2n6和C18：3n3濃度均顯著降低（P<0.05），而C18：0濃度則顯著升高（P<0.05）。高精料日糧條件下，灘羊瘤胃液中C18：1、t9 C18：1、t11 C18：1和trans C18：1濃度隨Cr-Met劑量的增加而線性上升（P<0.05）。

表5 日糧精料水平和Cr-Met添加對(duì)瘤胃脂肪酸組成的影響Table 5 Effects of dietary concentrate level and Cr-Met supplementation on fatty acid composition of rumen fluid（mg·kg-1）

3 討論

3.1 日糧精料水平和Cr-Met添加對(duì)灘羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

本研究表明，提高日糧精料水平可顯著降低瘤胃乙酸比例，這與之前的研究結(jié)果一致［4，22］。飼喂高精料日糧可引起瘤胃pH降低，抑制瘤胃內(nèi)相關(guān)纖維降解菌的生長(zhǎng)繁殖，最終導(dǎo)致乙酸/丙酸的降低［3，9］。由表3和表4可知，本研究中HC組灘羊瘤胃pH值顯著低于LC組，并且相關(guān)纖維降解菌如：反式油酸溶纖維丁酸弧菌和黃色瘤胃球菌的DNA豐度顯著低于LC組。高精料日糧條件下丙酸濃度的含量較高，這與以前的研究結(jié)果一致［22-23］。這可能與高精料日糧促進(jìn)了相關(guān)淀粉分解菌的繁殖有關(guān)［23］。相對(duì)于纖維分解菌而言，淀粉分解菌對(duì)低瘤胃pH的耐受性更強(qiáng)。本研究中，增加日糧精料水平略微提高了丁酸的濃度，但并無顯著影響，這與Wang等［24］的研究結(jié)果一致。但Kljak等［25］的研究則表明，在以高粱（Sorghum bicolor）青貯為粗飼料來源的情況下，提高奶牛日糧精料水平可線性提高其瘤胃丁酸濃度。以上研究結(jié)果的不同，可能與動(dòng)物種類和日糧組成的不同有關(guān)。提高日糧精料水平可顯著提高戊酸濃度，這與Gudla等［3］的研究結(jié)果一致。Fuentes等［4］的體外研究也表明，提高日糧精料水平可增加發(fā)酵液中戊酸的比例，并且在同一精粗比條件下，發(fā)酵液的p H越低，其戊酸的比例則越高，本研究結(jié)果與此類似。Fuentes等［26］和Gudla等［3］的體外研究也有類似的發(fā)現(xiàn)，說明高精料日糧或低瘤胃p H有利于戊酸生成菌的生長(zhǎng)。日糧精料水平的增加提高了瘤胃內(nèi)MCP的濃度，這可能與高精料日糧增加了瘤胃內(nèi)MCP合成時(shí)所需的能量和碳架有關(guān)。隨著日糧精料水平的添加，瘤胃乙酸/丙酸由3.85降至2.53，這與Wang等［24］和Zhang等［9］的研究報(bào)道類似。說明精料比例的增加促進(jìn)了動(dòng)物瘤胃發(fā)酵類型由乙酸型轉(zhuǎn)變?yōu)楸嵝停@對(duì)提高動(dòng)物育肥效果具有重要意義［27］。目前關(guān)于日糧添加Cr-Met對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃揮發(fā)性脂肪酸影響的研究報(bào)道較少。本研究表明，高精料日糧中添加Cr-Met對(duì)瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的比例并無顯著影響。如表4所示，Cr-Met的添加對(duì)不同纖維降解菌的DNA豐度的影響并不一致。因此，瘤胃內(nèi)揮發(fā)酸的變化可能是Cr-Met對(duì)瘤胃微生物的不同作用結(jié)果所導(dǎo)致的。與HC組相比，HCM組乙酸/丙酸顯著升高，說明在HC日糧添加0.75 g·d-1·只-1Cr-Met改變了瘤胃發(fā)酵類型。

表4 日糧精料水平和Cr-Met添加對(duì)瘤胃細(xì)菌DNA相對(duì)豐度的影響Table 4 Effects of dietar y concentrate level and Cr-Met supplementation on the DNA abundance of selected rumen bacter ial（%of total bacteria）

3.2 日糧精料水平和Cr-Met添加對(duì)灘羊瘤胃細(xì)菌DNA相對(duì)豐度的影響

前人研究顯示［3，28］，瘤胃p H的降低會(huì)抑制瘤胃內(nèi)纖維降解菌的生長(zhǎng)如：反式油酸溶纖維丁酸弧菌和黃色瘤胃球菌的DNA豐度出現(xiàn)顯著下降，即使是在瘤胃p H沒有達(dá)到亞急性酸中毒的情況下。Latham等［29］的研究也表明，瘤胃纖維降解菌對(duì)pH的變化較為敏感。硬脂酸溶纖維丁酸弧菌也屬于纖維降解菌，并且和反式油酸溶纖維丁酸弧菌都屬于溶纖維丁酸菌屬，共同參與瘤胃內(nèi)C18：2n6氫化產(chǎn)生TVA的過程，但硬脂酸溶纖維丁酸弧菌的最終產(chǎn)物為C18：0［30］。本研究表明，瘤胃p H的降低并未顯著影響硬脂酸溶纖維丁酸弧菌的DNA豐度，這與Fuentes等［4］的研究結(jié)果一致。表明硬脂酸溶纖維丁酸弧菌對(duì)瘤胃p H變化的敏感程度比反式油酸溶纖維丁酸弧菌低。Fuentes等［4］和Gudla等［3］的體外研究表明，低瘤胃p H（5.60～5.74）條件下，解脂厭氧弧桿菌的數(shù)量顯著降低，本研究結(jié)果與此剛好相反。以上結(jié)果的不同，可能與體內(nèi)和體外試驗(yàn)之間的差異，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短和瘤胃pH的不同有關(guān)。Hobson［31］的研究表明，解脂厭氧弧桿菌的活性在pH為5.7時(shí)開始受到抑制，在pH為5.3時(shí)其活性完全被抑制，但當(dāng)p H維持在6.3以上時(shí)可避免其活性被抑制。Fuentes等［4］的體外研究表明，在p H為6.4的條件下孵育3 d后，發(fā)酵液中解脂厭氧弧桿菌的DNA豐度顯著降低，但當(dāng)繼續(xù)孵育2 d后，發(fā)酵液中解脂厭氧弧桿菌的DNA豐度顯著升高；但在p H=5.6的條件下孵育時(shí)，解脂厭氧弧桿菌的DNA豐度隨時(shí)間的增加呈線性降低。表明在pH適宜的情況下，解脂厭氧弧桿菌在經(jīng)過短暫的適應(yīng)過程后，其活性開始復(fù)蘇。Mackie等［32］和Tajima等［33］的體內(nèi)研究也表明，當(dāng)反芻動(dòng)物逐步適應(yīng)高精料日糧后，其瘤胃內(nèi)解脂厭氧弧桿菌的數(shù)量開始增加。

以前的研究表明，鉻在瘤胃的吸收率極低［12，34］，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)某些金屬元素的添加會(huì)抑制瘤胃微生物的生長(zhǎng)［14］，此外鉻在羊養(yǎng)殖中的使用一直未有明確的規(guī)定。因此，目前關(guān)于鉻添加對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃微生物影響的報(bào)道較少。本研究結(jié)果也表明，日糧添加Cr-Met降低了瘤胃內(nèi)硬脂酸溶纖維丁酸弧菌、反式油酸溶纖維丁酸弧菌、蛋白溶解梭菌和解脂厭氧弧桿菌的DNA豐度，這與Dallago等［14］關(guān)于吡啶甲酸鉻（chromium picolinate，Cr-Pic）添加降低了羔羊瘤胃原蟲數(shù)量的報(bào)道類似。有研究認(rèn)為，重金屬可引起瘤胃微生物DNA損傷，干擾基本代謝功能或活性代謝物的產(chǎn)生，增加其氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致其死亡或抑制其生長(zhǎng)繁殖［14］。然而，與其他瘤胃細(xì)菌不同的是，黃色瘤胃球菌的DNA豐度則隨高精料日糧中Cr-Met劑量的增加而升高。以上研究結(jié)果的不同，可能與不同瘤胃微生物對(duì)鉻的耐受性和需求的差異有關(guān)。

3.3 日糧精料水平和Cr-Met添加對(duì)灘羊瘤胃脂肪酸組成的影響

與HC組相比，LC組灘羊瘤胃液內(nèi)C18：1n9、C18：2n6和C18：3n3的濃度較高，表明飼喂LC日糧降低了灘羊瘤胃液內(nèi)這些脂肪酸的表觀脂解率或氫化。然而，Troegeler-Meynadier等［35］的體外研究表明，以干草為發(fā)酵底物或者在高瘤胃pH條件下（6.71 vs 6.21和6.56 vs 5.82）孵育6 h后，發(fā)酵液中的C18：2n6和C18：3n3的消失率顯著增加，其含量也顯著低于淀粉組和低p H組。Gudla等［3］的體外研究也表明，與精粗比70：30的日糧相比（p H=5.74），添加精粗比30∶70的日糧的發(fā)酵液（p H=6.47）在孵育3 h后，C18：2n6、C18：3n3和C18：1n9的濃度顯著降低。解脂厭氧弧桿菌是瘤胃內(nèi)參與不飽和脂肪酸脂解的主要細(xì)菌［36］，LC組較高的C18：1n9、C18：2n6和C18：3n3可能與解脂厭氧弧桿菌DNA豐度的降低有關(guān)［3，27，35］。

Trans C18：1和CLA是瘤胃不飽和脂肪酸氫化的中間產(chǎn)物。Trans C18：1和CLA濃度的升高和C18：0濃度的降低表明瘤胃內(nèi)的不飽和脂肪酸發(fā)生不完全氫化［3］。本研究中LC組灘羊瘤胃液中trans C18：1和c9t11 CLA濃度顯著增加，其他CLA異構(gòu)體的濃度也出現(xiàn)略微的增加，而C18：0則顯著降低，表明LC日糧促進(jìn)了瘤胃不飽和脂肪酸的不完全氫化。Troegeler-Meynadier等［35］的研究表明，以干草為發(fā)酵底物時(shí)trans C18：1還原為C18：0的效率顯著低于以玉米（Zea mays）淀粉為發(fā)酵底物時(shí)的還原效率。Kalscheur等［37］的體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)日糧粗料水平由25%升高到60%時(shí)，流入奶牛小腸中的C18：0的量降低了21.87%。表明在體內(nèi)試驗(yàn)的情況下，飼喂高水平的粗飼料可抑制瘤胃trans C18：1轉(zhuǎn)換為C18：0的還原反應(yīng)。本研究中LC組灘羊瘤胃液中C18：0的濃度較低，這與以上研究報(bào)道的結(jié)果一致。Wallace等［38］，Mckain等［39］和Ishlak等［27］的研究表明，蛋白溶解梭菌參與瘤胃氫化反應(yīng)的最后一步，即將trans C18：1還原為C18：0的過程，并且蛋白溶解梭菌在該還原反應(yīng)中起著重要作用。此外，Paillard等［30］的研究表明，硬脂酸溶纖維丁酸弧菌也參與C18：0的生成。本研究中HC組灘羊瘤胃液中硬脂酸溶纖維丁酸弧菌和蛋白溶解梭菌的DNA豐度均略高于LC組，這可能是HC組灘羊瘤胃液中C18：0的濃度顯著高于LC組的原因。當(dāng)然，HC組較高的C18：0也可能是由于某些未被檢測(cè)的微生物的變化所導(dǎo)致的。

Trans C18：1的濃度隨著高精料日糧中Cr-Met劑量的增加而線性上升，CLA濃度也有輕微的上升，而C18：0的濃度則略有降低，表明Cr-Met的添加促進(jìn)了瘤胃不飽和脂肪酸的不完全氫化作用［39］。由表4可知，高精料日糧中添加Cr-Met線性降低了瘤胃內(nèi)解脂厭氧弧桿菌的DNA豐度，這將導(dǎo)致瘤胃內(nèi)不飽和脂肪酸脂解作用的降低。這與HCM和HCH組瘤胃液中略微增加的C18：1n9和C18：2n6的變化一致。同時(shí)高精料條件下灘羊瘤胃內(nèi)硬脂酸溶纖維丁酸弧菌和蛋白溶解梭菌的DNA豐度隨Cr-Met的添加線性降低，這與C18：0含量的變化規(guī)律一致。瘤胃液內(nèi)trans C18：1濃度的線性升高也可能是Cr-Met的添加抑制了瘤胃內(nèi)不飽和脂肪酸生物氫化的末端還原反應(yīng)（trans C18：1轉(zhuǎn)變?yōu)镃18：0），從而導(dǎo)致trans C18：1在瘤胃內(nèi)不斷累積。

以前的研究表明，低精料日糧條件下，TVA是主要的trans C18：1異構(gòu)體，而高精料日糧條件下t10 C18：1則是主要的trans C18：1異構(gòu)體［4，35］。本研究則發(fā)現(xiàn)，無論在LC，還是在HC日糧條件下，TVA在所有trans C18：1異構(gòu)體中的比例均為最高，這與以上研究者的報(bào)道部分相似。Abughazaleh等［40］的研究表明，當(dāng)日糧精料水平由250 g·kg-1DM增加到500 g·kg-1DM時(shí)，發(fā)酵液中TVA依然是主要的trans C18：1異構(gòu)體；但當(dāng)日糧精料水平由500 g·kg-1DM增加到750 g·kg-1DM時(shí)，發(fā)酵液中t10 C18：1則成為主要的trans C18：1異構(gòu)體。這表明只有當(dāng)日糧精料水平達(dá)到一定比例時(shí)，t10 C18：1才有可能成為主要的trans C18：1異構(gòu)體。TVA是反芻動(dòng)物內(nèi)源途徑合成CLA的主要前體物，進(jìn)入動(dòng)物組織內(nèi)的TVA在硬脂酰輔酶A去飽和酶的作用下合成c9t11 CLA。本研究中，飼喂高精料日糧雖然降低了瘤胃液中TVA的濃度，但是Cr-Met的添加則線性提高了瘤胃液中TVA的濃度。這表明Cr-Met的添加可能對(duì)增加機(jī)體CLA的合成有一定的促進(jìn)作用。

以前的研究表明，C18：2n6可在反式油酸溶纖維丁酸弧菌的作用下產(chǎn)生TVA和c9t11 CLA［39］。本研究發(fā)現(xiàn)，Cr-Met的添加降低了瘤胃內(nèi)反式油酸溶纖維丁酸弧菌的DNA豐度，但TVA的濃度卻隨Cr-Met的添加呈線性增加，c9t11CLA的濃度也略有上升，這似乎是一個(gè)矛盾。Paillard等［30］和Maczulak等［41］的研究表明，瘤胃內(nèi)的纖維降解菌如：反式油酸溶纖維丁酸弧菌、白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌參與瘤胃內(nèi)C18：2n6的氫化。Gudla等［3］的研究也發(fā)現(xiàn)，3種纖維降解菌DNA豐度的降低是導(dǎo)致瘤胃內(nèi)TVA和c9t11 CLA下降的主要原因。本研究中，HC組灘羊瘤胃液中反式油酸溶纖維丁酸弧菌的DNA豐度雖然隨著Cr-Met劑量的增加而線性降低，但黃色瘤胃球菌的DNA豐度卻線性上升，并且黃色瘤胃球菌的DNA豐度在所有已檢測(cè)的細(xì)菌中占據(jù)主導(dǎo)地位，是反式油酸溶纖維丁酸弧菌的DNA豐度的19～33倍。據(jù)此推斷，高精料日糧條件下TVA和c9t11 CLA濃度隨Cr-Met添加量的增加而升高的變化趨勢(shì)是反式油酸溶纖維丁酸弧菌和黃色瘤胃球菌共同作用的結(jié)果。此外，Cr-Met的添加線性降低了瘤胃內(nèi)硬脂酸溶纖維丁酸弧菌和蛋白溶解梭菌的DNA豐度，這表明瘤胃內(nèi)不飽和脂肪酸氫化反應(yīng)的最后一步受阻。因此，瘤胃內(nèi)TVA和c9t11 CLA濃度的增加也可能是由于氫化反應(yīng)受阻所導(dǎo)致的底物濃度積累的結(jié)果。

t10c12 CLA的產(chǎn)生源自與c9t11 CLA不同的酶系［42］。以往的大部分研究表明，高精料日糧或低p H可提高瘤胃內(nèi)t10c12 CLA的含量［3，26］。但本研究則發(fā)現(xiàn)，HC組t10c12 CLA的濃度顯著低于LC組，F(xiàn)uentes等［4］、Wallace等［42］和Troegeler-Meynadier等［35］也有類似的發(fā)現(xiàn)。有學(xué)者認(rèn)為，埃式巨型球菌參與瘤胃內(nèi)C18：2n6生成t10c12 CLA的過程［43］，并且高精料或者低瘤胃p H可促進(jìn)埃式巨型球菌的生長(zhǎng)［44］，從而提高t10c12 CLA的含量［3］。然而，Maia等［45］的研究表明，埃式巨型球菌不具有異構(gòu)化C18：2n6的能力。本研究也發(fā)現(xiàn)，在LC組埃式巨型球菌的DNA豐度略低于HC組的情況下，LC組灘羊瘤胃液中t10c12 CLA的濃度顯著高于HC組。這意味著瘤胃中存在其他適宜在低精料日糧或高瘤胃pH條件下生長(zhǎng)的細(xì)菌參與了t10c12 CLA的產(chǎn)生。Verhulst等［34］的研究表明，痤瘡丙酸桿菌具有將C18：2n6轉(zhuǎn)化為t10c12 CLA的能力，并且其可在以干草為底物的發(fā)酵液中生存。因此，本研究中LC組灘羊瘤胃液中t10c12 CLA的濃度顯著升高，可能與痤瘡丙酸桿菌或者其他t10c12 CLA生成菌的大量繁殖有關(guān)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下，飼喂精粗比為55∶45的高精料日糧降低了灘羊瘤胃內(nèi)參與生物氫化作用的細(xì)菌的DNA豐度如：反式油酸溶纖維丁酸弧菌和黃色瘤胃球菌，但促進(jìn)了解脂厭氧弧桿菌的生長(zhǎng)繁殖。高精料日糧促進(jìn)了瘤胃內(nèi)不飽和脂肪酸的生物氫化，導(dǎo)致c9t11 CLA和TVA濃度的下降；Cr-Met的添加降低了大部分氫化細(xì)菌的DNA豐度，但增加了黃色瘤胃球菌的DNA豐度；同時(shí)也增加了瘤胃內(nèi)TVA的含量，這對(duì)機(jī)體組織中c9t11 CLA含量的增加有一定促進(jìn)作用。