HPLC同時測定痔清舒洗劑中綠原酸、咖啡酸和鹽酸小檗堿的含量

譚本仁，鄭錦坤，黃義純，徐曉梅，劉宴林

（1.汕頭大學醫(yī)學院附屬粵北人民醫(yī)院，廣東 韶關 512026；2.韶關市食品藥品檢驗所，廣東 韶關 512028）

痔清舒洗劑是汕頭大學醫(yī)學院附屬粵北人民醫(yī)院基于傳統(tǒng)中醫(yī)理論和臨床實效研制的中藥復方外用洗劑，已應用于臨床多年，效果明顯，療效確切，受到患者的一致好評，該制劑具有清熱解毒、燥濕止癢、行氣活血、消腫止痛等功效，主要由大黃、蒲公英、黃柏、沒藥等多味中草藥提煉而成?，F(xiàn)行質量標準為廣東省藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療機構制劑注冊標準（粵ZB20111771），標準僅規(guī)定了顏色、氣味等性狀、個別藥材鑒別、相對密度和PH值等，對主要成分未有定量分析標準。前期本人僅對痔清舒洗劑中大黃素和大黃酚進行了HPLC含量檢測[1]，本實驗擬采用HPLC法同時測定痔清舒洗劑中的綠原酸、咖啡酸和鹽酸小檗堿三種主要水溶性成分。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（安捷倫公司Aglient 1260），島津SHIMADZU（LC-30AD）；色譜柱：伊力特Hypersil ODS2（5 μm，250 mm×4.6 mm），Kromasil 100-5-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），Agilent ZORBAX RX-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）。METTLE TOLEDO AG135電子天平（精密0.000 01g）；HT-300BQ超聲波清洗儀（濟寧恒通）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（批號：110753-201817，純度：96.8%）、咖啡酸對照品（批號：110885-200102，純度：100%）鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-201814，純度：86.7%）（中國食品藥品檢定研究院）；痔清舒洗劑（粵北人民醫(yī)院制劑，批號分別為：20200212，20200227，20200617）；乙腈、甲醇為色譜純，TEDIA公司，水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

用十八基硅烷鍵合硅膠為填充劑，經(jīng)反復多次預試驗確定采用梯度洗脫，乙腈為流動相A，1%磷酸為流動相B，洗脫梯度見表1。

表1 流動相洗脫梯度

柱溫：30℃；流速：1 mL·min-1；檢測波長為324 nm，進樣量10 μL。理論板數(shù)按綠原酸計算應不低于3 000。

2.2 溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品、咖啡酸對照品和鹽酸小檗堿對照品適量，加50%甲醇分別制成濃度為0.710 5 mg·mL-1、0.203 2 mg·mL-1和 0.185 2 mg·mL-1的對照品溶液。精密量取痔清舒洗劑約20 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取濾液，即得供試品溶液。根據(jù)痔清舒洗劑說明書中4味藥的比例配制成缺主藥的陰性藥品作為研究對象，按照所提供4種藥物試品溶液的制備方法，制備成實驗所需的陰性對照溶液。

2.3 線性范圍考察

分別吸取“2.2”項下3種對照品溶液各0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL置5個10 mL量瓶中，將醫(yī)用甲醇溶解并稀釋至所標注的刻度，輕輕搖勻，即得所需的稀釋后的甲醇溶液。精密吸取各10 μL，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，以對照品的含量為橫坐，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得出綠原酸、咖啡酸和鹽酸小檗堿的回歸方程及相關系數(shù)分別為：y綠原酸=1.236 9×104x＋6.225 3×104（r= 0.998 3），y咖啡酸= 2.862 8×104x＋5.606 2×103（r= 1.000），y鹽酸小檗堿 =1.815 3×104x＋4.463 9×103（r= 1.000）。結果表明：綠原酸在 7.105 μg·mL-1～ 142.1 μg·mL-1、咖啡酸在 4.064 μg·mL-1～ 81.28 μg·mL-1和鹽酸小檗堿在5.556 μg·mL-1～ 111.16 μg·mL-1呈良好的線性關系。

2.4 專屬性實驗

精密吸取陰性對照溶液適量，按“2.2”項下色譜條件下進行樣測定，結果在與對照品溶液綠原酸、咖啡酸及鹽酸小檗堿出峰位置上無相應色譜峰，表明陰性對照無干擾。見圖1、圖2、圖3。

圖1 對照品圖譜

圖2 供試品圖譜

圖3 陰性對照品圖譜

2.5 加樣回收率試驗

取已知含量的供試品溶液共18份，分別置10 mL量瓶中，并精密加入適量的3種對照品溶液，加70%甲醇定容至刻度，按“2.2”項下色譜條件分別進樣10 μL，測定，計算回收率及RSD，結果見表2。

表2 加樣回收率實驗結果

3 討論

痔清舒洗劑是由大黃、蒲公英、黃柏、沒藥等多味中草藥組成，大黃性味苦寒，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃的功效[2]。大黃具有廣泛的藥理活性，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化應激、抗腫瘤、抗纖維化、止血、調脂、降糖、調節(jié)免疫力等藥理作用[3-4]，臨床用于治療實熱積滯便秘、血熱吐衄、目赤咽腫、牙齦腫痛、臃腫疔瘡、腸癰腹痛、燒燙傷等[2]。蒲公英具有清熱解毒、消腫散結、利尿通淋的功效[2]，針對蒲公英提取物和單體活性成分的研究，其藥理上具有抑菌和抗病毒的作用，具有廣譜抑菌作用，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌和病毒均有不同程度的抑制作用，蒲公英具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、免疫抑制、抗突變、胃腸黏膜保護、保護心肌細胞、降血糖、利尿等作用[5-6]。黃柏性苦味寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、除蒸療瘡的功效[2]，臨床廣泛用于治療濕熱痢疾、泄瀉、黃疸、骨蒸勞熱、濕疹濕瘡、瘡瘍腫毒等病癥[7]?？咕?、抗炎、解熱、抗癌、抗細胞凋亡、抗氧化、抗病毒、抗感染、滋陰、降血糖等作用，對免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)均有一定的影響[8-9]。沒藥性味辛苦平，具有散瘀定痛、消腫生肌的功效[2]。該藥具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗血脂的作用，臨床用于治療折傷馬墜，跌打損傷，骨節(jié)疼痛，金瘡杖瘡，惡瘡痔漏，平產(chǎn)后血刺，癰疽腫痛、瘡瘍潰后久不收口及多種瘀滯痛癥，兼墜胎孕，除目中障翳，心虛膽怯，肝血不足等癥[10-11]。該方中諸藥配伍合理，具有清熱解毒、燥濕止癢、行氣活血、消腫止痛的功效,主治炎性外痔、痔嵌頓，術后肛緣水腫等癥。所測定的3種有效成分具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、降血糖和免疫調節(jié)等多方面的藥理作用[12-14]，與痔清舒洗劑所含的有效成分的藥理作用相似。

中藥復方制劑為多體系組分復雜，常具有水溶性及脂溶性主要成分，在痔清舒洗劑水溶性主要成分的質量控制中，參考了2015年版《中國藥典》和相關文獻[15-19]，經(jīng)過反復的試驗，采用以甲醇、乙腈和1%磷酸溶液為流動相，梯度洗脫，綠原酸、咖啡酸及鹽酸小檗堿三種成分的色譜峰峰形對稱，得到的分離效果最佳，陰性溶液對照無干擾，參照的系統(tǒng)適應性較佳，所采用的HPLC含量測定方法能較好地測定綠原酸、咖啡酸及鹽酸小檗堿3種成分的含量，試驗結果提示該測定方法可行性強，重復性好，基于前期對痔清舒洗劑中大黃素和大黃酚含量測定的試驗基礎，該測定方法和測定目標的選定用于痔清舒洗劑的質量控制及質量標準完善具有積極的意義。

綜上所述，所建立的痔清舒洗劑含有多種藥理活性，具有抗菌、抗炎、抗病毒、免疫抑制、抗?jié)兊茸饔茫葹楹侠碛盟幪峁┮罁?jù)，又是臨床用藥安全提供保證[20]。所含有的綠原酸、咖啡酸及鹽酸小檗堿從色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗、溶液的制備、線性范圍考察、加樣回收率試驗等方面所測定的質量標準，解決了其質量控制的難點，客觀地評價了痔清舒洗劑質量的穩(wěn)定性、有效性，能夠為其質量控制提供參考依據(jù)。