畜禽糞便堆放地土壤中抗生素抗性基因和細(xì)菌群落的垂直分布特征*

韓婉雪,王鳳花,柏兆海,李文彥,王新珍,馬 林

(1.中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所農(nóng)業(yè)資源研究中心/中國(guó)科學(xué)院農(nóng)業(yè)水資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省土壤生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 石家莊 050022; 2.河北師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院/河北省環(huán)境演變與生態(tài)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室/河北省環(huán)境變化遙感識(shí)別技術(shù)創(chuàng)新中心/河北省地理科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 石家莊 050024; 3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

長(zhǎng)期以來(lái),抗生素在預(yù)防和治療動(dòng)物傳染性疾病、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)以及提高飼料轉(zhuǎn)化率等方面發(fā)揮著重要作用。隨著集約化養(yǎng)殖進(jìn)程的加快,畜禽養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的使用量也急劇增加。2013年中國(guó)抗生素的使用量為16.2 萬(wàn)t,其中一半以上為獸用抗生素。但抗生素通常不能完全被動(dòng)物吸收,約30%～90%的抗生素以母體或代謝產(chǎn)物的形式隨糞尿進(jìn)入環(huán)境,對(duì)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生潛在威脅。由于抗生素的長(zhǎng)期濫用,誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)抗生素抗性基因(以下簡(jiǎn)稱“抗性基因”)的產(chǎn)生,造成動(dòng)物病原菌耐藥性的升高,加速了養(yǎng)殖環(huán)境中抗性基因的產(chǎn)生和擴(kuò)散。畜禽糞便已成為抗生素、抗性基因及抗性細(xì)菌的重要“儲(chǔ)蓄庫(kù)”。此外,隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展,隨之而來(lái)的環(huán)境問(wèn)題也日益凸顯,尤其是畜禽糞便排放量逐年增加,從2016年的31.6 億t增加到2021年的38 億t。然而,大量的畜禽糞便在農(nóng)業(yè)利用前未經(jīng)處理直接堆放在養(yǎng)殖場(chǎng)周邊,其殘留的抗生素和抗性基因會(huì)進(jìn)一步污染周邊土壤和水體,對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康造成潛在危害。

目前關(guān)于我國(guó)養(yǎng)殖場(chǎng)畜禽糞便中抗生素和抗性基因殘留已開(kāi)展了大量的研究。Qiao 等研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類抗生素在畜禽糞便中具有較高的檢出率和檢出濃度,四環(huán)素類和磺胺類抗性基因也是施用畜禽糞便土壤中檢出頻率較高的兩類抗性基因。同其他污染物一樣,抗生素和抗性基因在土壤中會(huì)隨降水、灌溉等途徑,向下層土壤遷移。Tang 等研究表明,長(zhǎng)期施畜禽糞便的土壤中、、和基因豐度隨土壤深度的增加而降低。綦崢等在畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)周邊不同深度土壤中檢測(cè)到多種抗性基因,其中磺胺類抗性基因隨著土壤深度的增加逐漸降低,而-內(nèi)酰胺類抗性基因隨土層深度的增加出現(xiàn)了上升的趨勢(shì)。這就說(shuō)明畜禽糞便的施用會(huì)不同程度地污染下層土壤。值得注意的是,長(zhǎng)期堆放畜禽糞便的土壤受畜禽糞便中殘留的抗生素和抗性基因等污染物的影響要高于施畜禽糞便的農(nóng)田土壤。但有關(guān)長(zhǎng)期堆放畜禽糞便土壤中抗性基因的垂直分布特征的研究相對(duì)較少。

微生物作為抗性基因的宿主,其群落結(jié)構(gòu)的變化與抗性基因的分布緊密相關(guān)。土壤微生物對(duì)土壤環(huán)境的變化非常敏感,有研究表明,有機(jī)肥施用通過(guò)改變土壤環(huán)境因子,引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化,進(jìn)而影響土壤中抗性基因的分布。此外,不同深度土壤的化學(xué)性質(zhì)存在差異,為微生物生存提供的生態(tài)位也不同,導(dǎo)致不同深度土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著差異。除微生物群落結(jié)構(gòu)外,基因水平轉(zhuǎn)移機(jī)制(Horizontal Gene Transfer,HGT)也是影響抗性基因傳播的重要因素。畜禽糞便中殘留大量的可移動(dòng)基因元件,如質(zhì)粒、整合子和轉(zhuǎn)座子等,糞源抗性基因能與可移動(dòng)基因元件相結(jié)合,通過(guò)HGT 轉(zhuǎn)移到土著微生物中且能夠長(zhǎng)期存活。已有研究將整合酶基因作為表征抗性基因傳播潛力的重要指標(biāo)之一。Gou 等研究發(fā)現(xiàn),基因與、和基因具有顯著正相關(guān),促進(jìn)了抗性基因在環(huán)境中的傳播。

本研究采集了長(zhǎng)期堆放豬糞和雞糞的0～100 cm土壤,解析畜禽糞便堆放地土壤中抗性基因、基因和微生物群落結(jié)構(gòu)的垂直分布特征; 同時(shí)結(jié)合土壤化學(xué)性質(zhì)和微生物測(cè)序結(jié)果,探討影響畜禽糞便堆放地土壤中抗性基因分布的主導(dǎo)因子,以期為控制養(yǎng)殖場(chǎng)中畜禽糞便堆放地土壤中抗性基因污染提供科學(xué)依據(jù),為環(huán)境中抗性基因生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集及處理

本研究分別采集了河北省石家莊市欒城區(qū)(37°53′N,114°14′E)養(yǎng)豬場(chǎng)中豬糞(PM)堆放地(約20年)和養(yǎng)雞場(chǎng)中雞糞(CM)堆放地(約20年)0～100 cm 土壤,同時(shí)采集未堆放畜禽糞便的土壤樣品作為對(duì)照(CK)。土壤分層為0～10 cm、10～30 cm、30～50 cm、50～70 cm、70～100 cm。每個(gè)樣點(diǎn)采集3個(gè)重復(fù)。樣品采集完后,置于冰上運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。土壤樣品過(guò)2 mm 篩后,一部分風(fēng)干后用于測(cè)定土壤化學(xué)性質(zhì); 另一部分保存于?80 °C 超低溫冰箱用于后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2 土壤化學(xué)性質(zhì)分析

土壤pH 和有機(jī)質(zhì)、總碳、總氮含量的測(cè)定參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》。利用pH 計(jì)(PHS-3C,Shanghai INESA)測(cè)定土壤pH,土水比為1∶2.5(/); 土壤有機(jī)質(zhì)(soil organic matter,SOM)含量采用低溫外熱重鉻酸鉀氧化法,利用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定(UV-6100S,Shanghai); 土壤總碳(total carbon,TC)和土壤總氮(total nitrogen,TN)含量利用元素分析儀(Vario PYRO cube,Elementar,Germany)測(cè)定。

1.3 土壤微生物DNA 提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用FastDNA Spin Kit for Soil 試劑盒(MP Biomedicals,United States)依照說(shuō)明提取土壤微生物總DNA。利用超微量分光光度計(jì)(NanoDrop One,ThermoFisher Scientific,United States)測(cè)定DNA 的純度和濃度。將DNA 保存于?20 ℃冰箱用于后續(xù)分析。

采用SYBR Green 染料法分別定量磺胺類抗性基因(和)、四環(huán)素類抗性基因(、、、)和基因的豐度。PCR 反應(yīng)體系(25 μL)如 下:12.5 μL 2×SYBR Premix Ex Taq(Takara Biotech,Dalian,China),0.25 μL前引物/后引物(10 μmol?L),1 μL DNA (約20 ng?μL)和11 μL ddHO。擴(kuò)增條件:預(yù)變性95 ℃ 3 min,35 個(gè)循環(huán)變性95 ℃ 30 s,退火30 s (55.9 ℃;60.8 ℃;、和55 ℃;和60 ℃),72 ℃延伸3 min,83 ℃采集熒光信號(hào)10 s。采用TaqMan 探針?lè)ǘ考?xì)菌16S rRNA 基因豐度。反應(yīng)體系為25 μL;12.5 μL 2 × Premix Ex Taq(Probe qPCR) (Takara Biotech,Dalian,China),0.5 μL 前引物/后引物(10 μmol?L),0.6 μL 探針(10 μmol?L),1 μL DNA (約20 ng?μL)和9.9 μL ddHO。擴(kuò)增條件:預(yù)變性95 ℃ 2 min; 40個(gè)循環(huán)變性95 ℃ 15 s,退火56 ℃ 60 s。

1.4 細(xì)菌16S rRNA 基因高通量測(cè)序與生物信息學(xué)分析

為探究土壤細(xì)菌群落組成,使用515F/806R 引物對(duì)16S rRNA 基因V4 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海派森諾公司,利用Illumina Miseq 平臺(tái)(Illumina,San Diego,CA,United States)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)QIIME2 2019.7 版本(Quantitative Insights Into Microbial Ecology)進(jìn)行分析。利用DADA2 對(duì)序列進(jìn)行如下操作:去除引物、質(zhì)量過(guò)濾、去噪、拼接和去嵌合體,最終生成特征表。使用Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)特征表進(jìn)行注釋,經(jīng)物種過(guò)濾、重采樣后得到物種不同分類水平上的相對(duì)豐度,同時(shí)計(jì)算細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的α 多樣性和β 多樣性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM SPSS Statistic 20.0 軟件對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)和Shannon 指數(shù)進(jìn)行方差分析。利用R 語(yǔ)言corrplot 包對(duì)基因豐度、抗性基因豐度和土壤化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。箱線圖、條形圖和散點(diǎn)圖由SigmaPlot 12.5 生成。采用R 語(yǔ)言的pheatmap 包繪制熱圖。使用R 語(yǔ)言的vegan 包進(jìn)行方差分解分析(variation partitioning analysis,VPA)、主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis,PCoA)和置換多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance,PERMANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中化學(xué)性質(zhì)分析

在0～10 cm 表層土中,豬糞堆放地土壤中pH 和SOM、TC 含量顯著高于對(duì)照土壤(<0.05),雞糞堆放地土壤中TC 含量和C/N 值顯著高于對(duì)照土壤(<0.05)(表1)。豬糞堆放地土壤pH 和SOM 含量顯著高于雞糞堆放地,說(shuō)明畜禽糞便種類不同,對(duì)堆放地土壤化學(xué)性質(zhì)的影響也不同。此外,土壤化學(xué)性質(zhì)隨土壤深度呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。豬糞堆放地土壤SOM 和TN 含量、雞糞堆放地土壤TC 含量隨土壤深度增加呈遞減趨勢(shì),而豬糞堆放地土壤C/N 值隨土壤深度增加呈遞增趨勢(shì)。畜禽糞便堆放對(duì)表層土壤(0～10 cm)化學(xué)性質(zhì)的影響高于底層土壤(10～100 cm)。

表1 不同畜禽糞便堆放地的土壤化學(xué)性質(zhì)Table 1 Soil chemical properties in different treatments

2.2 土壤中抗性基因和intI1 基因的分布特征

豬糞和雞糞堆放地0～100 cm 土壤樣品中、、、、、以及基因均有檢出,而在對(duì)照土壤樣品中只有和基因在0～100 cm 土層中有檢出。豬糞和雞糞堆放地土壤中、、、、、以及基因的相對(duì)豐度與對(duì)照土壤樣品中顯著不同,分級(jí)聚類結(jié)果顯示,所有土壤樣品的基因豐度分為兩枝,一枝為對(duì)照土壤樣品,另一枝為堆放豬糞和雞糞的土壤樣品(圖1)。豬糞堆放地土壤0～100 cm 樣品中抗性基因和基因的相對(duì)豐度分別為7.55×10～1.37×10和1.71×10～6.87×10基因拷貝數(shù)/16S rRNA 基因拷貝數(shù),雞糞堆放地土壤0～100 cm 樣品中抗性基因和基因的相對(duì)豐度分別為1.94×10～1.55×10和1.70×10～3.15×10基因拷貝數(shù)/16S rRNA 基因拷貝數(shù),對(duì)照土壤0～100 cm 樣品中抗性基因和基因的相對(duì)豐度分別為未檢出～2.07×10和未檢出～1.84×10基因拷貝數(shù)/16S rRNA 基因拷貝數(shù),其檢出豐度均顯著低于豬糞和雞糞堆放地土壤。此外,對(duì)照土壤、豬糞和雞糞堆放地土壤中抗性基因和基因豐度隨土壤深度增加呈遞減趨勢(shì)。聚類結(jié)果表明,豬糞和雞糞堆放地土壤中抗性基因和基因豐度也有差異,但基因豐度均主要集中在0～30 cm。土壤樣品中不同種類的抗性基因豐度也有差異,其中磺胺類抗性基因和的相對(duì)豐度(8.10×10～1.55×10基因拷貝數(shù)/16S rRNA 基因拷貝數(shù))高于四環(huán)素類抗性基因、、和的相對(duì)豐度(1.18×10～2.94×10基因拷貝數(shù)/16S rRNA 基因拷貝數(shù))。

圖1 不同處理不同深度土壤tetW、tetC、tetG、tetL、sulI、sulII 和intI1 基因的相對(duì)豐度(基因拷貝數(shù)/16S rRNA 基因拷貝數(shù))Fig.1 Relative abundances (gene copy number/16S rRNA gene copy number) of tetW,tetC,tetG,tetL,sulI,sulII and intI1 genes in different soil depths of different treatments

2.3 土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析

通過(guò)對(duì)54 個(gè)樣品的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量篩選后得到3 322 558 條序列,平均61 529 條特征序列(Amplicon Sequence Variants,ASVs)。豬糞和雞糞堆放對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成產(chǎn)生了不同的影響(圖2)。對(duì)照0～10 cm 表層土壤中的細(xì)菌主要由變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)和擬桿菌門(Bacteroidetes)組成,約占細(xì)菌群落的68.64%。而豬糞和雞糞堆放地0～10 cm表層土壤中的細(xì)菌主要由變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和厚壁菌門(Firmicutes),分別約占細(xì)菌群落的81.76%和92.71%。與對(duì)照土壤相比,豬糞堆放表層土壤中變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度分別增加至39.14%、9.29%和12.46%,而雞糞堆放表層土壤中變形菌門、放線菌門和擬桿菌門相對(duì)豐度分別增加到30.32%、32.64%和14.60%。此外,土壤細(xì)菌群落組成也受土壤深度的影響。例如,在對(duì)照土壤中,浮霉菌門和擬桿菌門相對(duì)豐度隨土壤深度呈遞減趨勢(shì),而放線菌門和芽單胞菌門呈遞增趨勢(shì)。在豬糞和雞糞堆放地土壤中,變形菌門、放線菌門、厚壁菌門等隨土壤深度呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。

圖2 不同處理不同土層細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門分類水平的相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundances of the dominant bacterial phyla in different soil layers of different treatments

畜禽糞便堆放和土壤深度影響了土壤細(xì)菌的α多樣性和β 多樣性(圖3A 和圖3B)。從圖3A 可以看出,在0～10 cm 和10～30 cm 土層,豬糞和雞糞堆放地降低了土壤細(xì)菌α 多樣性,且豬糞堆放地土壤細(xì)菌α 多樣性要顯著高于雞糞堆放地土壤。在30～50 cm土層,豬糞和雞糞堆放地土壤細(xì)菌α 多樣性與對(duì)照土壤無(wú)顯著差異。而在70～100 cm 土層,只有豬糞堆放土壤中細(xì)菌α 多樣性與對(duì)照土壤相比顯著降低。PCoA 主坐標(biāo)分析結(jié)果(圖3B)表明,前兩軸共解釋了34.3%的群落變異?？傮w上是,對(duì)照0～10 cm 和10～30 cm 土壤樣品聚在一起(Ⅰ),豬糞堆放地0～10 cm和10～30 cm 樣品以及雞糞堆放地0～10 cm、10～30 cm和30～50 cm 土壤樣品聚在一起(Ⅱ),而其余的土壤樣品聚在一起。這說(shuō)明豬糞堆放地0～30 cm 土壤和雞糞堆放地0～50 cm 土壤與對(duì)照土壤樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異相較于深層土壤更為明顯。

圖3 不同處理不同土層細(xì)菌α 多樣性(A)和基于Bray-Curtis 距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成(B)Fig.3 Soil bacterial α diversity (A) and principal coordinate analysis (PCoA) based on the Bray-Curtis distance (B) showing the profile of bacterial community structure in different soil layers of different treatments

2.4 影響土壤中抗性基因分布特征的因素

VPA 分析結(jié)果表明,土壤化學(xué)性質(zhì)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)土壤中抗性基因分布的總解釋量為45.93%(圖4A)。其中,土壤化學(xué)性質(zhì)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)抗性基因分布的解釋量分別是15.91%和37.47%,表明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是影響土壤中抗性基因分布的主要因素(圖4A)。進(jìn)一步通過(guò)Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(圖4B),SOM、TC 和TN 分別與、、、、、以及基因豐度呈顯著正相關(guān)(<0.05),而土壤pH 與、、及基因豐度呈顯著正相關(guān)(<0.05),這也說(shuō)明了土壤化學(xué)性質(zhì)的變化影

圖4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和土壤化學(xué)性質(zhì)對(duì)抗性基因分布的方差分解分析(VPA) (A)以及intI1 基因豐度、抗性基因豐度和土壤化學(xué)性質(zhì)間的Pearson 相關(guān)性分析(B)Fig.4 Effects of bacterial community and soil chemical properties on the variations of resistance genes (A),and Pearson’s correlation among the intI1 gene abundance,resistance gene abundances,and soil chemical properties (B)

響了土壤中抗性基因的變化。值得注意的是,基因豐度分別與(=0.97,<0.001)、(=0.99,<0.001)、(=0.67,<0.01)、(=0.91,<0.001)、(=0.77,<0.001)和(=0.73,<0.01)基因豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系(<0.05),說(shuō)明基因在抗性基因的傳播過(guò)程中也起著重要的作用。

3 討論和結(jié)論

本研究在長(zhǎng)期堆放豬糞和雞糞土壤中檢測(cè)到較高豐度的四環(huán)素類抗性基因(、、、)和磺胺類抗性基因(、),說(shuō)明畜禽糞便直接堆放加劇土壤中抗性基因的污染程度。已有研究表明,畜禽糞便中含有高豐度的抗性基因,其中四環(huán)素類抗性基因和磺胺類抗性基因也是豬糞和雞糞等畜禽糞便中檢出率較高的兩類抗性基因。Ji 等分析了養(yǎng)豬場(chǎng)、養(yǎng)雞場(chǎng)和養(yǎng)牛場(chǎng)糞便中抗性基因的豐度,四環(huán)素類抗性基因和磺胺類抗性基因的相對(duì)豐度分別是10～10基因拷貝數(shù)/16S rRNA基因拷貝數(shù)和10～10基因拷貝數(shù)/16S rRNA 基因拷貝數(shù)。Cheng 等定量分析了杭州不同規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)、養(yǎng)雞場(chǎng)、養(yǎng)鴨場(chǎng)和養(yǎng)羊場(chǎng)糞便中的10 種四環(huán)素類抗性基因(、、、、、、、、和)和2 種磺胺類抗性基因(和),結(jié)果表明、和基因的相對(duì)豐度分別可達(dá)7.12×10、1.99×10和3.99×10基因拷貝數(shù)/16S rRNA 基因拷貝數(shù),且豬糞中磺胺類抗性基因豐度低于雞糞。這可能是因?yàn)轲B(yǎng)豬場(chǎng)和養(yǎng)雞場(chǎng)的養(yǎng)殖密度較大,使得抗生素的使用量相應(yīng)增加,進(jìn)而導(dǎo)致豬糞和雞糞中抗生素的殘留和抗性基因的豐度也相應(yīng)增加。盡管本研究中豬糞和雞糞堆放地土壤中四環(huán)素類和磺胺類抗性基因的豐度與已有研究不盡相同,但總體維持在一個(gè)較高的水平,同樣會(huì)對(duì)周邊土壤和水體造成潛在危害。

豬糞和雞糞堆放土壤中抗性基因的分布特征與土壤化學(xué)性質(zhì)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān),對(duì)土壤中抗性基因分布的解釋量為45.93%,其中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是影響土壤中抗性基因分布的主要因素,這與前人的研究結(jié)果一致。長(zhǎng)期堆放豬糞和雞糞改變了土壤的化學(xué)性質(zhì),例如pH、SOM 等,進(jìn)而改變了土壤細(xì)菌的群落組成。有研究表明土壤微生物對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的變化非常敏感,不同環(huán)境因子在構(gòu)建細(xì)菌群落中的貢獻(xiàn)不同,其中pH 和SOM 被認(rèn)為是影響微生物群落組成的重要因素。土壤化學(xué)指標(biāo)的變化也會(huì)造成土壤微生物群落組成的差異。例如,豬糞堆肥和雞糞堆肥土壤均增加了變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度。Zhang 等研究發(fā)現(xiàn)變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門是抗性基因的主要宿主,這些細(xì)菌門也被認(rèn)為是多重耐藥類抗性基因的重要宿主。此外,在垂直分布上,豬糞和雞糞堆放地土壤中四環(huán)素類抗性基因和磺胺類抗性基因均隨土壤深度呈降低的趨勢(shì),但抗性基因的檢出率和相對(duì)豐度都要高于對(duì)照土壤,說(shuō)明畜禽糞便堆放會(huì)導(dǎo)致抗性基因向下層土壤遷移,進(jìn)而污染下層土壤。Tang 等研究發(fā)現(xiàn),施用豬糞有機(jī)肥增加了土壤中和基因的豐度,且抗性基因豐度與土壤深度呈負(fù)相關(guān)。豬糞和雞糞有機(jī)肥堆放地土壤中抗性基因主要集中在0～10 cm 和10～30 cm 土層,這可能與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān),因?yàn)樨i糞和雞糞堆放地土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在0～10 cm和10～30 cm 土層較為相似。

除土壤化學(xué)指標(biāo)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)外,基因水平轉(zhuǎn)移機(jī)制也是影響抗性基因分布的重要因素,其中基因常作為表征抗性基因在環(huán)境中傳播潛力的指示基因。在本研究中,豬糞和雞糞堆放地土壤中基因相對(duì)豐度比對(duì)照土壤高4 個(gè)數(shù)量級(jí),且基因豐度與、、、呈顯著正相關(guān)(<0.05),表明基因可能促進(jìn)了抗性基因在土壤中的傳播和擴(kuò)散。Wang 等在施加畜禽糞便的土壤中同樣檢測(cè)到了較高豐度基因,這可能是殘留的基因通過(guò)畜禽糞便被引入到土壤中。有機(jī)肥堆放顯著增加了土壤中基因豐度,可能是有機(jī)肥中大量的可移動(dòng)基因元件被引入土壤中。畜禽糞便堆放可能使得土壤微生物通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移機(jī)制,加速了抗性基因在土壤中的傳播擴(kuò)散,并對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)造成潛在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。此外,基因豐度隨土壤深度增加呈遞減趨勢(shì),說(shuō)明表層土壤中抗性基因發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移的可能性更大,抗性基因傳播擴(kuò)散的潛力要高于深層土壤。

綜上所述,長(zhǎng)期堆放豬糞和雞糞增加了土壤中四環(huán)素類和磺胺類抗性基因的豐度,且增加了抗性基因向下層土壤遷移的風(fēng)險(xiǎn)。豬糞和雞糞堆放地土壤中抗性基因主要集中在0～10 cm 和10～30 cm 土層。土壤化學(xué)性質(zhì)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是影響抗性基因垂直分布特征的重要因素。此外,豬糞和雞糞堆放增加了土壤中基因的豐度,基因在抗性基因傳播中起著重要的作用。本研究結(jié)果為評(píng)估畜禽糞便堆放對(duì)周邊環(huán)境抗性基因污染風(fēng)險(xiǎn)提供了重要理論依據(jù)。后續(xù)研究也應(yīng)積極探索養(yǎng)殖場(chǎng)中畜禽糞便產(chǎn)生、處置和利用各環(huán)節(jié)的畜禽糞便管控方式,降低抗性基因和可移動(dòng)基因元件在養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)向周圍環(huán)境傳播擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。