前處理對(duì)飲用水中隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲檢測(cè)回收率的影響

楊紅力 李洋

（北京中職安康科技有限公司環(huán)境實(shí)驗(yàn)室 北京 101399）

隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲（簡(jiǎn)稱“兩蟲”）是一類寄生于人和動(dòng)物體內(nèi)的腸道原蟲，是一類致病性原生寄生蟲［1］，主要通過(guò)飲用水和食物等途徑傳播［2］。人類飲用了含有這些原蟲孢囊或卵囊的飲用水，有可能造成嚴(yán)重的腸胃疾?。?-3］，且無(wú)特殊臨床癥狀，無(wú)預(yù)防疫苗，絕大多數(shù)抗生素?zé)o效，治療依賴于人體自身的抵抗力［1，4］，嚴(yán)重影響公眾的健康生活。美國(guó)早在1996 年就將“兩蟲”感染分別列入國(guó)家必須申報(bào)的傳染病名單，并給出相應(yīng)的檢測(cè)方法［3-5］。我國(guó)在2006 年頒布的《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 5749-2006）中，也新增加了“兩蟲”的檢測(cè)指標(biāo)，并推薦了檢測(cè)方法［6-7］。

目前，檢測(cè)飲用水中的“兩蟲”主要采用免疫磁分離（IMS，Immunomagnetic Separation）技術(shù)，由美國(guó)環(huán)?？偩郑║SEPA）發(fā)布推薦使用，是目前國(guó)際上最為常用的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，即利用標(biāo)記有與“兩蟲”孢囊和卵囊表面抗原特異性結(jié)合的抗體的磁珠與卵囊和孢囊相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)“兩蟲”與雜質(zhì)分離［8-9］。在檢測(cè)過(guò)程中，有一個(gè)非常重要的質(zhì)控指標(biāo)——回收率［10-12］，即定量的“兩蟲”孢囊和卵囊在經(jīng)過(guò)整個(gè)檢測(cè)流程后能夠回收的孢囊和卵囊所占的百分率?；厥章实母叩褪桥袛鄼z測(cè)結(jié)果是否可信的重要指標(biāo)，是水中“兩蟲”檢測(cè)過(guò)程中主要的質(zhì)控手段［13］。已有的研究表明，回收率的損耗主要在樣品的前處理階段［7，12-14］。水樣的前處理包括定量抽濾、洗脫淘洗、離心濃縮、免疫磁分離等過(guò)程，不同的前處理階段對(duì)回收率的影響有所差異［14］。以往的研究只是在整體上提出回收率主要損失在前處理階段，如水質(zhì)雜質(zhì)、顆粒物、渾濁度、水溫等［15-17］，或者在分子層面另辟蹊徑［18］，并沒有對(duì)前處理具體階段的損失程度進(jìn)行定量評(píng)估。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在各前處理階段定量加標(biāo)，分析回收率在不同前處理階段對(duì)的損耗程度及所占比例，并提出“損失率”的概念，進(jìn)而對(duì)回收率在各處理階段的損耗進(jìn)行定量化分析，以期為優(yōu)化前處理過(guò)程、提高實(shí)驗(yàn)質(zhì)量和檢測(cè)結(jié)果可信度提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器和設(shè)備

蠕動(dòng)泵（Easyload 美國(guó)Masterflex）；Filta-Max Xpress快速淘洗裝置（美國(guó)IDEXX）；離心機(jī)（DDSM 湘儀）；樣品混旋器（Dynabeads MX Mixer 美國(guó)invitrogen）；磁極（MPC-1/MPC-S 挪威Dynal）；熒光顯微鏡（BX53日本Olympus）。

1.2 試劑和耗材

免疫磁分離試劑盒（Dynabeads GC-Combo 挪威Dynal）；免疫熒光染色試劑盒（EasyStain 澳大利亞BTF）；質(zhì)控標(biāo)樣（澳大利亞BTF）；NaOH 溶液（1.0mol/L）；HCl 溶液（0.1mol/L）；PETT 淘洗緩沖液（現(xiàn)用現(xiàn)配）；磷酸鹽緩沖液（現(xiàn)用現(xiàn)配）；DAPI 溶液（德國(guó)Sigma）；Filta-Max Xpress濾器（美國(guó)IDEXX）；錐形離心管（500mL）；L型試管（10mL）。

1.3 加標(biāo)微生物

“兩蟲”標(biāo)樣由澳大利亞Easyseed 提供，單次加標(biāo)一劑，含有賈第鞭毛蟲孢囊（100±1.7）個(gè)、隱孢子蟲卵囊（100±1.6）個(gè)。

1.4 實(shí)驗(yàn)水樣

樣品來(lái)源：實(shí)驗(yàn)室超純水（20L）。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)前處理方法采用目前《生活飲用水檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)微生物指標(biāo)》（GB/T 5750.12-2006）推薦的Filta-Max Xpress快速法，分析步驟如下。

（1）抽濾：蠕動(dòng)泵抽濾水樣，流速3L/min，樣品量20L。

（2）淘洗：將壓力淘洗裝置準(zhǔn)備就緒，緩沖液槽中加入足量淘洗緩沖液，將緩沖液槽與淘洗裝置連接完畢，啟動(dòng)Filta-Max Xpress 快速淘洗裝置，開始自動(dòng)淘洗，取得淘洗液約450mL。

（3）離心：將取得的淘洗液放入低速離心機(jī)，2000G離心力離心15min，自然減速，虹吸法棄上清液，留取沉淀物約10mL，以超細(xì)玻璃吸管反復(fù)多次轉(zhuǎn)移沉淀物至L型試管。

（4）免疫磁分離：在L 型試管中加入bufferA、bufferB、“兩蟲”特異性磁珠抗體，旋轉(zhuǎn)結(jié)合至少1h，后以MPC-1 磁極收集磁珠，鹽酸酸化，以MPC-S 磁極分離磁珠與樣品；染色計(jì)數(shù)，EasyStain 試劑盒染色、DAPI溶液染色，封片，于熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

為了定量分析前處理具體階段的損失程度，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)處理。

實(shí)驗(yàn)1：全程序?qū)嶒?yàn)，20L實(shí)驗(yàn)室超純水加標(biāo)一劑，經(jīng)過(guò)整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟，得出回收率，算出損失率，重復(fù)3次，空白對(duì)照1次。

實(shí)驗(yàn)2：去除抽濾富集步驟，直接在濾芯中加標(biāo)一劑，繼續(xù)剩余步驟，得出回收率，算出損失率，重復(fù)3次，空白對(duì)照1次。

實(shí)驗(yàn)3：去除抽濾和洗脫步驟，直接在錐形離心管中加標(biāo)一劑，繼續(xù)剩余步驟，得出回收率，算出損失率，重復(fù)3次，空白對(duì)照1次。

實(shí)驗(yàn)4：去除抽濾、洗脫、離心步驟，直接在L 型試管中加標(biāo)一劑，繼續(xù)剩余步驟，得出回收率，算出損失率，重復(fù)3次，空白對(duì)照1次。

實(shí)驗(yàn)5：直接一劑標(biāo)樣直接滴入載玻片內(nèi)，染色鏡檢，得出回收率，算出損失率，重復(fù)3 次，空白對(duì)照2次。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用濾芯、載玻片均為一次性使用，使用錐形離心管和L 型試管為高壓滅菌后使用。

2 結(jié)果

2.1 不同實(shí)驗(yàn)處理所得回收率檢測(cè)結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)均做3次平行及空白，結(jié)果見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)各階段“兩蟲”回收率結(jié)果

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)5 的回收率在所有處理中最高，達(dá)96.7%，其影響主要發(fā)生在染色鏡檢階段；而實(shí)驗(yàn)4 的回收率為92.3%，其對(duì)應(yīng)影響是免疫磁分離（IMS）階段和染色鏡檢階段，計(jì)算得知，此兩步處理對(duì)回收率的影響較小，在5%以下；將實(shí)驗(yàn)4 與實(shí)驗(yàn)1 對(duì)比，即去除抽濾、洗脫、離心之后，可知，其回收率為69.3%，由超過(guò)30%的“兩蟲”孢囊和卵囊損失于這3個(gè)階段。

2.2 不同實(shí)驗(yàn)處理所得損失率檢測(cè)結(jié)果

為了更好地觀察各處理階段對(duì)隱孢子蟲卵囊和賈第鞭毛蟲孢囊回收的影響，本實(shí)驗(yàn)提出了一個(gè)新的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)——損失率，即不計(jì)實(shí)驗(yàn)偶然誤差及過(guò)程偏差、以理想實(shí)驗(yàn)條件下的回收率100%，減去實(shí)際的回收率，得出損失率，以“兩蟲”實(shí)驗(yàn)損失率表示。

在已知回收率的基礎(chǔ)上，測(cè)得各實(shí)驗(yàn)處理的“兩蟲”損失率，結(jié)果見表2、表3。

表2 實(shí)驗(yàn)各階段“兩蟲”實(shí)驗(yàn)損失率結(jié)果

表3 實(shí)驗(yàn)各階段“兩蟲”實(shí)驗(yàn)損失率所占比例

由結(jié)果可知，無(wú)論是隱孢子蟲還是賈第鞭毛蟲，實(shí)驗(yàn)損失率均集中在抽濾、洗脫、離心階段，其中洗脫階段最高，分別為30.7%、24.7%，其次是離心階段，分別為23.0%、22.3%，然后是抽濾階段，分別為17.0%、14.0%，所占比例見圖1。

分析得出，實(shí)驗(yàn)各處理階段對(duì)飲用水中“兩蟲”回收率的影響各不相同，其中洗脫處理階段的影響最大所占比例最高。損失率主要集中在洗脫、離心、抽濾階段。具體來(lái)講，隱孢子蟲在各處理階段的損失率依次為：30.7%（洗脫淘洗）；23.0%（離心濃縮）；17.0%（定量抽濾）；4.3%（免疫磁分離）；3.3%（染色鏡檢）。賈第鞭毛蟲的損失率依次為：24.7%（洗脫淘洗）；22.3%（離心濃縮）；14.0%（定量抽濾）；3.0%（免疫磁分離）；2.3%（染色鏡檢）。

3 討論

結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)“兩蟲”時(shí)，為了提高實(shí)驗(yàn)質(zhì)量和檢測(cè)結(jié)果可信度，必須優(yōu)化前處理過(guò)程，嚴(yán)格把控洗脫、離心、抽濾3個(gè)前處理階段的質(zhì)量。洗脫階段的損失率最高，表明大部分的隱孢子蟲孢囊和賈第鞭毛蟲卵囊洗脫環(huán)節(jié)被遺漏或者未被洗脫出來(lái)，洗脫階段將是至關(guān)重要的一環(huán)。這就要求在洗脫液的配制、振蕩頻率的設(shè)置、振蕩時(shí)間的控制、振蕩方式的優(yōu)化等方面做深入研究，如超聲波洗脫。離心階段的損失，主要在轉(zhuǎn)移過(guò)程，一般實(shí)驗(yàn)室常用的轉(zhuǎn)移手段是虹吸法，操作不當(dāng)輕則攪動(dòng)“兩蟲”沉淀物，重則將沉淀物吸出，對(duì)檢測(cè)結(jié)果及質(zhì)量有很大影響，可以在離心時(shí)間、離心動(dòng)力、離心管的設(shè)計(jì)及超細(xì)虹吸設(shè)備等做深入研究。抽濾階段的損失率主要原因涉及抽濾量、抽濾速率、抽濾方式的不同等，可以在改變抽濾量、優(yōu)化抽濾速率等方面作有益嘗試，從而降低“兩蟲”檢測(cè)損失率，提高實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。